用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及DNA組裝方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及DNA組裝方法，所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括如下組成部分：用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒；和第一向?qū)NA和/或用于表達(dá)所述第一向?qū)NA的質(zhì)粒，其中所述第一向?qū)NA具有CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合用于組裝的半合成染色體所攜帶的第一報(bào)告基因。本發(fā)明的CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有同源重組替換成功率高、需要設(shè)計(jì)和使用的向?qū)NA種類少、基因組序列受到的有害影響少、脫靶率低的優(yōu)勢(shì)。
【專利說明】
用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及DNA組裝方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及合成生物學(xué)領(lǐng)域的合成基因組技術(shù)，尤其涉及一種用于DNA組裝的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)及DNA組裝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CRISPR_Cas9是細(xì)菌和古生菌的自我防御系統(tǒng)，能夠通過單鏈RNA識(shí)別外來雙鏈 DNA，并借助Cas9核酸酶在其上產(chǎn)生雙鍵斷裂，消除外來DNA侵染。CRISPR-Cas9系統(tǒng)具有可 移植性，經(jīng)過改造后可以在包括釀酒酵母等真核生物在內(nèi)的細(xì)胞中行駛DNA識(shí)別和切除功 能，目前已被改造成優(yōu)秀的基因組編輯工具。相比于Zinc-Finger和TALE技術(shù)，CRISPR-Cas9 因其簡(jiǎn)單的DNA識(shí)別原理(利用RNA結(jié)合識(shí)別，而不像前兩者利用能夠結(jié)合DNA的蛋白）而成 為目前最熱門的研究領(lǐng)域之一。CRISPR-Cas9的一個(gè)研究方向是利用其識(shí)別特定DNA并在其 上產(chǎn)生雙鍵斷裂的特性，增強(qiáng)同源重組時(shí)外源DNA重組的效率。
[0003] 目前合成生物學(xué)領(lǐng)域的合成基因組需要多種DNA組裝技術(shù)的配合，才能使得合成 基因組能夠逐漸從oligo組裝起來，而這些技術(shù)中最重要的是基于同源重組的替換組裝（即 將合成片段替換在野生染色體上替換野生部分，逐漸形成合成染色體）。然而同源重組在自 然狀態(tài)下發(fā)生率很低，使得導(dǎo)致替換的成功率較低，正確克隆的篩選率往往不能達(dá)到實(shí)驗(yàn) 人員的要求。早在1997年 [1]和2011年[2]，Zinc-Finger和TALE就已經(jīng)用于產(chǎn)生雙鍵斷裂而增 加同源重組的效率，但是由于其自身的劣勢(shì)（如Zinc-Finger并不能對(duì)任意DNA進(jìn)行識(shí)別， Zinc-Finger和TALE制備和使用繁瑣等），往往使得實(shí)驗(yàn)人員消耗過多的資源在實(shí)驗(yàn)物料準(zhǔn) 備當(dāng)中。相比之下，CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列）能夠識(shí)別所有的DNA，物料制備、使用也很簡(jiǎn)單， 使其成為優(yōu)秀的替代品。
[0004] 但是，由于CRISPR系統(tǒng)僅靠很短的RNA(稱為guideRNA，簡(jiǎn)稱向?qū)NA、gRNA，由20bp 的RNA-DNA結(jié)合位點(diǎn)+3bp的PAM位點(diǎn)+RNA結(jié)構(gòu)臂組成，其中20bp的結(jié)合位點(diǎn)也稱為CRISPR位 點(diǎn))對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行識(shí)別，脫靶的情況較Zinc-Finger和TALE技術(shù)嚴(yán)重。因此，對(duì)CRISPR位點(diǎn) 進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，從而降低其脫靶效率是重中之重，目前已有多篇文獻(xiàn) [3]對(duì)CRISPR的脫靶 效應(yīng)進(jìn)行了研究，出現(xiàn)了多個(gè)CRISPR設(shè)計(jì)的工具[4<。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)的CRISPR相關(guān)的專利技術(shù)集中在基因敲除、構(gòu)建敲除文庫(kù)上，如"利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建真核基因敲除文庫(kù)的方法"（0附03668472六，2014.03.26)，還沒有利 用CRISPR技術(shù)增強(qiáng)同源重組率從而提高合成基因組組裝效率相關(guān)的專利技術(shù)報(bào)道。
[0006] 英美兩國(guó)的CRISPR相關(guān)的專利技術(shù)主要由MIT的張鋒申請(qǐng)，其專利對(duì)CRISPR系統(tǒng) 各子部件的散布、改造、優(yōu)化限制得比較緊，如DELIVERY,ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS,METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTIC APPLICATI0NS(US2014242699(A1)，2014-08-28)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)及DNA組裝方法，能夠提高通過 同源重組進(jìn)行DNA組裝時(shí)的同源重組率，滿足增加陽(yáng)性克隆率的要求。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種用于DNA組裝的CRISPR_Cas9系統(tǒng)，包括 如下組成部分：
[0009] 用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒;和
[0010] 第一向?qū)NA和/或用于表達(dá)所述第一向?qū)NA的質(zhì)粒，其中所述第一向?qū)NA具有 CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合用于組裝的半合成染色體所攜帶的 第一報(bào)告基因。
[0011] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)還包括如下組成部分：
[0012] 宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞攜帶所述半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染 色體序列和野生染色體序列以及二者之間的所述第一報(bào)告基因；
[0013] 待組裝片段，所述待組裝片段的一端有一段序列與所述合成染色體序列的靠近所 述第一報(bào)告基因的一段序列同源，另一端的內(nèi)側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所 述野生染色體序列同源。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)還包括如下組成部分：
[0015] 第二向?qū)NA和/或用于表達(dá)所述第二向?qū)NA的質(zhì)粒，其中所述第二向?qū)NA具有 CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第二報(bào)告基因。
[0016] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述第一報(bào)告基因和第二報(bào)告基因?yàn)榻湍钢械膱?bào)告基 因，優(yōu)選為L(zhǎng)EU2、URA3、HIS3、TRP1、MET17和LYS2中的兩種，更優(yōu)選為L(zhǎng)EU2和URA3。
[0017]優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因LEU2的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為：
[0018] GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQ ID N0：1)；
