一株高地芽孢桿菌菌劑的制備及應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于防治桃采后真菌病害的拮抗菌及由該菌株制備的微生物菌劑。本發(fā)明提供了一株保藏號為CGMCC No.12180的高地芽孢桿菌14b(Bacillus altitudinis)，以及高地芽孢桿菌14b制備得到的微生物菌劑發(fā)酵液和發(fā)酵濾液在防治桃采后真菌病害中的應用。本發(fā)明所公開的高地芽孢桿菌14b是在未施用化肥農(nóng)藥的肥城桃園中采集桃樹根際土壤分離獲得的，能有效的防治桃褐腐病、灰霉病、軟腐病及青霉病等多種真菌病害，是一種生防效果好、無污染、防治范圍廣、安全生態(tài)的生物防治潛力菌株，有廣闊的市場應用前景。CGMCC No.1218020160304
【專利說明】
一株高地芽孢桿菌菌劑的制備及應用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和生物防治領(lǐng)域中的一種高地芽孢桿菌及其制備的微生物菌 劑發(fā)酵液和發(fā)酵濾液，特別是涉及其在防治桃采后病害中的應用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 桃是重要的核果類果樹，在我國分布范圍廣，栽種面積大。隨著栽培面積、產(chǎn)量的 逐年提升，由桃褐腐菌(Monilinia fructicola)引起的褐腐病、由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病、由葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起的軟腐病和由擴展青霉 (PeniciIlium expansum)引起的青霉病等引起的問題日益突出，嚴重影響了桃的運與加 工。國內(nèi)外的科研工作者都在致力尋找替代或降低化學防腐的新方法。但是，目前的防治手 段主要以化學防治為主，嚴重影響了人類的健康，并造成了環(huán)境污染。因此，以高效、低毒、 低殘留的環(huán)境友好型生物農(nóng)藥逐步替代傳統(tǒng)的高毒化學農(nóng)藥便成為新型農(nóng)藥研發(fā)的必然 趨勢。作為生物防治的一種，拮抗菌一般不會對環(huán)境及果品造成污染，不僅安全性較高，而 且成本相對較低，對人和牲畜相對安全。
[0003] 高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)在防治桃采后病害上鮮有報道。其具有營 養(yǎng)簡單，在自然界中存在廣泛，繁殖速度快、抗逆性強等特點，具有作為優(yōu)勢生防菌株的潛 力。以其生物活體及其代謝物制備微生物菌劑，成本較低，防效高，為開發(fā)新型桃采后真菌 病害生防產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種對桃采后多種真菌病害具有顯著生物防治效果的高地 芽孢桿菌14b(B.altitudinis)和由該菌株發(fā)酵制成的微生物菌劑發(fā)酵液和發(fā)酵濾液，用于 控制多種常見的桃采后病害，具有安全高效、操作簡便、可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)點。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0006] 本發(fā)明采用稀釋分離法和平板對峙法在未施用化肥農(nóng)藥的桃園中采集桃樹根際 土壤分離篩選獲得一種能夠用于防治桃采后病害的拮抗菌株14b，經(jīng)過菌種鑒定后，對16S rDNA序列在ncbi核糖體數(shù)據(jù)庫上比對，選擇親緣關(guān)系遠近不同的16S rDNA序列做系統(tǒng)發(fā)育 樹，14b被鑒定為高地芽孢桿菌，與Bacillus altitudinis DSM 21631T(AJ831842)有最高 的同源性，同源性達99%以上。該菌株于2016年03月04日在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心進行了檢測和保藏，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏 號為CGMCC No. 12180,建議分類命名為高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)。
[0007] 微生物菌劑的制備方法：
[0008] 1)活化菌株:將保存好的高地芽孢桿菌14b劃線轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱40 °C恒 溫保濕培養(yǎng)24h;
