天然不對稱環(huán)丁烷衍生物和其藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種天然來源的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B，分子式均為C38H54O5，英文名分別為Scopariusicide A和Scopariusicide B，它們的制備方法和在制備免疫抑制藥物中的應用。該類化合物是從自然界中發(fā)現的罕見的具有對映?克羅烷型二萜片段和苯丙素片段的不對稱環(huán)丁烷衍生物。以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜[Isodon scopariusC.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的莖葉為原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分離、結構鑒定等步驟而分離鑒定。經抑制抗CD3和CD28單克隆抗體誘導的人T細胞增殖活性測試表明，本發(fā)明的化合物結構新穎，且具有生物活性，對T細胞株表現了抑制活性，作為免疫抑制劑的先導化合物。
【專利說明】
天然不對稱環(huán)丁烷衍生物和其藥物組合物
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于天然有機化學領域，具體涉及一種天然不對稱環(huán)丁烷衍生物和其提取 分離的方法和應用，特別是涉及一種天然環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B，其藥物組合 物和其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 香茶菜屬植物是我國的地區(qū)藥用植物資源，常作為草藥在我國民間廣泛使用。它 們大都具有清熱解毒、抗炎抗菌、抗腫瘤等功效。該屬植物富含結構多樣的活性二萜化合 物，部分二萜化合物具有良好的抗腫瘤、細胞毒性、抗菌和免疫抑制等活性，如毛萼乙素和 旱生香茶菜乙素具有顯著的抗腫瘤活性，部分香茶菜屬植物的有效成分已在臨床上應用。 帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]是分布在云南的一種香茶 菜屬植物，主要用于治療人和牲畜的消化系統(tǒng)炎癥以及外部感染等。研究表明，該種植物含 有豐富的結構新穎的二萜化合物。目前，現有技術中未見有天然提取的不對稱環(huán)丁烷衍生 物帚狀香茶菜內酯A和B及其活性的報道。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種新穎的不對稱環(huán)丁烷衍生物，以該不對稱環(huán)丁烷衍生物 為活性成分的藥物組合物，該不對稱環(huán)丁烷衍生物的制備和鑒定方法，該不對稱環(huán)丁烷衍 生物在制備免疫抑制藥物中的應用。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術方案加以實現的：
[0005] 如下結構式所示的天然不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B，
[0006]
[0007] 所述的天然不對稱環(huán)丁烷衍生物是以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜的莖葉為 原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分離、結構鑒定步驟進行分離 和鑒定所得。
[0008] 該兩個化合物分子式均為C38H54O5，英文名分別為scopariusicide A和 scopariusicide B，是具有對映-克羅烷型二萜片段和苯丙素片段的不對稱環(huán)丁烷衍生物。
[0009] 所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物的制備方法：以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜的莖 葉為原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分離、結構鑒定步驟進行 分離和鑒定：