[0019] 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因URA3的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為：
[0020] GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQ ID N0：2)〇
[0021] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述待組裝片段為合成的基因組片段，所述CRISPR位點(diǎn) 在其對(duì)應(yīng)的報(bào)告基因的所有潛在位點(diǎn)中具有最高的可靠性分?jǐn)?shù)。
[0022] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述可靠性分?jǐn)?shù)通過如下公式(1)計(jì)算得到：
[0024] 其中，i表示所述基因組上的每個(gè)脫靶位點(diǎn)，Shit表示每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性 分?jǐn)?shù)，n〇ff表不脫革E位點(diǎn)總數(shù)，Sguide表不每個(gè)CRISPR位點(diǎn)的可靠性分?jǐn)?shù)；
[0025] 所述每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)Shit通過如下公式(2)計(jì)算得到：
[0027 ]其中，e表示所述CRISPR位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的脫靶位點(diǎn)的實(shí)際錯(cuò)配位置，M指理論錯(cuò)配位置的集 合，W[e]表示不同錯(cuò)配位置對(duì)脫靶的貢獻(xiàn)值，d表示錯(cuò)配位置兩兩之間的平均距離，n_表示錯(cuò)配位 置的總數(shù);其中，ff[e]按照錯(cuò)配位置順序，滿戥嚇:^t[='(==9=^
[0028]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種DNA組裝方法，所述方法包括：
[0029] 將用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒、用于表達(dá)第一向?qū)NA的質(zhì)粒以及待組裝片段轉(zhuǎn)入 宿主細(xì)胞內(nèi)，所述宿主細(xì)胞攜帶有半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染色體序列 和野生染色體序列以及二者之間的第一報(bào)告基因，所述第一向?qū)NA具有CRISPR位點(diǎn)，該 CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第一報(bào)告基因，所述待組裝片段的一端有一段 序列與所述合成染色體序列的靠近所述第一報(bào)告基因的一段序列同源，所述待組裝片段的 另一端的內(nèi)側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所述野生染色體序列同源；
[0030] 所述Cas9基因和所述第一向?qū)NA表達(dá)，產(chǎn)生Cas9核酸酶和所述第一向?qū)NA，以 使所述第一向?qū)NA結(jié)合到所述第一報(bào)告基因上，并介導(dǎo)所述Cas9核酸酶使所述半合成染 色體產(chǎn)生雙鍵斷裂，使得斷裂的半合成染色體更傾向于與所述待組裝片段同源重組，從而 將所述待組裝片段組裝到所述半合成染色體上。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還提供一種DNA組裝方法，所述方法包括：
[0032]將用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒、包含第一向?qū)NA的產(chǎn)物以及待組裝片段轉(zhuǎn)入宿主 細(xì)胞內(nèi)，所述宿主細(xì)胞攜帶有半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染色體序列和野 生染色體序列以及二者之間的第一報(bào)告基因，所述第一向?qū)NA具有CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR 位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第一報(bào)告基因，所述待組裝片段的一端有一段序列與 所述合成染色體序列的靠近所述第一報(bào)告基因的一段序列同源，所述待組裝片段的另一端 的內(nèi)側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所述野生染色體序列同源；
[0033] 所述Cas9基因表達(dá)，產(chǎn)生Cas9核酸酶，以使所述第一向?qū)NA結(jié)合到所述第一報(bào)告 基因上，并介導(dǎo)所述Cas9核酸酶使所述半合成染色體產(chǎn)生雙鍵斷裂，使得斷裂的半合成染 色體更傾向于與所述待組裝片段同源重組，從而將所述待組裝片段組裝到所述半合成染色 體上。
[0034] 優(yōu)選地，所述包含第一向?qū)NA的產(chǎn)物通過PCR方法產(chǎn)生。
[0035]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述第一報(bào)告基因和第二報(bào)告基因分別選自LEU2和URA3 中的一個(gè)；
[0036] 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因LEU2的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為：
[0037] GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQ ID N0：1)；
[0038] 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因URA3的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為：
[0039] GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQ ID N0：2)〇
[0040] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述CRISPR位點(diǎn)在其對(duì)應(yīng)的報(bào)告基因的所有潛在位點(diǎn)中 具有最高的可靠性分?jǐn)?shù)；
[0041 ]優(yōu)選地，所述可靠性分?jǐn)?shù)通過如下公式(1)計(jì)算得到：
[0043]其中，i表示所述基因組上的每個(gè)脫靶位點(diǎn)，Shit表示每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性 分?jǐn)?shù)，nrff表示脫靶位點(diǎn)總數(shù)，Sgulde表示每個(gè)CRISPR位點(diǎn)的可靠性分?jǐn)?shù)；
[0044]所述每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)Shit通過如下公式(2)計(jì)算得到：
[0046]其中，e表示所述CRISPR位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的脫靶位點(diǎn)的實(shí)際錯(cuò)配位置，M指理論錯(cuò)配位置的集 合，W[e]表示不同錯(cuò)配位置對(duì)脫靶的貢獻(xiàn)值，d表示錯(cuò)配位置兩兩之間的平均距離，11_表示錯(cuò)配 歷畫;其中，繊麵麵麵足如下:
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種第二方面所述的DNA組裝方法構(gòu)建而成 的人工合成染色體或人工合成基因組。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種人工合成微生物，所述人工合成微生物 的染色體或基因組通過第二方面所述的DNA組裝方法構(gòu)建而成。
[0049] 優(yōu)選地，所述微生物為真核微生物，更優(yōu)選為酵母。
[0050] 本發(fā)明的DNA組裝方法具有可重復(fù)操作性，并且普適于一切微生物的染色體或基 因組的人工合成，因此按照本發(fā)明的DNA組裝方法必然可以得到含有人工合成染色體或人 工合成基因組的微生物。根據(jù)需要可以進(jìn)一步提取出人工合成染色體或人工合成基因組； 而從微生物中提取染色體或基因組的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)的。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施 例中成功地合成了人工酵母。