[0009] 2)制備種子液:挑取NA培養(yǎng)基上生長良好的拮抗菌株高地芽孢桿菌14b單菌落接 種到NB液體培養(yǎng)基中，40 °C下振蕩培養(yǎng)48h，振蕩頻率130~180r/min;
[0010] 3)制備發(fā)酵液:按體積比以3%的接種量將步驟2)中制備的菌株14b種子液接種于 NB液體培養(yǎng)液中，裝料量為50-100mL/250mL，培養(yǎng)基初始pH值為7、發(fā)酵溫度為40°C、振蕩頻 率為130~180r/min、發(fā)酵時間為48h制得14b發(fā)酵液，經(jīng)鏡檢計數(shù)，菌液濃度大于2.5 X 1010cfu/mL；
[0011] 4)制備發(fā)酵液濾液：將步驟3)制備得到的14b發(fā)酵液在8000r/min下離心10~ 20min，取上清，通過D = 0.22wii的微孔濾膜過濾得到發(fā)酵濾液原液，用無菌水將該發(fā)酵濾液 原液稀釋至20-100倍制得14b發(fā)酵濾液。
[0012]本發(fā)明提供的菌株14b搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/ L，初始pH = 7。為保護發(fā)酵液中活菌數(shù)，降低紫外線對其產(chǎn)生的殺傷作用，延長液體制劑貯 藏期，使液體制劑均勻、稀釋，可考慮在液體制劑中加入紫外防護劑、防腐劑、表面活性劑等 助劑。
[0013]利用上述微生物菌劑進行了離體和果實試驗，均得到了良好的效果。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 本發(fā)明提供的高地芽孢桿菌14b對桃褐腐病、灰霉病、軟腐病及青霉病等多種真菌 病害具有顯著的防治效果，以高地芽孢桿菌14b制備發(fā)酵液、發(fā)酵濾液等微生物菌劑，防治 效果穩(wěn)定，對環(huán)境友好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低廉，具有很高的應用價值 和廣闊的市場前景。 (四）
【附圖說明】
[0016] 圖1是基于菌株14b的16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0017]圖2為菌株14b發(fā)酵濾液對桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉菌絲生長的影響(AB為 桃褐腐菌、CD為灰葡萄孢菌、EF為匍枝根霉，其中ACE為CK、BDF為發(fā)酵濾液處理）。
[0018] 圖3為肥城白里桃接種桃褐腐菌不同處理方式對病斑擴展的抑制作用(A:CK、B為 菌株14b發(fā)酵液處理、C為發(fā)酵濾液稀釋50倍處理）。
[0019] 圖4為肥城白里桃接種擴展青霉不同處理方式對病斑擴展的抑制作用(A:CK、B為 菌株14b發(fā)酵液處理、C為發(fā)酵濾液稀釋50倍處理）。 (五)
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖表和【具體實施方式】來對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領(lǐng)域的技 術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。
[0021 ]實施例一:高地芽孢桿菌14b的分離篩選
[0022] 在未施用化肥農(nóng)藥的桃園中采集桃樹根際土壤，采用稀釋分離法，做好1(^、10一2、 10一3和10-4的土壤稀釋液，用移液槍分別吸取10- 2、10-3和10-4的土壤稀釋液O.lmL加到NA培 養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂勻，標明編號，放置一小時后將培養(yǎng)皿反轉(zhuǎn)，于37°C中培養(yǎng)。從 培養(yǎng)的第二天起，根據(jù)菌落形態(tài)等特點挑選細菌單菌落，分別移接到NA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48h 后用于后續(xù)試驗。經(jīng)純化的菌株于NA斜面培養(yǎng)基上，4°C保存。
[0023] 采用平板對峙法篩選拮抗菌。在PDA平板的中央接種病原菌菌餅（8mm打孔器打 ?。?，以病原菌菌餅為中心，劃十字，在十字交叉線的四端、距離平板1.5cm處，接種同一種分 離出的細菌，每個處理3皿。室溫下培養(yǎng)96h，以不接種細菌的病原菌培養(yǎng)皿為對照，測定平 均抑菌率。篩選出對桃病原菌的抑制效果最強的菌株，命名為14b，經(jīng)過菌種鑒定后，對16S rDNA序列在ncbi核糖體數(shù)據(jù)庫上比對，選擇親緣關(guān)系遠近不同的16S rDNA序列做系統(tǒng)發(fā)育 樹，14b被鑒定為高地芽孢桿菌，與Bacillus altitudinis DSM 21631T(AJ831842)有最高 的同源性，同源性達99 %以上。