[0010] A、萃取物的制備:將帚狀香茶菜莖葉的粉末加入提取罐中，加入有機溶劑，在超聲 輔助下提取2~5次，每次30~60分鐘，過濾后合并提取液，減壓濃縮得到提取液;將該提取 液分散在水中，分別用水體積1~2倍的乙酸乙酯萃取2~4次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得 到萃取物a;其中所述的有機溶劑為體積含量為80~100%的乙醇、70~100%的丙酮、80~ 100%的甲醇或乙酸乙酯中任意一種；
[0011] B、硅膠柱層析:將A步驟所得的萃取物a用重量比為1.5-3倍量的甲醇或者丙酮中 的任意一種溶解，用萃取物重量比為1~1.5倍的80~100目硅膠拌樣，揮發(fā)干溶劑后裝入硅 膠柱，裝柱硅膠為200~300目，用量為萃取物a重量的6~10倍;用體積比為1:0~0:1的混合 有機溶劑進行梯度洗脫，收集梯度洗脫液并減壓濃縮，經TLC或分析型HPLC監(jiān)測，合并組分 相同的洗脫液，得到粗品b;其中所述的混合有機溶劑為二氯甲烷、氯仿、或石油醚中任意的 一種和甲醇、乙酸乙酯或丙酮中任意的一種，其體積配比為19:1，9:1，8:2,7:3,6:4,5:5,1: 2 和0:1;
[0012] C、反相柱層析：將步驟B得到的粗品b上反相柱層析，反相柱是用反相材料C-18、 Rp-18或者MCI中任意一種填充，用體積含量為50~100 %的甲醇水溶液進行梯度洗脫，收集 各部分洗脫液并濃縮，經TLC監(jiān)測，合并含有環(huán)丁烷衍生物的部分，得到粗品c;
[0013] D、高效液相色譜純化:將步驟C中得到的粗品c經半制備高效液相色譜分離純化， 即得所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和帚狀香茶菜內酯B，英文名分別為 scopariusicide A和scopariusicide B;其中所述的半制備高效液相色譜分離條件是以體 積含量為80~90%的甲醇或體積含量為70~90%乙腈中任意一種為流動相，流速為2~ 3mL/min，以9.4X 250mm，5ym的Zorbax SB-C18反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長 為201~280nm，每次進樣10~100yL，分別收集10~40min的色譜峰，多次累加后蒸干得到兩 種純的白色粉末；
[0014] E、結構鑒定:通過測定D步驟所得的2種白色粉末狀化合物的一維、二維核磁共振、 常規(guī)和高分辨質譜波譜數據，得到該化合物的圖譜，經結構解析確定其分子結構，確定為新 的不對稱環(huán)丁烷衍生物，分別命名為帚狀香茶菜內酯A和B。
[0015] 藥物組合物，其包含所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B和至少一種 藥學上可接受的載體。
[0016] 所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B在制備免疫抑制藥物中的應用。
[0017] 所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B在制備抗免疫力低下的相關疾 病的藥物中的應用。
[0018] 本發(fā)明的不對稱環(huán)丁烷衍生物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的 形式使用。該藥物組合物含有0.1-99%，優(yōu)選為0.5-90%的本發(fā)明化合物，其余為藥物學上 可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載體或賦形劑。
[0019] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、超填 料以及藥物制品輔劑。將所述的有效提取物或有效部位以單位體重服用量的形式使用。本 發(fā)明的藥物可經口服和口腔噴霧兩種形式給藥。
[0020] 口服可用其固體或液體制劑，如粉劑、片劑、糖衣片劑、膠囊、酊劑、糖漿、滴丸劑 等。
[0021] 口腔噴霧可用其固體或液體制劑。
[0022] 與現有技術相比，本發(fā)明具備如下的優(yōu)益性：
[0023] 本發(fā)明以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kud0]的莖葉為原料，經有機溶劑提取、硅膠柱層析、高壓液相色譜進行分離， 得到一類新穎的不對稱環(huán)丁烷衍生物，該類化合物是從自然界中首次發(fā)現的一類罕見的具 有對映-克羅烷型二萜片段和苯丙素片段的不對稱環(huán)丁烷衍生物，以帚狀香茶菜內酯A和B 為原料，經抑制抗CD3和CD28單克隆抗體誘導的人T細胞增殖活性測試表明，在無細胞毒活 性濃度下，帚狀香茶菜內酯A顯示了一定的活性，其IC5Q值為20.7μΜ。說明這類化合物具有一 定的免疫抑制活性，能在免疫抑制藥物中具有一定研究價值和應用。因此，制備并開發(fā)該類 新穎類型天然產物在醫(yī)藥上的應用具有重要的意義。
