寡糖的生產(chǎn)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體設(shè)及用于寡糖或多糖的生產(chǎn)的方法，如，例如，經(jīng)由微生物發(fā)酵的寡糖 或多糖的生產(chǎn)，W及尤其設(shè)及水解酶在運(yùn)類方法中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 寡糖的商業(yè)化生產(chǎn)，連同新穎的生物制造技術(shù)開發(fā)一起在過去的多年來已變得越 來越令人感興趣。如今，使用寡糖，例如作為功能性食品組分、營養(yǎng)添加劑或作為營養(yǎng)品（營 養(yǎng)保健品，nutraceuticals)。傳統(tǒng)上，寡糖被定義為2個(gè)或更多（通常多達(dá)10個(gè))單糖的聚合 物，然而，此外多達(dá)20至25個(gè)單糖的聚合物經(jīng)常與它們同化(混用，assimilate)。尤其是，前 生物寡糖（前生命寡糖，prebiotic oligosaccharide)是高度令人感興趣的，因?yàn)樗鼈儽硎?非離齒性的(noncariogenic)和不易消化的化合物，其刺激人體胃腸道微生物區(qū)系(微生物 群落，microflora)的生長(zhǎng)和發(fā)育。
[0003] 目前，寡糖通過化學(xué)糖基化和使用糖基轉(zhuǎn)移酶從頭合成進(jìn)行合成，或者它們可W 衍生自多糖的化學(xué)降解、物理降解或生物降解。
[0004] 今天，合成或分離自植物多糖的低聚果糖（果寡糖，果聚糖， 打11(：1：0〇11旨03日(3油日1'1(1日）和低聚半乳糖（半乳糖寡糖，旨日1日(31：0〇11旨03日(3油日1'1(1日）代表最豐 富生產(chǎn)的寡糖。然而，由于優(yōu)越的健康益處，對(duì)人乳寡糖化MO)作為營養(yǎng)品的興趣在過去的 多年來已強(qiáng)烈地增加。公認(rèn)的是，HMO有助于人體針對(duì)人病原體的防御機(jī)制，特定的腸道菌 群(微生物群系，microbiome)的確立，W及免疫系統(tǒng)的出生后刺激。雖然HMO是由嬰兒食用， 但已被人們接受的是，在出生后期間中觀察到的運(yùn)些寡糖的有益效果在W后的生活中也可 W發(fā)現(xiàn)。
[0005] 已經(jīng)長(zhǎng)期已知的是人母乳，除乳糖之外，還包含稱作人乳寡糖(歷0)的寡糖的復(fù)雜 混合物，其表示相對(duì)于成分和數(shù)量而言的獨(dú)特的寡糖復(fù)雜混合物。今天，多于80種HMO化合 物已在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行表征，并且除了少數(shù)例外，它們是通過在還原端處的乳糖部分來表征并 且經(jīng)常在非還原端含有巖藻糖和/或唾液酸。通常，由其衍生歷0的單糖是D-葡萄糖、D-半乳 糖、N-乙酷基葡糖胺巖藻糖和唾液酸。
[0006] 最著名的寡糖是2 巖藻糖基乳糖和3 巖藻糖基乳糖，它們一起可W貢獻(xiàn)多達(dá)總 的HMO部分的1/3。在人乳中存在的另外的著名的HMO是乳-N-四糖、乳-N-新四糖 (neotetraose)和乳-N-巖藻糖五糖（fucopen化ose)。除運(yùn)些中性寡糖之外，在人乳中還可 W發(fā)現(xiàn)酸性HM0,如，例如3 唾液酸乳糖(唾液乳糖，SialyIlactose)、6 唾液酸乳糖和3-巖藻糖基-3'-唾液酸乳糖、二唾液酸-乳-N-四糖等。運(yùn)些結(jié)構(gòu)與上皮細(xì)胞表面糖復(fù)合物的 表位，路易斯化ewis)組織血型抗原，如路易斯X(LeX)密切相關(guān)，并且HMO與上皮表位的結(jié)構(gòu) 同源性導(dǎo)致針對(duì)抗細(xì)菌病原體的保護(hù)特性。
[0007] 除提到的在腸道中的局部效應(yīng)之外，麗0還表現(xiàn)出通過進(jìn)入全身循環(huán)（體循環(huán)， systemic circulation)在嬰兒中引發(fā)全身效應(yīng)。此外，HMO對(duì)蛋白-碳水化合物相互作用的 影響，例如，選擇素-白細(xì)胞結(jié)合，可W調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并且降低炎癥反應(yīng)。