[0051] 本發(fā)明利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)對(duì)同源重組替換進(jìn)行優(yōu)化，其有益效果體現(xiàn)在:基于 同源重組的替換成功率高、需要設(shè)計(jì)和使用的向?qū)NA種類少、基因組序列受到的有害影響 少、脫靶率低。
[0052] (1)理論上，在釀酒酵母中產(chǎn)生雙鍵斷裂能夠使得同源重組率增加4000倍[11]。另 有文獻(xiàn)證明，使用CRISPR系統(tǒng)對(duì)雙鏈DNA產(chǎn)生雙鍵斷裂，斷裂點(diǎn)臨近同源重組區(qū)，能夠使得 雙鏈DNA的同源重組效率至少增大130倍[1()]，從而使得陽(yáng)性克隆的篩選率大大提升；
[0053] (2)由于報(bào)告基因有特定的數(shù)目，如本發(fā)明中使用2個(gè)報(bào)告基因即可，所以只需要 設(shè)計(jì)和使用兩種向?qū)NA即可；
[0054] (3)由于向?qū)NA的設(shè)計(jì)數(shù)目少，使得在CRISPR位點(diǎn)脫靶效應(yīng)的測(cè)試更為簡(jiǎn)單，從 而對(duì)其有害性有更好的控制。另外，將CRISPR位點(diǎn)的結(jié)合點(diǎn)設(shè)計(jì)在報(bào)告基因（包含啟動(dòng)子、 CDS和終止子三部分）內(nèi)，由于報(bào)告基因不是基因組合成區(qū)的內(nèi)容，在組裝過程中會(huì)替換掉， 因此即便同源重組中意外引入了有害的突變(雙鍵斷裂在細(xì)胞中主要是通過同源重組和非 同源末端連接兩種方式來修復(fù)，而非同源末端連接會(huì)引入突變），也不會(huì)影響獲得最終的合 成基因組；
[0055] (4)此外，由于CRISPR位點(diǎn)的設(shè)計(jì)考慮因素全面，對(duì)所有CRISPR位點(diǎn)的特定數(shù)目的 錯(cuò)配位點(diǎn)以內(nèi)（如5個(gè)以內(nèi)，含5個(gè))的所有錯(cuò)配位置進(jìn)行評(píng)分，最終獲得每個(gè)CRISPR位置的 可靠性分?jǐn)?shù)，依靠此可靠性分?jǐn)?shù)選擇出來的位點(diǎn)可靠性高，脫靶效應(yīng)小，從而降低合成基因 組出錯(cuò)的概率。
【附圖說明】
[0056]圖1為本發(fā)明在DNA組裝的同源重組替換中使用CRISPR_Cas9系統(tǒng)增加同源重組率 的原理示意圖。
[0057] 圖2為pYP003質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖。
[0058] 圖3為pRS413_Cas9質(zhì)粒Not頂每切驗(yàn)證電泳圖。
[0059] 圖4為pRS413_ADHl_Cas9質(zhì)粒BsrG頂每切驗(yàn)證電泳圖。
[0060] 圖5為pRS411_gRNA系列質(zhì)粒Nhel和Bsal酶切驗(yàn)證電泳圖；其中，帶標(biāo)記為錯(cuò)誤 單克隆。
[0061] 圖6為CRISPR活性測(cè)試菌落生長(zhǎng)平板圖；其中，圓圈標(biāo)出菌落為粉紅色菌落。
[0062]圖7為CRISPR系統(tǒng)1K-40片段替換效率測(cè)試菌落生長(zhǎng)平板圖。
[0063] 圖8為在BY4741_synchr07G菌株中同源重組替換H片段的示意圖。
[0064] 圖9為在BY4741_synchr07H菌株中同源重組替換I片段的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0065] 下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。除非特別說明，下面實(shí)施例 中所使用的技術(shù)均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù);所使用的儀器設(shè)備和試劑等， 均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以通過公共途徑如商購(gòu)等獲得的。
[0066] 本發(fā)明中，任何情況下使用的"第一"、"第二"等概念都不應(yīng)當(dāng)理解為具有順序和 技術(shù)的含義，其作用僅在于將其與其它對(duì)象區(qū)別開來。
[0067]請(qǐng)參考圖1，在同源重組替換中使用CRISPR_Cas9系統(tǒng)增加同源重組率的原理示意 圖。在合成基因組的過程中，在進(jìn)行megachunk片段B(稱為"待組裝片段"）的同源重組替換 時(shí)，Cas9核酸酶通過設(shè)計(jì)好的向?qū)NA (即anti-LEU2，稱為"第一向?qū)NA"）對(duì)進(jìn)行 megachunk片段A同源重組時(shí)引入的報(bào)告基因LEU2(稱為"第一報(bào)告基因"；也可以是URA3,相 應(yīng)的向?qū)NA為ant i-URA3)進(jìn)行識(shí)別，產(chǎn)生雙鍵斷裂，由于產(chǎn)生雙鍵斷裂的位置在 megachunk片段B同源重組替換的同源區(qū)附近，從而加大同源重組效率。圖1中，半合成染色 體指的是經(jīng)過一次或者多次megachunk片段同源重組的野生染色體 [8]，半合成染色體上含 有合成染色體序列和野生染色體序列。每個(gè)megachunk指的是一次同源重組替換的DNA單 元，約50kb長(zhǎng)，具體可以是全長(zhǎng)的完整片段，也可以是分成多個(gè)相互之間有同源區(qū)的亞片段 (在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，megachunk片段B指的是5個(gè)相互之間有約lkb同源區(qū)的亞片 段），每個(gè)megachunk均帶有交替使用的報(bào)告基因，如交替使用的LEU2和URA3。在同源重組替 換中，megachunk進(jìn)行一次同源重組替換時(shí)引入報(bào)告基因來幫助篩選陽(yáng)性克隆，在下一次同 源重組替換時(shí)又將其替換掉。
[0068]本發(fā)明中同源重組替換方案包括兩部分內(nèi)容:一是設(shè)計(jì)嚴(yán)格的CRISPR位點(diǎn)以降低 潛在的脫靶效應(yīng);二是根據(jù)設(shè)計(jì)的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行基于CRISPR系統(tǒng)的同源重組替換。
[0069] 一 .CRISPR 位點(diǎn)設(shè)計(jì)：
[0070]首先，通過能夠允許固定錯(cuò)配數(shù)目的短序列比對(duì)軟件(如Batmis[9])來獲取報(bào)告基 因上的每個(gè)潛在位點(diǎn)（20nt+NGG)以及所有潛在位點(diǎn)的脫靶位點(diǎn)（即與潛在位點(diǎn)相比，在基 因組DNA上錯(cuò)配數(shù)目小于等于5的匹配位點(diǎn)）。然后，對(duì)其脫靶位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，并選擇出脫靶 效應(yīng)小的位點(diǎn)作為最佳候選位點(diǎn)。
[0071]可能的脫靶位點(diǎn)有以下幾種性質(zhì)[3](具備其中之一即可能是脫靶位點(diǎn)）：
[0072] (1)相同的20nt加上NGG或者NAG;
[0073] (2)與潛在位點(diǎn)有少于等于3個(gè)錯(cuò)配；
[0074] (3)與潛在位點(diǎn)有少于等于2個(gè)錯(cuò)配出現(xiàn)在PAM附近8_12bp的范圍內(nèi)；
[0075] (4)錯(cuò)配是不連續(xù)的而且間隔大于等于4bp。
[0076]為了對(duì)脫靶效應(yīng)進(jìn)行定量，引進(jìn)評(píng)分系統(tǒng)。考慮的因素有:設(shè)計(jì)的CIRPSR位點(diǎn)與脫 靶位點(diǎn)序列的錯(cuò)配總數(shù)，錯(cuò)配的絕對(duì)位置，錯(cuò)配兩兩之間的平均距離[3]。每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫 革巴可能性分?jǐn)?shù)Shit通過如下公式計(jì)算得到：
其中，e表示CRISPR位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的脫靶 位點(diǎn)的實(shí)際錯(cuò)配位置，M指理論錯(cuò)配位置的集合，W[e]表示不同錯(cuò)配位置對(duì)脫靶的貢獻(xiàn)值，d 表示錯(cuò)配位置兩兩之間的平均距離，nmm表示錯(cuò)配位置的總數(shù)；其中，W[e]按照錯(cuò)配位置順 IV \c] = [0,0.0.014,0,0,0.395.0.3 17.0,0.389,0.079.0.445. , ,, 序，滿足如下：U 1 ' ' '由此，脫靶可能性分 0.508,0.613,0.851,0.732,0.828,0.615,0.804,0.685,0.583] 數(shù)越高，此位點(diǎn)成為脫靶位點(diǎn)的可能性越高。