【附圖說明】
[0024] 圖1為帚狀香茶菜內酯Α的核磁共振碳譜(13C NMR);
[0025] 圖2為帚狀香茶菜內酯A的核磁共振氫譜PHNMR);
[0026] 圖3為帚狀香茶菜內酯B的核磁共振碳譜(13C NMR);
[0027] 圖4為帚狀香茶菜內酯B的核磁共振氫譜(? NMR);
[0028] 圖5為帚狀香茶菜內酯A的關鍵HMBC相關；
[0029] 圖6為帚狀香茶菜內酯A和B的結構示意圖； 圖7為不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基 于本發(fā)明所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 實施例1
[0032]本發(fā)明的不對稱環(huán)丁烷衍生物是以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的莖葉為原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠 柱層析、高壓液相色譜分離、結構鑒定等步驟進行分離和鑒定，其結構式分別為：
[0033]
[0034]該類化合物命名為帚狀香茶菜內酯A和B，分子式為C38H54O5,英文名分別為 scopariusicide A和scopariusicide B，該兩個化合物是從自然界中發(fā)現的一類具有對 映-克羅烷型二萜片段和苯丙素片段的不對稱環(huán)丁烷衍生物。
[0035] 所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物的制備方法，是以唇形科香茶菜屬植物帚狀香茶菜 [Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]的莖葉為原料，通過有機溶劑提取、正 反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分離、結構鑒定等步驟進行分離和鑒定，本發(fā)明所述的唇形 科香茶菜屬帚狀香茶菜不受地區(qū)和品種限制，均可以實現本發(fā)明。具體為：
[0036] A、帚狀香茶菜萃取物的制備:將帚狀香茶菜莖葉的粉碎加入提取罐中，加入有機 溶劑，在超聲輔助下提取2~5次，每次30~60分鐘，過濾后合并提取液，減壓蒸除有機溶劑， 將所得濃縮液分散在水中，分別用水體積1~2倍的乙酸乙酯萃取2~4次，合并乙酸乙酯層， 濃縮得到萃取物a。其中該步驟所述的有機溶劑為體積含量為80~100 %的乙醇、70~100 % 的丙酮、80~100%的甲醇或乙酸乙酯中任意的一種。
[0037] B、硅膠柱層析:將A步驟所得的萃取物a用重量比為1.5~3倍量的甲醇或者丙酮溶 解，用萃取物重量比為1~1.5倍的80~100目硅膠拌樣，揮發(fā)干溶劑后裝入硅膠柱，裝柱硅 膠為200~300目，用量為萃取物a重量的6~10倍;用體積比為1:0~0:1的混合有機溶劑進 行梯度洗脫，收集梯度洗脫液、減壓濃縮，經TLC或分析型HPLC監(jiān)測，合并組分相同的洗脫 液，得到粗品b。其中該步驟所述的有機溶劑為二氯甲烷、氯仿或石油醚中任意的一種和甲 醇、乙酸乙酯或丙酮中任意的一種，其體積配比為19:1，9:1，8:2,7 :3,6:4,5:5，1:2和0:1。 [0038] C、反相柱層析:將以有機溶劑進行洗脫得到的粗品b用反相層析柱分離。反相柱是 用反相材料C_18、MCI或Rp-18中任意一種填充；用體積含量為50~100%的甲醇水溶液進行 梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經TLC監(jiān)測，合并含有不對稱環(huán)丁烷衍生物的部分，得 到粗品c〇
[0039] D、高效液相色譜分離:將以體積含量為70~90 %甲醇水溶液洗脫得到的粗品c經 半制備高效液相色譜分離純化，即得所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和帚狀 香茶菜內酯B，英文名分別為scopariusicide A和scopariusicide B。在D步驟中，高效液相 色譜分離純化是以體積含量為80~90%的甲醇或體積含量為70~90%的乙腈中的任意一 種為流動相，流速2~3mL/min，以9.4 X 250mm，5μηι的Zorbax SB-C18反相制備柱為固定相， 紫外檢測器檢測波長為201~280nm，每次進樣10~100yL，分別收集10~40min的色譜峰，多 次累加后蒸干得到兩種純的白色粉末。