[0008] 由于前生物寡糖(尤其是麗0)的充分研究的有益的特性，連同它們的有限的可獲 得性，有效的商業(yè)生產(chǎn)，即大規(guī)模生產(chǎn)是非常需要的。
[0009] 然而，如今的主要缺點(diǎn)，在大多數(shù)情況下是缺乏有效的寡糖生產(chǎn)。如上所述，借助 于利用酶工程或化學(xué)工程的合成，或多糖解聚作用(利用物理、化學(xué)或酶方法），寡糖可W產(chǎn) 生自低聚物工程。
[0010] 由于具有類似的化學(xué)反應(yīng)性的若干徑基的存在，寡糖的化學(xué)合成已被證明是具有 挑戰(zhàn)性的。因此，在寡糖的化學(xué)合成中，糖結(jié)構(gòu)單元必須首先加W選擇性地保護(hù)W控制化學(xué) 類似基團(tuán)的反應(yīng)性，然后偶聯(lián)，并且最后脫保護(hù)(去保護(hù)，de-protect)，W獲得期望的寡糖。 即使期望的寡糖的小規(guī)模合成是可能的，但開發(fā)合成途徑通常是費(fèi)時(shí)的、技術(shù)上具有挑戰(zhàn) 性并且經(jīng)常是極其昂貴的。酶促合成或化學(xué)和酶促合成的組合提供相對(duì)于純化學(xué)合成途徑 的顯著的優(yōu)點(diǎn)。通過酶促合成，已獲得若干人乳寡糖，如2'-巖藻糖基乳糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖或3'-唾液酸乳糖。除酶促合成之外，通向寡糖的發(fā)酵途徑也證明是成功的，并且 已經(jīng)可W做到通過發(fā)酵方式，W相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量提供寡糖(包括HM0)。
[0011] 另外，如前面提到的，借助于寡糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)或生化合成，運(yùn)比例如合成其它生物 聚合物，如膚和核酸更加困難，經(jīng)常產(chǎn)生寡糖混合物，該寡糖混合物含有非期望的寡糖，運(yùn) 些非期望的寡糖需要從期望的寡糖中分離或除去。運(yùn)也同樣適用于經(jīng)由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的 寡糖，因?yàn)樵谀切┻^程中，在反應(yīng)混合物/細(xì)胞培養(yǎng)基(含有待發(fā)酵的微生物）中將發(fā)現(xiàn)高含 量的副產(chǎn)物、中間產(chǎn)物或甚至起始底物。
[0012] 針對(duì)該背景，非常需要用于生產(chǎn)期望的寡糖，尤其是麗0的有效的方法和過程，其 中上述有效的生產(chǎn)具有較高的醫(yī)療相關(guān)性W及商業(yè)影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 通過本發(fā)明，經(jīng)由在從混合物中純化所產(chǎn)生的期望的寡糖中使用一種或多種掛糖 巧酶，用于降解非期望的寡糖或代謝產(chǎn)物或未使用的底物，此目的和其它的目的已經(jīng)解決， 該混合物含有產(chǎn)生的期望的寡糖W及，在適用情況下，非期望的寡糖或代謝糖類產(chǎn)物(在所 述期望的寡糖的生產(chǎn)中所產(chǎn)生），和/或在所述寡糖的生產(chǎn)中使用的未使用的糖底物。
[0014] 通過利用宿主微生物生產(chǎn)寡糖的方法來進(jìn)一步解決上述目的，其中該寡糖并不天 然存在于所述宿主細(xì)胞中，上述方法包括W下步驟:a)在容許生產(chǎn)所述寡糖的條件下和培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)適用于生產(chǎn)期望的寡糖的宿主微生物，借此生產(chǎn)寡糖W及，在適用情況下，生 產(chǎn)生物合成中間體和/或副產(chǎn)物;b)使用培養(yǎng)宿主微生物的培養(yǎng)基中的糖巧酶，W降解生物 合成糖中間體和/或糖副產(chǎn)物和/或未使用的糖底物；W及C)回收期望的寡糖。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，在用于生產(chǎn)寡糖的過程中使用糖巧酶，其中糖巧酶用于降解和/或阻 礙在期望的寡糖的生產(chǎn)中所產(chǎn)生的不期望的副產(chǎn)物、未使用的起始底物和中間產(chǎn)物；因此， 根據(jù)本發(fā)明，糖巧酶用于從含有期望的寡糖和其它不需要的碳水化合物部分的混合物中純 化期望的寡糖。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明，糖巧酶可W用于生產(chǎn)期望的寡糖的發(fā)酵過程W及用于純化或分離通 過體外寡糖合成反應(yīng)或通過化學(xué)合成或它們的組合所獲得的寡糖混合物。
