依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。Ni依賴性脲酶因Ni而存在安全隱患，為非食品酶，而Fe是人體含量的必需微量元素,對(duì)人體有益。本發(fā)明利用食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)成功NZ3900(pNZ8149)實(shí)現(xiàn)了Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的食品級(jí)高效表達(dá)，酸性脲酶酶活達(dá)到3.3U/mL，以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到了0.8U/mL，相對(duì)于原始菌株地衣芽孢桿菌，大大的提高了Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為食品級(jí)酸性脲酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
-種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脲酶(Urease，EC3.5.1.5 )，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等中，其能專一性的 催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功獲得的結(jié)晶態(tài)的酶，它 于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據(jù)脲酶作用的最適pH值，可將脲酶分為酸性脲 酶、中性脲酶和堿性脲酶。
[0003] 氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，簡稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性， 廣泛存在于多種發(fā)酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研 究證實(shí)發(fā)酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的主要前體物質(zhì)，它和乙醇自發(fā)的反應(yīng) 生成EC，從而嚴(yán)重影響人類的健康。酸性脲酶可以高效消除發(fā)酵食品（如酒精類飲料）中的 尿素，從而可以有效的減少了 EC的形成。
[0004] 但是，已報(bào)道的脲酶均為Ni2+依賴性脲酶，Ni2+作為重金屬，對(duì)人類的健康影響也 存在隱患。因此，嚴(yán)格來講，Ni 2+依賴性脲酶均為非食品酶，應(yīng)用于食品中時(shí)存在安全隱患。 而鐵是人體含量的必需微量元素，是血紅蛋白的重要部分，人全身都需要它，這種礦物質(zhì)可 以存在于向肌肉供給氧氣的紅細(xì)胞中，還是許多酶和免疫系統(tǒng)化合物的成分。鐵對(duì)人體的 功能表現(xiàn)在許多方面，鐵參與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存;促進(jìn)發(fā)育;增加對(duì)疾病的抵抗力；調(diào)節(jié)組織 呼吸，防止疲勞;構(gòu)成血紅素，預(yù)防和治療因缺鐵而引起的貧血;使皮膚恢復(fù)良好的血色。鑒 于鐵對(duì)人體有益的功能，可以添加到食品中，因此可以認(rèn)定Fe 3+依賴性脲酶為真正的食品 酶。
[0005] 因此，有必要尋找能夠真正用于食品的食品級(jí)Fe3+依賴性脲酶，并實(shí)現(xiàn)其在食品級(jí) 宿主中的高效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明利用乳酸菌食品級(jí)生產(chǎn)Fe3+依賴性食品級(jí)酸性脲酶，相 對(duì)于原始菌株地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis 9945A，大大的提高了Fe3+依賴性食 品級(jí)酸性脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為食品級(jí)酸性脲酶的的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了 一種構(gòu)建乳酸菌食品級(jí)高效表達(dá)Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，是從地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis 9945a)基因組上克隆獲得食品級(jí)雙功能酸性脲酶基因ureBL， 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌，構(gòu)建高效表達(dá)食品級(jí)雙功能酸性脲酶的食品級(jí)表達(dá)體系，高 效生產(chǎn)食品級(jí)酸性脲酶。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，所述 乳酸菌表達(dá)的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶含有以下特征之一：
[0008] (1)結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、 SEQIDNO.^/f*;
[0009] (2)結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失或者添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的 蛋白質(zhì)；
[0010] (3)具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶來源于Bacillus licheniformis 9945A。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述乳酸菌是將Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的基因 連接到表達(dá)質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到的。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)質(zhì)?？梢允且韵氯我庖环N：PNZ8149、 PNZ8148。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌可以是以下任意一種：乳酸乳球菌 NZ3900、乳酸乳球菌NZ9000。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌中，脲 酶的表達(dá)受Nisin啟動(dòng)子調(diào)控。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，具體 構(gòu)建方法如下：
[0017] 1)從地衣芽孢桿菌基因組上克隆獲得Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因簇ureBL (基 因信息已于專利CN201510218597.1中所陳述），目的基因通過Gibson重組的方法克隆到質(zhì) 粒 pNZ8149，得到重組質(zhì)粒 pNZ8149-ur eBL。
[0018] 2)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pNZ8149-ureBL電轉(zhuǎn)化于乳酸乳球菌NZ3900構(gòu)建產(chǎn)脲酶的重 組乳酸乳球菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)，F(xiàn)e3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶在重組乳酸乳球菌 NZ3900(pNZ8149-ureBL)中表達(dá)受Nisin啟動(dòng)子調(diào)控。