[0040] E、結構鑒定:通過測定D步驟所得的白色粉末狀化合物的一維、二維核磁共振、常 規(guī)和高分辨質譜等波譜數據，得到該化合物的圖譜。經結構解析，確定其分子結構為新的不 對稱環(huán)丁烷衍生物，分別命名為帚狀香茶菜內酯A和B，并用單晶衍射的方法確證了化合物 帚狀香茶菜內酯A的絕對構型。
[0041 ] 實施例2
[0042] 將4kg帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]莖葉的粉 末加入提取罐中，加入20L體積含量為70 %的乙醇水溶液，在25 °C下浸泡3天，共浸泡3次，過 濾合并濾液，減壓濃縮得到混合溶液。將該混合液分散在2L水中，分別用2L乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得到萃取物a 250g。
[0043] 往萃取物a中加入600mL甲醇溶解，用400g 80~100目硅膠拌樣，用4kg 200~300 目硅膠裝柱，用體積比分別為1 :〇、19:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1 :2、0:1的氯仿-甲醇混合有機 溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液并減壓濃縮，經TLC監(jiān)測，合并組分相同的洗脫液，得到8個 部分，體積比19:1的氯仿-甲醇混合有機溶劑洗脫所得的粗品b為78g;用反相材料C-18裝 柱，粗品b上反相柱，以體積含量為40~90%的甲醇水溶液進行梯度洗脫，收集各部分洗脫 液并濃縮，經TLC監(jiān)測，合并含有不對稱環(huán)丁烷衍生物的部分，減壓濃縮得到粗品c 600mg， 再以體積含量為88 %的甲醇為流動相，流速3mL/min，以9.4 X 250mm，5μπι的Zorbax SB-C18 反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長為230nm，每次進樣15yL，分別收集26.0min和 28.4min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和 B，英文名分別為scopariusicide A和scopariusicide B〇
[0044] 實施例3
[0045] 將4kg帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]莖葉的粉 末加入提取罐中，加入20L體積含量為70 %的甲醇水溶液，在25 °C下浸泡3天，共浸泡3次，過 濾合并濾液，減壓濃縮得到混合溶液。將該混合液分散在2.5L水中，分別用2.5L乙酸乙酯萃 取3次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得到萃取物a 335g。
[0046] 往萃取物a中加入750mL甲醇溶解，用500g 80~100目硅膠拌樣，用4.5kg 200~ 300目硅膠裝柱，用體積比分別為1:0、19:1、9:1、8:2、3 :2、1:1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙酯 混合有機溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液并減壓濃縮，經TLC監(jiān)測，合并相同的部分，得到8 個部分，體積比8:2的氯仿-甲醇混合有機溶劑洗脫所得的粗品b為64g;用反相材料RP-18裝 柱，粗品b上反相柱，以體積含量為40~90%的甲醇水溶液進行梯度洗脫，收集各部分洗脫 液并濃縮，經TLC監(jiān)測，合并含有不對稱環(huán)丁烷衍生物的部分，減壓濃縮得粗品c 710mg，再 以80 %的乙腈為流動相，流速3mL/min，以9.4 X 250mm，5μηι的Zorbax SB-C18反相制備柱為 固定相，紫外檢測器檢測波長為230nm，每次進樣IlyL，分別收集23.5min和24.9min的色譜 峰，多次累加后蒸干，即得所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B，英文名分別為 scopariusicide A和scopariusicide B〇
[0047] 實施例4
