一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體來說，涉及細胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其是一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
造血干細胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)是血液系統(tǒng)中的成體干細胞，是一個異質(zhì)性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能。它是研宄歷史最長且最為深入的一類成體干細胞，對研宄各類干細胞，如腫瘤干細胞，具有重要指導(dǎo)意義。
[0003]幾十年來，造血干細胞在臨床上應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的治療，被證明是治療惡性血液疾病的有效方法。造血干細胞還被證明具有橫向分化能力，具有分化形成骨細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等多種細胞的潛能。所以，自體造血干細胞還被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和修復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的多種疾病的再生性修復(fù)治療。
[0004]然而，造血干細胞應(yīng)用于臨床存一個問題，單次收集過程獲得的骨髓細胞數(shù)量經(jīng)常不足以用于移植，因此經(jīng)常多次進行骨髓收集，該方法對病患者造成很大的損傷，并且容易產(chǎn)生交叉污染，細胞數(shù)量遠遠未達到臨床標(biāo)準(zhǔn)需要。
[0005]因此，一種快速，有效，安全的擴增造血干細胞的方法亟需被建立。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明解決了一個在體外擴增成體造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)用于臨床細胞數(shù)量達不到要求的主要問題。提供了一種體外快速制備自體造血干細胞的方法。
[0007]一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法:
(I)、自體血液的抽??；(2)、自體單核細胞的收集及分離；(3)、自體單核細胞的體外培養(yǎng)。
[0008]進一步的，無菌抽取自體血液100_200ml，密度梯度離心收集單核細胞，將自體單核細胞在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天，收集生成的自體造血干細胞。
[0009]進一步的，所述步驟(2)自體單核細胞的收集及分離方法為:密度梯度離心法，具體步驟如下:
1).取自體抗凝全血100ml，加入等體積PBS，充分混勻；
2).分裝到4個50ml提前各加入12.5ml淋巴細胞分離液(Ficoll)的離心管中；
3).700G，室溫離心 20min，緩升緩降(without breaking)；
4).抽取白膜細胞層，加入到裝有5ml RPMI1640的50ml離心管中；
5).加入45ml RPMI1640，260G，4°C離心 lOmin，廢棄上清液;
6).加入 50ml RPMI1640,180G，4°C離心 lOmin，廢棄上清液；
7).加入 50ml RPMI1640,110G，4°C離心 lOmin，廢棄上清液；
8).加入30ml RPMI 1640，備用。
[0010]所述自體單核細胞的收集及分離方法中使用離心機為Eppendorf centrifuge5810:水平轉(zhuǎn)子AT-4-62，離心半徑16cm。
[0011]所述步驟(3)自體單核細胞的體外培養(yǎng)方法為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)液為RPMI1640，向基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加添加物，所述添加物為人工合成的血細胞促成熟因子，培養(yǎng)基含有促紅細胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)終濃度為2_20ng/ml，優(yōu)選 10 ng/mlo
[0012]所述細胞培養(yǎng)液中的培養(yǎng)條件為:溫度為37°C和5%的C02。
[0013]進一步的，自體單核細胞的體外具體培養(yǎng)方法為:
1.1OOml自體全血經(jīng)淋巴細胞分離液分離，獲得約I X 18個單個核細胞；
2.將細胞懸浮于30mlRPMI 1640，細胞濃度為約1.5-2.0X 106/ml，加入終濃度10 ng/ml ΕΡ0，將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)；