[0024] 實施例2:微生物菌劑的制備
[0025] 用于防治桃采后真菌病害的微生物菌劑包括高地芽孢桿菌14b的發(fā)酵液和發(fā)酵濾 液，制備步驟如下：
[0026] 1)活化菌株:將保存好的高地芽孢桿菌14b劃線轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱40 °C恒 溫保濕培養(yǎng)24h;
[0027] 2)制備種子液:挑取NA培養(yǎng)基上生長良好的拮抗菌株高地芽孢桿菌14b單菌落接 種到NB液體培養(yǎng)基中，40 °C下振蕩培養(yǎng)48h，振蕩頻率130~180r/min;
[0028] 3)制備發(fā)酵液:按體積比以3%的接種量將步驟2)中制備的菌株14b種子液接種于 NB液體培養(yǎng)液中，裝料量為50-100mL/250mL，培養(yǎng)基初始pH值為7、發(fā)酵溫度為40°C、振蕩頻 率為130-180r/min、發(fā)酵時間為48h制得14b發(fā)酵液，經(jīng)鏡檢計數(shù)，菌液濃度大于2.5X 1010cfu/mL；
[0029] 4)制備發(fā)酵液濾液：將步驟3)制備得到的14b發(fā)酵液在8000r/min下離心10~ 20min，取上清，通過D = 0.22wii的微孔濾膜過濾得到發(fā)酵濾液原液，用無菌水將該發(fā)酵濾液 原液稀釋至20~100倍制得14b發(fā)酵濾液。
[0030]菌株14b搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基包括牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L，初始pH=7。 [0031 ]實施例3:微生物菌劑對病原菌菌絲生長的影響
[0032 ]微生物菌劑包括實施例2制備的高地芽孢桿菌14b的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液。
[0033] 采用濾紙片法測量菌株14b發(fā)酵液對菌絲生長的影響。在PDA平板中心分別接種桃 褐腐菌、灰葡萄孢菌、軟腐病菌、青霉病菌菌餅，無菌濾紙片（〇=8mm)蘸取生防菌發(fā)酵液后 對稱貼在距離病原菌菌餅2.5cm處，26 °C培養(yǎng)，3d后觀察并記錄病原菌生長直徑并計算抑制 率，詳情見表1。
[0034] 采用含濾液平板法測量發(fā)酵菌液對菌絲生長的影響。將發(fā)酵濾液與PDA培養(yǎng)基按 體積比1:9比例混合后，制成發(fā)酵濾液平板，對照組不加發(fā)酵濾液而加入等體積的無菌水， 在平板中心分別接種桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、軟腐病菌、青霉病菌，每個處理3個重復，26°C 培養(yǎng)，3d后觀察并記錄病原菌生長直徑并計算抑制率，詳情見表1。
[0035] 生長抑制率=(對照組菌絲直徑-處理組菌絲直徑)/對照組菌絲直徑X 100%
[0036]表1高地芽孢桿菌14b的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理對平板上菌絲生長的影響
[0038] 注:每一行的不同字母(a，b)表示同一品種桃果實處理和對照間在P〈0.05水平上 有顯著性差異。
[0039]由表1可見，濾紙片法測定菌株14b發(fā)酵液抑菌率在70.5%以上，抑菌效果顯著。含 濾液平板法測定濾液抑菌活性發(fā)現(xiàn)，菌株14b發(fā)酵濾液抑菌率在61 %以上，明顯抑制各種病 原菌的生長。結(jié)果說明，高地芽孢桿菌14b發(fā)酵液和發(fā)酵濾液均能顯著抑制桃病原菌的生 長。
[0040] 實施例4:高地芽孢桿菌14b發(fā)酵液對果實病斑擴展的影響
[0041] 取新鮮肥城白里桃，用高地芽孢桿菌14b發(fā)酵液浸泡15min(對照組用無菌水），室 溫下放置自然瞭干后在赤道處每果刺3_X3mm 1個傷口，再分別接種1 X 104cfu/mL的桃褐 腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉和擴展青霉的孢子懸浮液30此。將上述處理的果實于20土 TC 保濕貯藏，3天后測量病斑直徑，計算抑菌率，詳情見表2。每次每個處理20個果實，該試驗重 復二次。
[0042] 生長抑制率=(對照病斑直徑_處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0043] 實施例5:高地芽孢桿菌14b發(fā)酵濾液對果實病斑擴展的影響