[0048] 將4kg帚狀香茶菜[Isodon scoparius C.Y.Wu et H.W.Li(Dunn)Kudo]莖葉的粉 末加入提取罐中，加入20L體積含量為70 %的丙酮水溶液，在25°C下浸泡3天，共浸泡3次，過 濾合并濾液，減壓濃縮得到混合溶液。將該混合液分散在2.0L水中，分別用2.0L乙酸乙酯萃 取3次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮得到萃取物a 220g。
[0049] 往萃取物a中加入450mL丙酮溶解，用300g 80~100目硅膠拌樣，用4kg 200~300 目硅膠裝柱，用體積比分別為1 :〇、19:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1 :2、0:1的氯仿-丙酮混合有機 溶劑梯度洗脫，收集梯度洗脫液并減壓濃縮，經TLC監(jiān)測，合并相同的部分，得到8個部分，體 積比9:1的氯仿-甲醇混合有機溶劑洗脫所得的粗品b為75g;用反相材料C-18裝柱，粗品b上 反相柱，以體積含量為40~90 %的甲醇水溶液進行梯度洗脫，收集各部分洗脫液并濃縮，經 TLC監(jiān)測，合并含有不對稱環(huán)丁烷衍生物的部分，減壓濃縮得粗品c 470mg，再以體積含量為 88 %的甲醇為流動相，流速3mL/min，以9.4 X 250mm，5μηι的Zorbax SB-C18反相制備柱為固 定相，紫外檢測器檢測波長為230nm，每次進樣15yL，分別收集26. Omin和28. Omin的色譜峰， 多次累加后蒸干，即得所述的不對稱環(huán)丁烷衍生物帚狀香茶菜內酯A和B，英文名分別為 scopariusicide A和scopariusicide B〇
[0050] 實施例5
[0051]實施例1-4制備的化合物帚狀香茶菜內酯A和B，均為白色粉末;所得產品分別用 ^-NMR、13C-NMR、咕-咕 COSY、4-? ROESY、HSQC、HMBC、IR、HRE頂S、UV進行結構鑒定。
[0052]化合物帚狀香茶菜內酯A的紫外光譜(溶劑為甲醇)為Amax(l〇ge) :200(0.32)。紅外 光譜（溴化鉀壓片）為3447，3431，2930，2972，1740，1723，1516，1253，1189，1035,996， 921cm-'HRES頂S顯示該化合物準分子離子峰m/z 613.3872[M+Na] + (calcd for C38H54〇5Na， 613.3869)。結合13C和1H NMR譜（圖1和圖2,碳譜氫譜數據歸屬見表1)，推出分子式為 C38H54〇5,并用單晶衍射的方法確證了化合物的絕對構型（圖6)，命名為帚狀香茶菜內酯A。 [0053]表1帚狀香茶菜內酯A和B的13C和1H NMR數據(溶劑為Pyridine-d5)
[0054]
4' 159.5 s 159.5 s 5' 114.8 d 7.04, cU8.5) 114.7d 7.06, d(8.5) 6' 129.5 d 7.27, d(8.4) 129.4 d 7,33. d(8,4) 7' 51.9 d 4.10, d(9.7) 52.0 d 4.13, d(9.6) 8' 41.8 d 4.18.1(10.1) 41.7 d 4.23,1(10.1) 9' 172.5 s 172.5 s Γ 116.81 5.36, d(17.3；K 5.18x1(10.6) 116.61 5.37, d( 17.2); 5.l7,d(l〇.6)
[0055] T 138.1 d 5.97, m 138.0d 5,97, ra 3" 76.1 d 5.61,q(6.4) 76.0 d 5.62, q(6.4) 4" 34.7 t ? .93. m; 1.76, m 34.6 l 1.92, m; 1,75, m 5" 25.41 ? .46, m 25.3 1 1.47, m 6" 32,41 1.27, m 32.2 1 1,26. m T 23.3 l 1.26, ra 23.2 1 1.24, m 8" 14.7 q 0.83,1(6.9) 14.5 q 0.81,1(7()) 1'" 55.7 q 3.71, s 55.5： q. 3.70, s
[0056] 化合物帚狀香茶菜內酯B的紫外光譜(溶劑為甲醇）為Amax(l〇ge):200(0.43)。紅外 光譜（溴化鉀壓片）為vMX 3439,2956,2930,1734,1613,1514,1459,1251,1180,1034cm-1。 HRESIMS顯示該化合物準分子離子峰m/z 613.3866[M+Na] + (calcd for C38H54〇5Na， 613.3869)。結合13C和1H NMR譜（圖3和圖4,碳譜氫譜數據歸屬見表1)，推出分子式為 C38H54O5，命名為帚狀香茶菜內酯B。
[0057] 所有波譜數據證實，所純化得到的帚狀香茶菜內酯A和B的化學結構式如下：
[0058]
[0059] 頭施例?