[0078]另外，對(duì)每個(gè)設(shè)計(jì)好的CRISPR位點(diǎn)的可靠性分?jǐn)?shù)通過如下公式計(jì)算得到：
其中，i表示所述基因組上的每個(gè)脫靶位點(diǎn)，Shlt表示 每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)，nrff表示脫靶位點(diǎn)總數(shù)，Sgulde表示每個(gè)CRISPR位點(diǎn)的可靠 性分?jǐn)?shù)。由此，CRISPR位點(diǎn)的可能性分?jǐn)?shù)越高，此位點(diǎn)越佳。
[0080]通過上述方法獲得LEU2和URA3的可靠性分?jǐn)?shù)前三位的CRISPR位點(diǎn)分別如表1和表 2所示。
[0081 ] 表1 LEU2可靠性分?jǐn)?shù)前三位的CRISPR位點(diǎn)
[0082]
[0083] 表2 URA3可靠性分?jǐn)?shù)前三位的CRISPR位點(diǎn)

[0086]注：
[0087] 1.名稱由設(shè)計(jì)對(duì)象名、設(shè)計(jì)序號(hào)、設(shè)計(jì)位置、設(shè)計(jì)所在鏈和設(shè)計(jì)的PAM信息構(gòu)成。如 LEU2_15_140_+_CGG代表設(shè)計(jì)對(duì)象是LEU2,這是尋找到的第15個(gè)潛在位點(diǎn)，潛在位點(diǎn)在LEU2 上的位置140，潛在位點(diǎn)在LEU2上的正鏈+，PAM位點(diǎn)是CGG;
[0088] 2.可靠性分?jǐn)?shù)最高為1，最低為0;
[0089] 3.通過脫靶位點(diǎn)所在基因編碼區(qū)等信息可大致估計(jì)該CRISPR位點(diǎn)引入的突變可 能造成的影響；
[0090] 4.錯(cuò)配情況由錯(cuò)配堿基和錯(cuò)配堿基之間的距離構(gòu)成，如5A0T1A4C1A4代表第6、7、 9、14、16個(gè)錯(cuò)配堿基分別為4、!\4、(：、八；
[0091] 5.對(duì)于除LEU2和URA3以外的其它報(bào)告基因，如耵33、了1^1、]\^1'17、1^2也可以通過 上述方法設(shè)計(jì)CRISPR位點(diǎn)。
[0092] 二?同源重組替換
[0093]根據(jù)設(shè)計(jì)的CRISPR位點(diǎn)進(jìn)行同源重組替換[1()]，利用CRISPR_Cas9系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)位置 (報(bào)告基因）進(jìn)行雙鍵斷裂后，使得導(dǎo)入的同源片段更容易重組。
[0094] 對(duì)于本發(fā)明的CRISPR_Cas9系統(tǒng)可以使用如下兩種：
[0095] 1.將Cas9基因和向?qū)NA所在的兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，然后分別使其表達(dá)。
[0096] 2.只將Cas9基因所在質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，使其表達(dá);對(duì)向?qū)NA所在質(zhì)粒上的包含著啟動(dòng) 子、向?qū)NA序列和終止子的表達(dá)盒使用PCR擴(kuò)增，在需要的時(shí)候，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以便 在細(xì)胞體內(nèi)能夠短暫地表達(dá)向?qū)NA。
[0097] 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，以下實(shí)施例僅是示例性的，用以說 明本發(fā)明的可行性，并不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理 解，按照本發(fā)明公開的方法可以在各種微生物體內(nèi)，尤其是真核微生物內(nèi)實(shí)現(xiàn)各種DNA片段 的組裝。
[0098] 實(shí)施例1
[0099] 1.對(duì)報(bào)告基因LEU2和URA3、片段替換測(cè)試基因YBR157C設(shè)計(jì)CRISPR位點(diǎn)（具體方法 見上述"CRISPR位點(diǎn)設(shè)計(jì)"部分）（表3)。
[0100] 表3
[0101]
[0103] 2. Cas9基因表達(dá)質(zhì)粒的獲得及改造
[0104] a.原始Cas9基因表達(dá)質(zhì)粒PYP003由清華大學(xué)的戴俊彪老師贈(zèng)與，也可通過商購(gòu)獲 得，也可通過基因合成公司合成。Cas9序列如序列表中SEQ ID N0:12所示。
[0105] b.由于原始Cas9基因表達(dá)質(zhì)粒的缺陷型標(biāo)記為L(zhǎng)EU2,與替換片段的報(bào)告基因沖 突，故利用限制酶Nhel和Spel(NEB)酶切pYP003質(zhì)粒獲得Cas9基因片段。在200yL PCR管中 配制以下(表4)酶切體系，在酶的最適溫度反應(yīng)3小時(shí)。
[0106] 表4
[0108] c .將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1.2%，使用6yLA-HindIII digest Marker，電壓為120V，電泳時(shí)間為45min。圖2為pYP003質(zhì)粒酶切結(jié)果電泳圖。再進(jìn)行 切膠純化，純化步驟參考膠純化試劑盒說明書。
[0109] d.對(duì)pRS413質(zhì)粒（由紐約大學(xué)Jef Boeke教授提供，也可通過商購(gòu)獲得），質(zhì)粒的圖 譜信息可參見snapgene網(wǎng)站。使用Spel限制酶進(jìn)行酶切，酶切體系及反應(yīng)條件參見步驟2-b，其中限制酶改為SpeI，由此得到線性化的pRS413。
[0110] e.對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟參考PCR純化試劑盒說明書。
[0111] f.將步驟2-C、步驟2-e的兩種純化產(chǎn)物利用T4連接酶，按照表5配制連接反應(yīng)體 系，16°C過夜連接。
[0112] 表5
[0114] 取10此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。最后得到生長(zhǎng)有單克隆菌落的平 板。
[0115] g.挑取單克隆菌落放入3mL已加入氨芐青霉素Ampicilin抗生素(抗生素的類型與 pRS413的抗性相對(duì)應(yīng))的LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，37°C 200rpm過夜培養(yǎng)。
[0116] h.用1.5mL離心管12000rpm離心lmin收集菌體，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取步驟參考質(zhì)粒 提取試劑盒的說明書。
[0117] i ?取2yL質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1%，3yU-HindIII digest Marker，電壓為130V，電泳時(shí)間為45min。
[0118] j .對(duì)2~3個(gè)帶型正確的質(zhì)粒使用Not I內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，再次進(jìn)行電泳，酶切和電 泳的步驟分別參見步驟2-b和步驟2-c。圖3為pRS413_Cas9質(zhì)粒Not頂每切驗(yàn)證結(jié)果圖。
[0119] k.對(duì)帶型正確的質(zhì)粒所在的菌進(jìn)行保菌工作。取滅過菌的1.5mL離心管，加入500y L鑒定正確菌株的菌液，500yL 50%的甘油，混勻后-80°C冰箱保存，由此得到pRS413_Cas9。 [0120] 1.利用基因合成公司合成2條引物(序列見ADH1啟動(dòng)子引物(表6)，SEQ ID NO: 13 ~14) 〇
[0121]表 6
[0124] m?用上述兩條引物對(duì)pYP003質(zhì)粒進(jìn)行PCR: 98°C(lmin)，98°C (10s)->55°C (30s)-> 72°C(lmin)循環(huán) 30 輪，72°C(5min)，12°C(維持 hPCR 體系見下(表 7)。
[0125] 表7

[0127] ^n.對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，步驟參見2-c 〇
[0128] 〇.利用Sail限制酶將pRS413_Cas9質(zhì)粒線性化并切膠回收，步驟參見2-b和2-c。