3.培養(yǎng)24 小時后，加入 IL-3 1000IU/ml, 10 ng/ml EPO ；
4.在3-4 天，加入 30ml 新鮮 RPMI 1640 (總體積 60ml)，并加入 IL-6 1000IU/ml，10ng/ml EPO；
5.在5-6 天，加入 60ml RPMI 1640 (總體積 120ml)，并加入 10 ng/ml EPO ；
6.第七天檢測細菌真菌培養(yǎng)陰性；胎盤蘭染色檢驗活細胞>95%，并收集細胞懸液離心去上清后，再用生理鹽水洗滌2次即得高濃度的造血干細胞。
[0014]所述步驟3中IL-3 1000IU/ml，10 ng/ml EPO可加在步驟2中。
[0015]有益效果:
本發(fā)明通過對造血干細胞增殖過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子的調(diào)控，向培養(yǎng)基中添加促紅細胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)，提供了一種體外快速擴增自體造血干細胞的方法，所述方法簡單，快速，有效，安全性高。本發(fā)明所述方法擬采用在實驗室中對健康的HSCs進行擴增，供者只需從體內(nèi)提供更少量的造血干細胞，同時它為成體造血干細胞凍存和存儲提供可行性基礎(chǔ)。
[0016]【附圖說明】:
圖1:人血液單個核細胞EPO蛋白快速體外增殖后所得人自體造血干細胞CD34特異表型鑒定圖，(A)增殖前，(B)增殖后。
[0017]【具體實施方式】:
實施例1
(I)所有試劑及培養(yǎng)基(RPMI 1640 + 10 ng/ml EPO + 1000IU/ml IL-6)均在無菌條件下，在百萬級潔凈度的生物安全操作臺操作，低溫(4-10°C)條件下配制，經(jīng)0.22微米孔徑的濾膜過濾制成。
[0018](2)采集健康人血液100ml，使用密度梯度離心方法分離獲取血液單個核細胞。將獲得的單個核細胞以5X 16個/ml的密度，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，并向其中加入步驟(I)中配制的細胞培養(yǎng)液，在37 °〇和5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天從而獲得EPO蛋白快速誘導(dǎo)的自體造血干細胞。
[0019](3)所得自體造血干細胞轉(zhuǎn)化率的測定
1.流式細胞儀測定所得自體造血干細胞的CD34+細胞得率
2.將所得人自體造血干細胞移到EP管中，在1024轉(zhuǎn)/分鐘下常溫下離心5min。
[0020]3.去除上清液，每管加入400 μ I的封閉液(2%FCS，1%SA用PBS稀釋)重懸浮細胞沉淀。
[0021]4.向EP管中加入20 μ I的熒光標(biāo)志的⑶34單克隆抗體試劑?；靹蛑蠓旁诤诎堤幏跤?0min，后進行流式細胞儀分析，自動計算標(biāo)本中的CD34陽性細胞數(shù)量及百分比。結(jié)果見圖1。
【主權(quán)項】
1.一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法，包括: (I)、自體血液的抽?。?2)、自體單核細胞的收集及分離；(3)、自體單核細胞的體外培養(yǎng)，所述自體單核細胞的收集及分離采用密度梯度離心法，所述自體單核細胞的體外培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為RPMI1640。2.如權(quán)利要求1所述的一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基中還添加人工合成的血細胞促成熟因子。3.如權(quán)利要求2所述的一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法，其特征在于:所述人工合成的血細胞促成熟因子，含有促紅細胞生成素終濃度2-20ng/ml。4.如權(quán)利要求3所述的一種體外快速擴增人自體造血干細胞的方法，其特征在于:所述促紅細胞生成素終濃度為10 ng/mlo
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種體外快速制備人自體造血干細胞的方法，所述方法包括：1、自體血液的抽?。?、自體單核細胞的收集及分離；3、自體單核細胞的體外培養(yǎng)。所述自體單核細胞體外培養(yǎng)使用細胞培養(yǎng)基是RPMI1640，在培養(yǎng)基中添加人工合成的血細胞促成熟因子。本發(fā)明所述的人自體造血干細胞擴增方法在產(chǎn)量、純度、生產(chǎn)速度及安全性方面具有顯著優(yōu)勢。
【IPC分類】C12N5/0789
【公開號】CN104928245
【申請?zhí)枴緾N201510311177
【發(fā)明人】馮文峰, 黃鵬, 昌芒
【申請人】廣州思丹福生物科技有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月9日