[0060] 取實施例2~4所制備的帚狀香茶菜內酯Α或/和Β進行抗CD3和CD28單克隆抗體誘 導的人T細胞增殖活性測試，具體方法為：
[0061] 刺激后脾細胞增殖檢測:取分離出的Bal b/c小鼠/人脾臟，制備單細胞懸液，細胞 密度調整為1 X 1〇6 · mlT1。使用2μπι〇1 · ΙΓ1羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯 (Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE，Eugene，0R，USA)，37°C避 光染色細胞lOmin，加入冰冷的RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止染色。使用anti-CD3/ lmg · L-1 anti-CD28刺激脾細胞（1X106 · mL-4。加入不同濃度篩選藥物后，于37°C，5%C02中培養(yǎng)72小時。流式細胞儀檢測細胞增殖。以細胞增殖系數(Proliferation Index，PI)評 價抑制強度，PI越低，抑制強度越高。
[0062]靜息脾細胞活力檢測:取Bal b/c小鼠/人脾臟，制備單細胞懸液，細胞密度調整為 1 X 106 · mL-1。加入不同濃度篩選藥物后，于37°C，5%C02中培養(yǎng)72小時。使用Cell Counting Kit-8(CCK-8,Dojindo,Kumamoto,Japan)檢測細胞活力。具體為:在96孔板中接 種細胞懸液（100μL孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)(37°C，5%⑶2)。向每孔加入10yL CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響0D值的讀數）。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育1 至 4 小時。用酶標儀 SpectraMax M5 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA，USA)測定在450nm處的吸光度?？梢韵蛎靠字屑尤?0yL 0.1M的HC1溶液或者l%w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。
[0063]實驗結果發(fā)現，化合物帚狀香茶菜內酯A表現了一定的免疫抑制活性，抑制人體T 細胞增殖活性的IC50為20.7yM(BD750為陽性對照）。
[0064] 實施例7:
[0065]取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B，按其與賦形劑重量比1:1的比例 加入賦形劑，制粒壓片。
[0066] 實施例8:
[0067] 取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B，按其與賦形劑重量比1:2的比例 加入賦形劑，制粒壓片。
[0068] 實施例9
[0069] 取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B，按常規(guī)膠囊制劑方法制成膠囊。
[0070] 實施例10:
[0071]取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B，再按下述方法制成片劑： 片劑：化合物2 lOOmg 淀粉 適量
[0072] 玉米漿 ：適量 硬脂酸鎂 適量
[0073] 實施例11:
[0074]膠囊劑:取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B 100mg [0075] 淀粉 適量
[0076]硬脂酸鎂 適量
[0077]制備方法:將化合物與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合 物裝入硬明膠膠囊。
[0078] 實施例12: 鼻噴霧劑：取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/_ B 8Q mg 氯化鈉 8 mg EDTA 1 mg
[0079] 磷酸鈉緩沖液（:pH6. 5) 10 mg 多乙氧基醚 10 mg 重蒸餾水 2 nil
[0080] 制備方法:攪拌下于適當體積的重蒸餾水中每次加入一種成分，直至完全深解，然 后再加入另一種成分。加水至2ml后，將該溶液在無菌過濾器上過濾，裝入瓶中并按照適當 的劑量分隔。
[0081] 實施例13:
[0082] 滴丸:取實施例2-4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B lg