[0129] p.將2-n和2-〇兩步獲得的純化產(chǎn)物進(jìn)行Gibson組裝，組裝步驟參見文獻(xiàn) "Enzymatic assembly of DNA molecuLes up to several hundred kilobases" [12]，組裝 時(shí)所需要的組裝體系可通過購(gòu)買NEB公司提供的Gibson Assembly'^Master Mix得到。取10yL 組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最后得到生長(zhǎng)有單克隆菌落的平板。
[0130] q.挑取單克隆菌落放入已加入氨芐青霉素 Ampicilin抗生素（抗生素的類型與 PRS413的抗性相對(duì)應(yīng))的3mL LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，37°C200rpm過夜培養(yǎng)。
[0131 ] r.用1.5mL離心管12000rpm離心lmin收集菌體，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取步驟參考質(zhì)粒 提取試劑盒的說明書。
[0132] s.取2yL質(zhì)粒DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳，瓊脂糖凝膠濃度為1%，3yU-HindIII digest Marker，電壓為130V，電泳時(shí)間為45min。
[0133] t.對(duì)2~3個(gè)帶型正確的質(zhì)粒使用BsrGI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，再次進(jìn)行電泳，酶切和電 泳的步驟分別參見步驟2-b和步驟2-c。圖4為pRS413_ADHl_Cas9質(zhì)粒BsrG頂每切驗(yàn)證結(jié)果 圖。
[0134] u.對(duì)帶型正確的質(zhì)粒所在的菌進(jìn)行保菌工作。取滅過菌的1.5mL離心管，加入500y L鑒定正確菌株的菌液，500yL 50%的甘油，混勻后-80°C冰箱保存，由此得到pRS413_ADHl_ Cas9質(zhì)粒。
[0135] 3.構(gòu)建gRNA表達(dá)質(zhì)粒
[0136] a.將gRNA表達(dá)盒分為兩個(gè)片段:片段1--SNR52啟動(dòng)子加CRISPR位點(diǎn)序列，片段 2--CRISPR位點(diǎn)序列、gRNA骨架加SUP4終止子，其中將CRISPR位點(diǎn)序列作為兩部分的重合 區(qū)用于后續(xù)Gibson組裝。CRISPR位點(diǎn)序列在此指的是表3中ant i_LEU2、ant i_URA3和anti-YBR157C的CRISPR位點(diǎn)。通過基因合成公司合成用于gRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的寡核苷酸鏈（見 gRNA_oligo信息，表8，SEQ ID N0:15~28)。
[0137] 表8
[0138]
[0140] gRNA表達(dá)載體選用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記為MET的pRS411質(zhì)粒。該質(zhì)粒由紐約大學(xué)的Jef Boeke提供(也可通過商購(gòu)獲得），其序列信息可通過NCBI上關(guān)于該質(zhì)粒的gb格式文件獲得。
[0141] 匕使用寡核苷酸鏈3順52口4和3冊(cè)52口-1?(3￡〇10勵(lì)：15~21)為引物，野生型酵母 BY4741基因組（通過酚氯仿法提取獲得）為模板進(jìn)行PCR獲得片段l:98°C(lmin)，98°C (10s)->4 8°C(3〇s)->72°C(35s)循環(huán) 3〇 輪，72°C(5min)，l2°C(維持 hPCR 體系見下（表 9)。
[0142] 表9
[0144] c?使用寡核苷酸鏈gRNA-F(SEQ ID N0:22~27)和gRNA-SUP4-R為引物，以質(zhì)粒pSBlC3-sgRNA_ aroK(構(gòu)建方法:pSBlC3質(zhì)粒相關(guān)信息可通過iGEM官方網(wǎng)站查詢獲得;用Xbal和Spel限制酶酶切 PSB1C3 質(zhì)粒后，將序列 TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCGCGCCCAATAGTGCTITITCgIT TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCT rmTTGTTTmATGTCT(SEQ ID N0:35)連接入線性化的pSBlC3載體，即得到pSBlC3-sgRNA_ aroK 質(zhì)粒)為模板進(jìn)行 PCR 獲得片段 2:98°C(lmin)，98°C(10s)->48°C(30s)->72°C(20s)循 環(huán) 30 輪，72°C(5min)，12°C(維持 hPCR 體系見下(表 10)。
[0145] 表1〇
[0148] d.將3-b和3-c獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，步驟參見2-e。
[0149] e ?利用Spe頂每切獲得線性化pRS411載體，并切膠回收，步驟參見2-b和2-c。
[0150] f.將3-d和3-e兩步獲得的純化產(chǎn)物進(jìn)行Gibson組裝，組裝步驟參見文獻(xiàn) "Enzymatic assembly of DNA molecuLes up to several hundred kilobases" [12]，組裝 時(shí)所需要的組裝體系可通過購(gòu)買NEB公司提供的Gibson.Assembiy*_Master Mix得到。取lOyL 組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最后得到生長(zhǎng)有單克隆菌落的平板。
[0151] g.挑取6~8單克隆菌落放入3mL已加入氨芐青霉素Ampicilin抗生素(抗生素的類 型與pRS411的抗性相對(duì)應(yīng))的LB液體培養(yǎng)基的搖菌管中，37°C200rpm過夜培養(yǎng)。
[0152] h.用1.5mL離心管12000rpm離心lmin收集菌體，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取步驟參考質(zhì)粒 提取試劑盒的說明書。
[0153] i.對(duì)上一步提取的質(zhì)粒使用Nhel和Bsal限制酶進(jìn)行酶切，再次進(jìn)行電泳，酶切和 電泳的步驟分別參見步驟2-b和步驟2-c。圖5為含有不同CRISPR位點(diǎn)的pRS411_gRNA質(zhì)粒 Nhel和Bsa頂每切驗(yàn)證結(jié)果圖。
[0154] j.對(duì)帶型正確的質(zhì)粒所在的菌進(jìn)行保菌工作。取滅過菌的1.5mL離心管，加入500y L鑒定正確菌株的菌液，500yL 50 %的甘油，混勻后-80°C冰箱保存，由此得到含有不同 CRISPR位點(diǎn)的pRS411_gRNA質(zhì)粒(表11，僅選取部分展示）。
[0155] 表11
[0157] k.另外，也可以不需要構(gòu)建gRNA表達(dá)質(zhì)粒，直接使用包含gRNA的產(chǎn)物。該產(chǎn)物的構(gòu) 建方法如下：使用寡核苷酸鏈SNR52p-F和gRNA-SUP4-R為引物，以上述構(gòu)建的含有不同 CRISPR位點(diǎn)的pRS411_gRNA質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR(反應(yīng)體系參考表9/表10)，即可獲得包含 gRNA的PCR產(chǎn)物。此后使用到gRNA表達(dá)質(zhì)粒的地方均用gRNA的PCR產(chǎn)物替代即可。
[0158] 4. CRISPR 活性測(cè)試
[0159] 為確認(rèn)上述構(gòu)建的pRS413_ADHl_Cas9和pRS411_gRNA質(zhì)粒，即CRISPR系統(tǒng)在釀酒 酵母細(xì)胞中是否具有基因組編輯活性，選擇釀酒酵母內(nèi)源ADE2基因作為報(bào)告基因，URA3作 為插入片段進(jìn)行CRISPR活性測(cè)試。
[0160] a ?根據(jù) anti-ADE2 的 CRISPR 位點(diǎn)序列：ACTTGAAGAITCTITAGTGT，設(shè)計(jì)用于獲得 gRNA 表達(dá)載體的組裝片段的引物，以及獲得插入片段URA3_ade2的引物(表12)。
[0161] 表12
[0163] b ?獲得打革EADE2基因的gRNA表達(dá)質(zhì)粒pRS41 l_gRNA_ade，步驟參見3-b至3-j。
[0164] c.以pRS416質(zhì)粒（由紐約大學(xué)的Jef Boeke提供(也可通過商購(gòu)獲得），其序列信息 可通過NCBI上關(guān)于該質(zhì)粒的gb格式文件獲得。）為模板，URA3_ade2_40-F和URA3_ade2_40-R 為引物，進(jìn)行PCR獲得插入片段URA3_ade2。反應(yīng)程序?yàn)?8°C(lmin)，98°C(10s)->55°C (30s)->72°C(lmin25s)循環(huán) 30 輪，72°C(5min)，12°C(維持 hPCR 體系見下（表 13)。