[0044] 取新鮮肥城白里桃，用高地芽孢桿菌14b發(fā)酵濾液原液稀釋50倍得到的發(fā)酵濾液 浸泡15min(對照組用無菌水），室溫下放置自然晾干后在赤道處每果刺3_X3mm 1個傷口， 再分別接種1 X 104cfU/mL的桃褐腐菌、灰葡萄孢菌、匍枝根霉和擴展青霉的孢子懸浮液30y L。將上述處理的果實于20 ± 1°C保濕貯藏，3天后測量病斑直徑，計算抑菌率，詳情見表2。每 次每個處理20個果實，該試驗重復三次。
[0045] 生長抑制率=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑X 100%
[0046] 表2高地芽孢桿菌14b的發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理對果實上病斑擴展的影響
[0048] 注:每一行的不同字母(a，b)表示同一品種桃果實處理和對照間在P〈0.05水平上 有顯著性差異。
[0049] 由表2可見，經(jīng)菌株14b發(fā)酵液和發(fā)酵濾液處理過的桃果實的病斑直徑明顯小于對 照組，有較高的抑制率，說明高地芽孢桿菌14b微生物菌劑可抑制病斑擴展，有效延緩采后 病害的發(fā)生，減輕采后病害的侵染情況。
[0050] 綜上所述，本發(fā)明提供的高地芽孢桿菌14b微生物菌劑發(fā)酵液和發(fā)酵濾液對桃褐 腐病、灰霉病、軟腐病、青霉病等采后病害均有較強的拮抗作用，在該領(lǐng)域具有廣闊的應用 前景。
【主權(quán)項】
1. 一種高地芽孢桿菌14b，該高地芽孢桿菌于2016年3月4日在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏，保藏號為:CGMCC No. 12180。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高地芽孢桿菌14b制備的微生物菌劑，其特征在于，所述 的微生物菌劑包括其發(fā)酵液和發(fā)酵液濾液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于， 其制備步驟如下： 1) 活化菌株:將保存好的高地芽孢桿菌14b劃線轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱40°C恒溫保 濕培養(yǎng)24h; 2) 制備種子液:挑取ΝΑ培養(yǎng)基上生長良好的拮抗菌株高地芽孢桿菌14b單菌落接種到 NB液體培養(yǎng)基中，40 °C下振蕩培養(yǎng)48h，振蕩頻率130~180r/min; 3) 制備發(fā)酵液:按體積比以3 %的接種量將步驟2)中制備的菌株14b種子液接種于NB液 體培養(yǎng)液中，裝料量為50~100mL/250mL，培養(yǎng)基初始pH值為7、發(fā)酵溫度為40°C、振蕩頻率 為130-180r/min、發(fā)酵時間為48h制得14b發(fā)酵液，經(jīng)鏡檢計數(shù)，菌液濃度大于2.5X10 1()Cfu/ mL； 4) 制備發(fā)酵液濾液:將步驟3)制備得到的14b發(fā)酵液在8000r/min下離心10~20min，取 上清，通過D = 0.22μπι的微孔濾膜過濾得到發(fā)酵濾液原液，用無菌水將該發(fā)酵濾液原液稀釋 至20-100倍制得14b發(fā)酵濾液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3高地芽孢桿菌14b微生物菌劑，其特征在于，所述的微生物菌劑的搖 瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏3g/L、蛋白胨1 Og/L、NaCl 5g/L，初始pH=7。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高地芽孢桿菌14b微生物菌劑在防治桃采后真菌病害上 的應用，其特征在于，所述的真菌病害包括:桃褐腐病、灰霉病、軟腐病和青霉病。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高地芽孢桿菌14b微生物菌劑在防治桃采后真菌病害上 的應用，其特征在于，所述的桃品種為肥城白里桃。
【文檔編號】A01P3/00GK105820981SQ201610270554
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】石晶盈, 殷曉慧, 王慶國, 張暢, 彭勇, 張欣, 劉佩
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學