[0083] 聚乙二醇 6000 9g
[0084] 制法:取實施例2~4所制備的帚狀香茶菜內酯A或/和B，與聚乙二醇6000熔融液的 制備：按上述處方量稱取，加入適量無水乙醇，微熱溶解后，加入處方量的聚乙二醇熔融液 中（60°C水浴保溫），攪拌混合均勻，直至乙醇揮盡為止，靜置于60°C水浴中保溫30分鐘，待 氣泡除盡，然后將除盡氣泡的上述混勻熔融液轉入貯液筒內，在保溫80-85Γ的條件下，控 制滴速，一滴滴地滴入冷凝液中，等冷凝完全，傾去冷凝液，收集滴丸，瀝凈和用濾紙除去丸 上的冷凝液，放置硅膠干燥器中或自然干燥即可。
【主權項】
1. 如下結構式所示的天然不對稱環(huán)下燒衍生物靑狀香茶菜內醋A和B，2. 如權利要求1所述的天然不對稱環(huán)下燒衍生物，其特征在于其是W唇形科香茶菜屬 植物靑狀香茶菜的莖葉為原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分 離、結構鑒定步驟進行分離和鑒定所得。3. 根據權利要求1所述的天然不對稱環(huán)下燒衍生物，其特征在于該兩個化合物分子式 均為C38也4〇日，英文名分別為scopariusicide A和scopariusicide B，是具有對映-克羅燒型 二祗片段和苯丙素片段的不對稱環(huán)下燒衍生物。4. 權利要求1所述的不對稱環(huán)下燒衍生物的制備方法，其特征在于W唇形科香茶菜屬 植物靑狀香茶菜的莖葉為原料，通過有機溶劑提取、正反相硅膠柱層析、高壓液相色譜分 離、結構鑒定步驟進行分離和鑒定： A、 萃取物的制備:將靑狀香茶菜莖葉的粉末加入提取罐中，加入有機溶劑，在超聲輔助 下提取2~5次，每次30~60分鐘，過濾后合并提取液，減壓濃縮得到提取液;將該提取液分 散在水中，分別用水體積1~2倍的乙酸乙醋萃取2~4次，合并乙酸乙醋層，減壓濃縮得到萃 取物a;其中所述的有機溶劑為體積含量為80~100 %的乙醇、70~100 %的丙酬、80~100 % 的甲醇或乙酸乙醋中任意一種； B、 硅膠柱層析:將A步驟所得的萃取物a用重量比為1.5-3倍量的甲醇或者丙酬中的任 意一種溶解，用萃取物重量比為1~1.5倍的80~100目硅膠拌樣，揮發(fā)干溶劑后裝入硅膠 柱，裝柱硅膠為200~300目，用量為萃取物a重量的6~10倍;用體積比為1:0~0:1的混合有 機溶劑進行梯度洗脫，收集梯度洗脫液并減壓濃縮，經化C或分析型HPLC監(jiān)測，合并組分相 同的洗脫液，得到粗品b;其中所述的混合有機溶劑為二氯甲燒、氯仿或石油酸中的任意一 種和甲醇、乙酸乙醋或丙酬中的任意一種，其體積配比為19:1，9:1，8:2,7:3,6:4,5:5，1:2 和0:1; C、 反相柱層析:將步驟B得到的粗品b上反相柱層析，反相柱是用反相材料C-18、Rp-18 或者MCI中任意一種填充，用體積含量為50~100%的甲醇水溶液進行梯度洗脫，收集各部 分洗脫液并濃縮，經化C監(jiān)測，合并含有環(huán)下燒衍生物的部分，得到粗品C; D、 高效液相色譜純化:將步驟C中得到的粗品C經半制備高效液相色譜分離純化，即得 所述的不對稱環(huán)下燒衍生物靑狀香茶菜內醋A和靑狀香茶菜內醋B，英文名分別為 scopariusicide A和scopariusicide B;其中所述的半制備高效液相色譜分離條件是W體 積含量為80~90%的甲醇或體積含量為70~90%乙臘中任意一種為流動相，流速為2~ 3mL/min，W9.4X250mm，5皿的Zo;rbaxSB-C18反相制備柱為固定相，紫外檢測器檢測波長 為201~280nm，每次進樣10~100化，分別收集10~40min的色譜峰，多次累加后蒸干得到兩 種純的白色粉末； E、結構鑒定:通過測定D步驟所得的巧巾白色粉末狀化合物的一維、二維核磁共振、常規(guī) 和高分辨質譜波譜數據，得到該化合物的圖譜，經結構解析確定其分子結構，確定為新的不 對稱環(huán)下燒衍生物，分別命名為靑狀香茶菜內醋A和B。5. 藥物組合物，其包含權利要求1所述的不對稱環(huán)下燒衍生物靑狀香茶菜內醋A和B和 至少一種藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的不對稱環(huán)下燒衍生物靑狀香茶菜內醋A和B在制備免疫抑制藥物中 的應用。7. 權利要求1所述的不對稱環(huán)下燒衍生物靑狀香茶菜內醋A和B在制備抗免疫力低下的 相關疾病的藥物中的應用。
【文檔編號】C07D311/94GK105837550SQ201510808021
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年11月19日
【發(fā)明人】普建新, 周敏, 唐健維, 汪偉光, 杜雪, 孫漢董
【申請人】中國科學院昆明植物研究所