[0165] 表13

[0167] d.將4-C獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，步驟參見2-e。
[0168] e.酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化
[0169] e-1.取出12ml圓底培養(yǎng)管，加入4mL YH)液體培養(yǎng)基和10yL菌液，在30°C下200rpm 搖培過夜進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。
[0170] e-2.在錐形瓶中加入50ml YPD液體培養(yǎng)基，接種過夜培養(yǎng)的菌液，在30°C下 200rpm搖培至0D值介于0.6-1.0之間。
[0171 ] e_3.將50mL菌液倒入50mL離心管中，3000rpm離心5min。去除上清，懸空加入50mL 滅菌水，顛倒混勻，3000rpm離心5min。去除上清，懸空加入20mL 0. lmol/L的醋酸鋰溶液，顛 倒混勾，3000rpm離心5min。去除上清，加入大約lml的0. lmol/L的醋酸鋰溶液，將菌體吹打 混勻，至此，酵母感受態(tài)細(xì)胞制備完成。
[0172] e_4.取4個(gè)1.5mL離心管中，分別標(biāo)記1、2、3、4,向各個(gè)管中加入待轉(zhuǎn)化片段。在1號(hào) 管中加入lOOOng步驟4-d中回收的插入片段URA3_ade2，2號(hào)管中加入lOOOng步驟4-d中回收 的插入片段URA3_ade2、pRS415和pRS411質(zhì)粒各500ng，3號(hào)管中加入1000ng步驟4-d中回收 的插入片段 URA3_ade2、pRS415_ADHl_Cas9 和 pRS411_gRNA-ade 質(zhì)粒各 500ng，在4 號(hào)管中加 入 口1^41541?41141?416質(zhì)粒各50〇1^。
[0173] e-5.在1、2、3號(hào)管中各加入100yL的酵母感受態(tài)細(xì)胞，然后依次加入25yL ssDNA， 41yL lmol/L的醋酸鋰溶液，312yL 50%PEG3350，將菌體吹打混勻或振蕩混勻，置于30°C培 養(yǎng)箱放置30min，加入50yL DMS0,稍微振蕩混勻后，將離心管置于42°C的金屬浴鍋上放置 15min，取出離心管，3000rpm離心2min，小心吸去上清，加入lmL 5mM的CaCl2溶液吹打混勾， 3000rpm離心lmin，仔細(xì)去除上清，加入100iiL 5mM的CaCh溶液，將菌體吹打混勾。
[0174] e-6.在對(duì)應(yīng)SC營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板上倒上滅菌的玻璃珠，在平板中央滴上100yL 5mM 的CaCl2溶液，然后在平板的CaCl2溶液中央分別加入5yL和1 OyL樣品，用玻璃珠將液體涂布 均勻，稍稍晾干后，將平板放置到30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3天。
[0175] f.統(tǒng)計(jì)e-6平板上生長(zhǎng)出的菌落數(shù)(結(jié)果見表14)和菌落生長(zhǎng)狀況(結(jié)果見圖6)。
[0176] 表 14
[0177]
[0178] 由表14的CRISPR活性測(cè)試結(jié)果可知，本發(fā)明構(gòu)建的CRISPR_Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母 細(xì)胞中具有正常的剪切活性，可以有效地對(duì)宿主基因組進(jìn)行編輯。
[0179] 5 ? CRISPR系統(tǒng)1K-40片段替換效率測(cè)試
[0180] 為確定CRISPR系統(tǒng)能否提高酵母中的同源重組效率，選擇野生型釀酒酵母BY4741 中的YBR157C基因作為靶點(diǎn)基因，URA3作為插入片段進(jìn)行CRISPR片段替換效率測(cè)試。
[0181] a.設(shè)計(jì)anti-YBRl57C的CRISPR位點(diǎn)（具體設(shè)計(jì)方法見上述"CRISPR"位點(diǎn)設(shè)計(jì)部 分），得到4個(gè)優(yōu)選CRISPR位點(diǎn)（見表3)。
[0182] b.利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)引物(表15)，以通過PCR獲得插入片段1K_40(1K表示該插 入片段大小約為lKbp，40表示該插入片段與整合位點(diǎn)的同源區(qū)長(zhǎng)度為40bp)。
[0183] 表 15
[0185] c.獲得打靶YBR157C基因的gRNA表達(dá)質(zhì)粒，步驟參見3-b至3-j。
[0186] d.通過PCR獲得1K-40插入片段，步驟參見4-c，其中引物換為FT-URA3-40-F和FT-URA3-40-R。
[0187] e.將5-d獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，步驟參見2-e。
[0188] f.酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化，步驟參見4-e，其中需準(zhǔn)備7個(gè)1.5ml離心管，加入 轉(zhuǎn)化片段。1號(hào)管中加入l〇〇〇ng步驟5-e中回收的1K-40片段;2號(hào)管中加入lOOOng的1K-40片 段，PRS415 和 pRS411 質(zhì)粒各 500ng;3 號(hào)管中加入 1000ng 的 1K-40 片段，pRS415_ADHl_Cas9 和 pRS411_gRNA18 質(zhì)粒各 500ng;4 號(hào)管中加入 lOOOng 的 1K-40 片段，pRS415_ADHl_Cas9 和 pRS411_gRNA22 質(zhì)粒各 500ng;5 號(hào)管中加入 lOOOng 的 1K-40 片段，pRS415_ADHl_Cas9 和 pRS411_gRNA24 質(zhì)粒各 500ng;6 號(hào)管中加入 lOOOng 的 1K-40 片段，pRS415_ADHl_Cas9 和 pRS41 l_gRNA25質(zhì)粒各500ng; 7號(hào)管中加入pRS415、pRS411、pRS416質(zhì)粒各500ng。（上述所用 的pRS411_gRNA18/22/24/25質(zhì)粒均可更換為包含對(duì)應(yīng)向?qū)NA的PCR產(chǎn)物。）
[0189] g.統(tǒng)計(jì)步驟5-f中轉(zhuǎn)化平板上生長(zhǎng)出的菌落數(shù)(結(jié)果見表16,圖7)。
[0190] 表16
[0192] 由表16的CRISPR系統(tǒng)1K-40片段替換效率測(cè)試結(jié)果可知，本發(fā)明構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母細(xì)胞中可以有效地宿主基因組進(jìn)行剪切，使基因組DNA雙鏈斷裂，增強(qiáng) 同源重組時(shí)外源DNA通過同源重組整合入基因組的效率。
[0193] 6. CRISPR系統(tǒng)用于合成酵母人工染色體DNA組裝測(cè)試
[0194] 1)針對(duì)報(bào)告基因URA3的測(cè)試
[0195] a ?準(zhǔn)備好攜帶 megachunk 片段G 的釀酒酵母 BY4741_synchr07G(進(jìn)行了megachunk 片段A-G替換之后的菌株，megachunk片段H可參見文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)后通過基因合成公司合成得 至1J，釀酒酵母BY4741由紐約大學(xué)Jef Boeke教授提供，也可通過商購(gòu)獲得，megachunk片段G 的替換方法可以參見文獻(xiàn)[8])。
[0196] b ?取出5個(gè)攜帶megachunk片段H亞片段的菌株(megachunk片段H長(zhǎng)約45kb，由5個(gè) 相互之間具有約lkb同源區(qū)的亞片段組成，megachunk片段H及其亞片段可參見文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì) 后通過基因合成公司合成得到，存放的菌株由基因合成公司提供。5個(gè)亞片段分別命名為 111、112、113、114、115片段，具體信息見表17，片段間的相互關(guān)系見圖8)，搖菌、提取質(zhì)粒，步驟參 見2-g、2~h〇 [0197]表 17
[0199] c.對(duì)5個(gè)質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切(參見表
17使用對(duì)應(yīng)的酶），進(jìn)行膠回收，步驟參見2-b、 2~c 〇