[0019]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，是以所 述乳酸菌作為生產(chǎn)菌株。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是在利用生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)酸性脲酶的過 程中添加Fe3+。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將生成菌株種子液接入GM17培養(yǎng)基中， 在溫度30°C，靜置培養(yǎng)至菌體OD600為0.4,然后加誘導(dǎo)劑Nisin(終濃度10ng/mL)及FeCl 3(終 濃度ImM)誘導(dǎo)表達(dá)。
[0022] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+的添加量為ImM。
[0023]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述乳酸菌在生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶方面的 應(yīng)用。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是利用其生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲 酶來降低或消除發(fā)酵食品中的尿素和/或氨基甲酸乙酯。
[0025] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品包括酒精類飲料、醬油。
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品為黃酒、白酒、葡萄酒等。
[0027] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述乳酸菌生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶在發(fā)酵 食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] 本發(fā)明利用食品級(jí)乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的 食品級(jí)高效表達(dá)，酸性脲酶酶活達(dá)到3.3U/mL，以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到了0.8U/mL，相對(duì)于原 始菌株地衣芽孢桿菌（即基因來源菌株Bacillus licheniformis 9945A)，大大的提高了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為食品級(jí)酸性脲酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。由于 目前的脲酶幾乎都是Ni依賴性脲酶，因Ni而存在安全隱患，為非食品酶，而Fe是人體含量的 必需微量元素對(duì)人體有益，所以本發(fā)明的Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶是能夠真正用于食品 的脲酶。
【附圖說明】
[0030] 圖1:食品級(jí)重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8149-ureBL構(gòu)建流程圖。
[0031]圖2:重組乳酸菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)后脲酸活力隨時(shí)間變 化曲線。
[0032] 圖3:重組乳酸菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)誘導(dǎo)表達(dá)8h時(shí)脲酶及氨基甲酸乙酯水解 酶活力。
【具體實(shí)施方式】 [0033] 材料與方法
[0034] GM17培養(yǎng)基:M17 37.25g/L，121°C滅菌15min后加入過濾除菌的終濃度為5g/L乳 糖。
[0035] El 1 iker固體培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉4g/L，乙酸鈉1 ? 5g/L， 維生素C 0.5g/L及15g/L的瓊脂粉。121°C滅菌15min后加入過濾除菌的終濃度為5g/L乳糖。 [0036] 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用超純水配制0 ? lmmol/L、0 ? 2mmol/L、0 ? 3mmol/L、 0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取lmL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于順 序編號(hào)的10mL比色管中。37°C下恒溫保溫30min，立即用吸lmL終止劑于比色管中，振蕩混 勻。再依次加入lmL顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容 至10mL，在625nm下比色測定0D值，以0D值為縱坐標(biāo)，NH 4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0037] 脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活測定方法:取兩支10mL比色管，分別加入lmL酶液 和lmL滅活的酶液。然后在兩管中分別加入lmL 3%尿素（用20mM pH 4.5的梓檬酸緩沖液配 制），在37°C恒溫水浴箱中反應(yīng)30min后，在兩管各加入lmL終止劑（10%三氯乙酸），混勻后 加入lmL的顯色劑I (15g苯酚和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL)和lmL顯色劑 II(13.125g NaOH和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱 中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10mL，625nm處比色，測定0D值，計(jì)算酶活(采用氯化銨 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
[0038]脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉 緩沖液及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成2mi〇1 NH4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。 [0039]氨基甲酸乙酯水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成lwnol NH4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0040] 實(shí)施例l:Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因ureBL克隆及PNZ8149質(zhì)粒PCR法線性化
[0041] l)Fe3 +依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因ureBL克?。喊凑占?xì)菌基因組提取試劑盒 (OMEGA)使用說明提取地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis 9945a)基因組DNA。根據(jù)專 利CN201510218597.1相關(guān)信息，設(shè)計(jì)正向引物BL-F及反向引物BL-R(序列分別如表1所示）。 以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，上述特異性引物為引物，對(duì)ureBL基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體 系：按照PrimerSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA)試劑盒說明書配制50yl反應(yīng)體系。擴(kuò)增 條件為：981€3〇8 1個(gè)循環(huán)，98°(：1〇8,541€58,721€5111111488,30個(gè)循環(huán)，72°(：1〇111111-個(gè)循 環(huán)。