[0017] 借助于糖巧酶，可W實(shí)現(xiàn)的是，例如除期望的寡糖之外的其它(寡)糖可W進(jìn)行代 謝，上述其它(寡)糖是在期望的寡糖的合成過程中在微生物中所產(chǎn)生的，并且上述其它寡 糖干擾期望的寡糖的純化步驟。
[0018] 到目前為止尚未描述糖巧酶在用于生產(chǎn)期望的寡糖的過程中的用途。與此相反， 在目前應(yīng)用的方法（即用于歷0的發(fā)酵）中，通過添加乳糖作為用于合成的底物。為了防止添 加的乳糖的降解，在發(fā)酵菌株中強(qiáng)烈避免e-半乳糖巧酶W及其它糖巧酶的反應(yīng)。因此，在發(fā) 酵中使用e-半乳糖巧酶缺陷型菌株（參見，例如Dumon et al.，（ 20 04 ) Biotechnol. Prog. 20,412-419)或菌株的(6-半乳糖巧酶基因已經(jīng)特異性純化（沉默， inactivate) (Dumon et al(2006)化emBio化em. 7,359-365))。一般地，任何糖巧酶活性 的存在被視為反作用(反生產(chǎn)，contra productive)于寡糖的發(fā)酵。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明，"寡糖"應(yīng)理解為是單糖的短的聚合物，其包含至少2個(gè)糖亞基，如在 開始時(shí)已經(jīng)提到的。寡糖可W是支鏈或形成亞基的直鏈。此外，寡糖的糖亞基可W具有許多 化學(xué)修飾。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡糖可W包含一個(gè)或多個(gè)非糖部分。
[0020] 此外，目前和一般地，在相關(guān)領(lǐng)域中，"糖巧酶"，還被稱為"糖巧水解酶"或"糖基水 解酶"，催化糖巧鍵的水解W釋放較小糖。它們可W分類為催化0-糖巧或S-糖巧水解的酶， W及它們通常W它們所作用的底物加W命名。因此，葡糖巧酶催化糖巧的水解W及木聚糖 酶催化木聚糖的裂解。因此，根據(jù)本發(fā)明的糖巧酶催化糖巧鍵的水解W釋放具有比天然簡(jiǎn) 單的碳水化合物底物W及復(fù)雜的碳水化合物底物更低分子量的單糖和寡糖。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，在本文中公開的應(yīng)用和方法中，糖巧酶用來降解和/或阻礙在期望的 寡糖的生產(chǎn)中所產(chǎn)生的不期望的副產(chǎn)物、未使用的起始底物和中間產(chǎn)物，相比于在不期望 的副產(chǎn)物、未使用的起始底物和中間產(chǎn)物的降解過程中通過糖巧酶的作用所釋放的單糖和 寡糖或二糖，上述不期望的副產(chǎn)物、未使用的起始底物和中間產(chǎn)物通常具有更高的分子量。
[0022] 因此，目前，"釋放的單糖"應(yīng)理解為在糖巧酶介導(dǎo)的碳水化合物底物的糖巧鍵的 水解中已產(chǎn)生的單糖，其中形成具有比水解的碳水化合物底物更低分子量的單糖和寡糖。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，至少一種糖巧酶，或兩種或更多種的組合可W用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng) 用和方法。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，糖巧酶用于微生物發(fā)酵過程，該過程用于生產(chǎn)期望的寡 糖并使用宿主微生物，其中，相對(duì)于所述宿主細(xì)胞，所述寡糖和/或所述糖巧酶并不天然存 在于微生物中。
[0025] 在相關(guān)領(lǐng)域中目前和通常所理解的，"微生物發(fā)酵"應(yīng)理解為(一般大規(guī)模)工業(yè)代 謝方法，其中在微生物，如細(xì)菌、真菌和霉菌的培養(yǎng)期間，發(fā)生營養(yǎng)物，特別是碳水化合物的 酶分