[0200] d.酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化，步驟參見4-e。其中需準(zhǔn)備2個(gè)1.5ml離心管，加入 轉(zhuǎn)化片段。1號(hào)管中加入酶切回收的megachunk片段H亞片段；2號(hào)管中加入酶切回收的 megachunk片段H亞片段，pRS415_ADHl_Cas9和pRS411_gRNA_LEU15質(zhì)粒(可使用對(duì)應(yīng)的含有 gRNA_LEU15的PCR產(chǎn)物代替該質(zhì)粒)各500ng。
[0201] e.取出上步中培養(yǎng)好的平板，將主平板上的菌影印到滅菌的天鵝絨布上，再通過 絨布將拷貝的菌落分別轉(zhuǎn)移到SD-Ura和SD-Leu培養(yǎng)基的選擇平板上，30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 過夜。
[0202] f.取出培養(yǎng)好的選擇平板，標(biāo)記出在SD-Ura平板上菌落飽滿而在SD-Leu平板上菌 落扁平的菌，記為真陽(yáng)性菌落，并進(jìn)行菌落數(shù)和篩選率統(tǒng)計(jì)(統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表18)。
[0203]表 18
[0205]由以上CRISPR系統(tǒng)針對(duì)報(bào)告基因 URA3的測(cè)試結(jié)果可知，本發(fā)明構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在攜帶有半合成染色體的酵母細(xì)胞中可以有效地對(duì)宿主基因組進(jìn)行剪切，使基因 組DNA雙鏈斷裂，顯著提高通過同源重組進(jìn)行DNA組裝時(shí)的同源重組率，滿足增加陽(yáng)性克隆 篩選率的要求。
[0206] 2)針對(duì)報(bào)告基因LEU2的測(cè)試
[0207] a ?準(zhǔn)備好攜帶megachunk 片段H 的釀酒酵母 BY4741_synchr07H(進(jìn)行了megachunk 片段A-H替換之后的菌株，megachunk片段I可參見文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)后通過基因合成公司合成得 到，釀酒酵母BY4741由紐約大學(xué)Jef Boeke教授提供(也可通過商購(gòu)獲得），megachunk片段H 的替換方法可以參見文獻(xiàn)[8 ])。
[0208] b.取出6個(gè)攜帶megachunk片段I亞片段的菌株(megachunk片段I長(zhǎng)約60kb，由6個(gè) 相互之間具有約lkb同源區(qū)的亞片段組成，megachunk片段I及其亞片段可參見文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì) 后通過基因合成公司合成得到，存放的菌株由基因合成公司提供。6個(gè)亞片段分別命名為 11、12、13、14、15、16片段，具體信息見表19，片段間的相互關(guān)系見圖9)，搖菌、提取質(zhì)粒，步 驟參見2-g、2_tu
[0209] 表 19

[0211] c.對(duì)6個(gè)質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切(參見表19使用對(duì)應(yīng)的酶），進(jìn)行膠回收，步驟參見2-b、 2~c 〇
[0212] d.酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化，步驟參見4-e。其中需準(zhǔn)備2個(gè)1.5ml離心管，加入 轉(zhuǎn)化片段。1號(hào)管中加入酶切回收的megachunk片段I亞片段；2號(hào)管中加入酶切回收的 megachunk片段I亞片段，pRS415_ADHl_Cas9和pRS411_gRNA_URA45質(zhì)粒(可使用對(duì)應(yīng)的含有 gRNA_URA45的PCR產(chǎn)物代替該質(zhì)粒)各500ng。
[0213] e.取出上步培養(yǎng)好的平板，將主平板上的菌影印到滅菌的天鵝絨布上，再通過絨 布將拷貝的菌落分別轉(zhuǎn)移到SD-Ura和SD-Leu培養(yǎng)基的選擇平板上，30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過 夜。
[0214] f.取出培養(yǎng)好的選擇平板，標(biāo)記出在SD-Leu平板上菌落飽滿而在SD-Ura平板上菌 落扁平的菌，記為真陽(yáng)性菌落，并進(jìn)行菌落數(shù)和篩選率統(tǒng)計(jì)(統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表20)。
[0215] 表20
[0217]由表20的CRISPR系統(tǒng)針對(duì)報(bào)告基因URA3的測(cè)試結(jié)果可知，本發(fā)明構(gòu)建的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在攜帶有半合成染色體的酵母細(xì)胞中可以有效地對(duì)宿主基因組進(jìn)行剪切，使基因 組DNA雙鏈斷裂，顯著提高通過同源重組進(jìn)行DNA組裝時(shí)的同源重組率，滿足增加陽(yáng)性克隆 篩選率的要求。
[0218] 實(shí)施例2
[0219] 采用本領(lǐng)域公知的染色體或基因組提取技術(shù)，從實(shí)施例1得到的含有人工合成染 色體或人工合成基因組的釀酒酵母中提取人工合成染色體或人工合成基因組。
[0220] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換。
[0221 ] 參考文獻(xiàn)
[0222] l.Yang,X.ff.,P.Model,and N.Heintz,Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.Nat Biotechno1,1997.15(9):p.859-65.
[0223] 2.Li,T.,et al.,TAL nucleases(TALNs):hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain.Nucleic Acids Res,2011.39(1):p.359-72.
[0224] 3.Hsu,P.D.,et al.,DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.Nat Biotechno1,2013.31(9):p.827-32.
[0225] 4.Xie,S.,et al.,sgRNAcas9:a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.PLoS One,2014.9(6): p.e100 448.
[0226] 5.Kasap,C.,0.Elemento,and T.M.Kapoor,DrugTargetSeqR:a genomics-and CRISPR-Cas9-based method to analyze drug targets.Nat Chem Biol,2014.10(8): p.626~8.
[0227] 6.Heigwer,F.,G.Kerr,and M.Boutros,E-CRISP:fast CRISPR target site identification.Nat Methods，2014.11(2):p.122-3.
[0228] 7.Guell,M.,L.Yang,and G.M.Church,Genome editing assessment using CRISPR Genome Analyzer(CRISPR-GA).Bioinformatics,2014.
[0229] 8 . Annaluru , N. ，et al. , Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.Science,2014.344(6179):p.55-8.
[0230] 9.Tennakoon,C.,R.ff.Purbojati,and ff.K.Sung,BatMis:a fast algorithm for k-mismatch mapping.Bioinformatics,2012.28(16):p.2122-8.
[0231 ] lO.DiCarlo,J.E.,et al.,Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.Nucleic Acids Res,2013.41(7):p.4336-43.
[0232] 11 ?Storici，F(xiàn)?，et al?，Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast.Proc Natl Acad Sci U S A，2003.100(25):p.14994-9.
[0233] 12.Gibson,D.G.,et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods,2009.6(5):p.343-5.