PCR產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收，回收約5.8kb的DNA片段，回收方法參 照膠回收試劑盒(TAKARA)說明書進(jìn)行。回收產(chǎn)物送上海生工生物公司測定核苷酸序列。 [0042] 2)pNZ8149質(zhì)粒PCR法線性化：按照Gibson重組原理及ureBL序列，設(shè)計(jì)線性化 PNZ8149所需要的引物8149-BL-F及8149-BL-R(序列分別如表1所示）。以pNZ8149為模板， 8149-BL-F及8149-BL-R為特異性引物，對(duì)pNZ8149基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：按照 PrimerSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA)試劑盒說明書配制50yl反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件為： 98°〇308 1個(gè)循環(huán)，98°(：108,541€58,721€2111111368,30個(gè)循環(huán)，72°(：10111111-個(gè)循環(huán)。？〇?產(chǎn) 物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收，回收約2.6kb的DNA片段，回收方法參照膠回收 試劑盒(TAKARA)說明書進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物送上海生工生物公司測定核苷酸序列。
[0043] 表1弓丨物
[0045] 實(shí)施例2:食品級(jí)重組工程菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)構(gòu)建
[0046] 1)按照Gibson組裝方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pNZ8149_ureBL) :Gibson反應(yīng)體系如 下：5XCE II buffer 4yl，Exnase II 2yl，ureBL 114ng，pNZ8149 104ng，ddH2〇 up to 20 y 1。37 °C 30min后立即置于冰水混合物中5min，取lOy 1用于電轉(zhuǎn)化NZ3900。
[0047] 2)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化后涂布于El 1 iker固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR鑒定，得到陽性 轉(zhuǎn)化子。成功獲得Fe3 +依賴型食品級(jí)酸性脲酶重組菌株乳酸乳球菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)〇
[0048]實(shí)施例3 :Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的食品級(jí)高效表達(dá) [0049]對(duì)成功構(gòu)建的重組乳酸乳球菌菌株NZ3900(pNZ8149-ureBL)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。 [0050]種子液制備:將實(shí)驗(yàn)菌株接種至GM17培養(yǎng)基中，50mL搖瓶中裝液5mL，溫度30°C，靜 置培養(yǎng)16h。
[00511搖瓶發(fā)酵:按2 %的接種量將培養(yǎng)好的種子接入GM17培養(yǎng)基中，50mL搖瓶中裝液 20mL，溫度30°C，靜置培養(yǎng)至菌體OD600為0.4,加誘導(dǎo)劑Nisin(終濃度10ng/mL)及FeCl3(終 濃度ImM)誘導(dǎo)表達(dá)8h。結(jié)果如圖2及3所示，誘導(dǎo)8h時(shí)脲酶活力達(dá)到最高，以尿素為底物時(shí)酶 活為3.3U/ml，以EC為底物時(shí)酶活為0.8U/ml。
[0052]此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加FeCl3,誘導(dǎo)表達(dá)后無脲酶活力。
[0053]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌表達(dá)的Fe 3+ 依賴型食品級(jí)酸性脲酶含有以下特征之一： (1) 結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過取代、缺失或者添加一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質(zhì)； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶來源于Bacillus licheniformis 9945A。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述 枯草芽孢桿菌是將Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的基因連接到表達(dá)質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒，然 后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到的。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述 表達(dá)質(zhì)?？梢允且韵氯我庖环NpNZ8149、pNZ8148。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述 宿主菌可以是以下任意一種:乳酸乳球菌NZ3900、乳酸乳球菌NZ9000。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，其特征在于，所述 表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的乳酸菌，具體構(gòu)建方法如下： 1) 從地衣芽孢桿菌基因組上克隆獲得Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因簇ureBL，目的基 因通過Gibson重組的方法克隆到質(zhì)粒pNZ8149,得到重組質(zhì)粒pNZ8149-ureBL; 2) 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pNZ8149-ureBL電轉(zhuǎn)化于乳酸乳球菌NZ3900構(gòu)建產(chǎn)脲酶的重組乳 酸乳球菌NZ3900(pNZ8149-ureBL)，F(xiàn)e 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶在重組乳酸乳球菌NZ3900 (pNZ8149-ureBL)中表達(dá)受Nisin啟動(dòng)子調(diào)控。7. -種生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，其特征在于，所述方法是以權(quán)利要求1-6任一所述的乳酸菌作為生產(chǎn)菌株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法是在利用生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)酸性 脲酶的過程中添加 Fe3+。9. 權(quán)利要求1-6任一所述乳酸菌在生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶方面的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是利用生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品級(jí) 酸性脲酶來降低或消除發(fā)酵食品中的尿素和/或氨基甲酸乙酯。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105820992SQ201610397531
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】康振, 陳堅(jiān), 堵國成, 劉慶濤
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)