[0234] 13.Kabadi，A.M.，et al?'Multiplex CRISPR/Cas9_based genome engineering from a single lentiviral vector.Nucleic Acids Res,2014.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，包括如下組成部分： 用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒;和 第一向?qū)NA和/或用于表達(dá)所述第一向?qū)NA的質(zhì)粒，其中所述第一向?qū)NA具有 CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合用于組裝的半合成染色體所攜帶的 第一報(bào)告基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，還包括如下組 成部分： 宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞攜帶所述半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染色體 序列和野生染色體序列以及二者之間的所述第一報(bào)告基因； 待組裝片段，所述待組裝片段的一端有一段序列與所述合成染色體序列的靠近所述第 一報(bào)告基因的一段序列同源，另一端的內(nèi)側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所述野 生染色體序列同源。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，還包括如下組 成部分： 第二向?qū)NA和/或用于表達(dá)所述第二向?qū)NA的質(zhì)粒，其中所述第二向?qū)NA具有 CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第二報(bào)告基因。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，所述第一 報(bào)告基因和第二報(bào)告基因?yàn)榻湍钢械膱?bào)告基因，優(yōu)選為1^1]2、1]1^3、!1133、了1^1、1^1'17和 LYS2中的兩種，更優(yōu)選為L(zhǎng)EU2和URA3; 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因 LEU2的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為： GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQ ID N0：1)； 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因 URA3的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為： GTGGGCCCAGGTATTGTTAG(SEQ ID N0：2)〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，所述待組 裝片段為合成的基因組片段，所述CRISPR位點(diǎn)在其對(duì)應(yīng)的報(bào)告基因的所有潛在位點(diǎn)中具有 最高的可靠性分?jǐn)?shù)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于DNA組裝的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，所述可靠性分 數(shù)通過如下公式(1)計(jì)算得到：其中，i表示所述基因組上的每個(gè)脫靶位點(diǎn)，Shlt表示每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)， rwf表示脫靶位點(diǎn)總數(shù)，Sguide表示每個(gè)CRISPR位點(diǎn)的可靠性分?jǐn)?shù)； 所述每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)Shlt通過如下公式(2)計(jì)算得到：其中，e表示所述CRISPR位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的脫靶位點(diǎn)的實(shí)際錯(cuò)配位置，Μ指理論錯(cuò)配位置的集合，W [e]表示不同錯(cuò)配位置對(duì)脫靶的貢獻(xiàn)值，@錯(cuò)配位置兩兩之間的平均距離，錯(cuò)配位置的總 數(shù);其中，W[e]按照錯(cuò)配位置順序，滿足如下7. -種DNA組裝方法，其特征在于，所述方法包括： 將用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒、用于表達(dá)第一向?qū)NA的質(zhì)粒以及待組裝片段轉(zhuǎn)入宿主 細(xì)胞內(nèi)，所述宿主細(xì)胞攜帶有半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染色體序列和野 生染色體序列以及二者之間的第一報(bào)告基因，所述第一向?qū)NA具有CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR 位點(diǎn)依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第一報(bào)告基因，所述待組裝片段的一端有一段序列與 所述合成染色體序列的靠近所述第一報(bào)告基因的一段序列同源，所述待組裝片段的另一端 的內(nèi)側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所述野生染色體序列同源； 所述Cas9基因和所述第一向?qū)NA表達(dá)，產(chǎn)生Cas9核酸酶和所述第一向?qū)NA，以使所 述第一向?qū)NA結(jié)合到所述第一報(bào)告基因上，并介導(dǎo)所述Cas9核酸酶使所述半合成染色體 產(chǎn)生雙鍵斷裂，使得斷裂的半合成染色體更傾向于與所述待組裝片段同源重組，從而將所 述待組裝片段組裝到所述半合成染色體上。8. -種DNA組裝方法，其特征在于，所述方法包括： 將用于表達(dá)Cas9基因的質(zhì)粒、包含第一向?qū)NA的產(chǎn)物以及待組裝片段轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞 內(nèi)，所述宿主細(xì)胞攜帶有半合成染色體，所述半合成染色體包含合成染色體序列和野生染 色體序列以及二者之間的第一報(bào)告基因，所述第一向?qū)NA具有CRISPR位點(diǎn)，該CRISPR位點(diǎn) 依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合所述第一報(bào)告基因，所述待組裝片段的一端有一段序列與所述 合成染色體序列的靠近所述第一報(bào)告基因的一段序列同源，所述待組裝片段的另一端的內(nèi) 側(cè)有第二報(bào)告基因并且外側(cè)有一段序列與所述野生染色體序列同源； 所述Cas9基因表達(dá)，產(chǎn)生Cas9核酸酶，以使所述第一向?qū)NA結(jié)合到所述第一報(bào)告基因 上，并介導(dǎo)所述Cas9核酸酶使所述半合成染色體產(chǎn)生雙鍵斷裂，使得斷裂的半合成染色體 更傾向于與所述待組裝片段同源重組，從而將所述待組裝片段組裝到所述半合成染色體 上； 優(yōu)選地，所述包含第一向?qū)NA的產(chǎn)物通過PCR方法產(chǎn)生。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的DNA組裝方法，其特征在于，所述第一報(bào)告基因和第二報(bào)告 基因?yàn)榻湍钢械膱?bào)告基因，優(yōu)選為1^1]2、1]1^3、!1133、了1^1、1^1'17和1^32中的兩種，更優(yōu)選為 LEU2和URA3; 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因 LEU2的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為： GAAAGGTGAGAGGCCGGAAC(SEQ ID N0：1)； 優(yōu)選地，結(jié)合報(bào)告基因 URA3的向?qū)NA的CRISPR位點(diǎn)序列為： GTGGGCCCAGGTATTGTTA(SEQ ID N0：2)〇10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的DNA組裝方法，其特征在于，所述CRISPR位點(diǎn)在其對(duì)應(yīng)的 報(bào)告基因的所有潛在位點(diǎn)中具有最高的可靠性分?jǐn)?shù)； 優(yōu)選地，所述可靠性分?jǐn)?shù)通過如下公式(1)計(jì)算得到：其中，i表示所述基因組上的每個(gè)脫靶位點(diǎn)，Shlt表示每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)， nrff表示脫靶位點(diǎn)總數(shù)，Sguide表示每個(gè)CRISPR位點(diǎn)的可靠性分?jǐn)?shù)； 所述每個(gè)脫靶位點(diǎn)的脫靶可能性分?jǐn)?shù)Shlt通過如下公式(2)計(jì)算得到：其中，e表示卵iCREPR位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的脫祀位點(diǎn)的實(shí)際錯(cuò)配位置，Μ指理論錯(cuò)配位置的集合，W[e]表示 不同錯(cuò)配位置對(duì)脫靶的貢獻(xiàn)值，礙錯(cuò)配位置麗之間的平均距離，11"^錯(cuò)配位置的總數(shù);其中， W[e]按照錯(cuò)配位置順序，滿足如下：11. 一種通過權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的DNA組裝方法構(gòu)建而成的人工合成染色體或 人工合成基因組。12. -種人工合成微生物，其特征在于，所述人工合成微生物的染色體或基因組通過權(quán) 利要求7-10任一項(xiàng)所述的DNA組裝方法構(gòu)建而成； 優(yōu)選地，所述微生物為真核微生物，更優(yōu)選為酵母。
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK105821072SQ201610044240
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年1月22日
【發(fā)明人】龔劍輝, 范楚瑤, 陳泰, 鄧洋, 王云, 沈玥
【申請(qǐng)人】深圳華大基因研究院