一種褐飛虱基因NlABCB及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種褐飛虱基因NlABCB及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，該基因NlABCB具有SEQIDNo.1的DNA序列。該序列由1468個(gè)核苷酸堿基組成，包含一個(gè)由459個(gè)核苷酸構(gòu)成的完整的編碼框，編碼153個(gè)氨基酸殘基的小分子量蛋白。研究發(fā)現(xiàn)該基因與褐飛虱的消化取食、存活有關(guān)。構(gòu)建L4440?NlABCB的dsRNA載體，轉(zhuǎn)化E.coli HT115后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，形成NlABCB?dsRNA,喂養(yǎng)褐飛虱取食含NlABCB?dsRNA人工飼料，發(fā)現(xiàn)褐飛虱的存活率明顯降低。本發(fā)明將在作物育種，生物農(nóng)藥和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
一種褐飛虱基因 NIABCB及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種褐飛虱基因 N1ABCB及其編碼產(chǎn)物與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻(Oryza sativa)是世界的主要糧食作物之一，全球超過(guò)一半人口都以水稻作 為主食。專家估計(jì)到了 2025年，世界水稻的產(chǎn)量要比現(xiàn)在增長(zhǎng)60%才能夠滿足需要。我國(guó)是 水稻生產(chǎn)大國(guó)，水稻常年種植面積約3000萬(wàn)公頃，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻 的種植安全與與我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活密不可分。
[0003] 褐飛虱（Ni 1 apar vata 1 ugens Stil，BPH)屬同翅目飛虱科（Homop t era : Delphacidae)昆蟲(chóng)，又稱褐稻虱。褐飛虱主要通過(guò)吸取水稻韌皮部的汁液，最先受到傷害是 水稻的葉鞘組織，同時(shí)會(huì)引起葉片枯黃，分蘗枯萎，所以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸受到阻斷，同時(shí)導(dǎo) 致水稻受到一系列的生理方面的影響，包括植株的發(fā)育，水稻的產(chǎn)量等。被害稻田常先在田 中間出現(xiàn)"黃塘"，后出現(xiàn)"冒穿"或"虱燒"，嚴(yán)重時(shí)造成大幅度減產(chǎn)甚至顆粒無(wú)收。褐飛虱取 食、產(chǎn)卵，造成大量傷口，有利于病菌侵入，會(huì)加重紋枯病和小球菌核病發(fā)生和危害。水稻的 傷口大時(shí)，稻株因體內(nèi)汁液大量喪失而枯黃，飛虱在葉片或穗子上排出大量蜜露，還會(huì)影響 水稻光合作用，滋生霉菌，引起稻粒霉?fàn)€。當(dāng)大量褐飛虱取食水稻時(shí)，水稻的生長(zhǎng)發(fā)育受到 巨大影響，導(dǎo)致植株矮?。坏搅撕笃诰蜁?huì)形成半枯穗，導(dǎo)致整個(gè)植株枯萎傾倒。同時(shí)褐飛虱 在取食韌皮部的同時(shí)，會(huì)作為傳播紋枯病和矮桿病毒的載體，如果此時(shí)晚稻處在孕穗到蠟 熟的階段，那么由于褐飛虱危害所造成的損失將會(huì)十分慘重。
[0004] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)特異性地引起基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。高濃度的dsRNA才能保證靶標(biāo)基因的連續(xù) 抑制，那么利用體外合成的dsRNA來(lái)喂養(yǎng)昆蟲(chóng)成本相對(duì)昂貴。HT115菌株是RNaselll缺失體， RNaselll能降解細(xì)菌中絕大多數(shù)的dsRNA，那么利用基因工程菌大腸桿菌HT115表達(dá)dsRNA 是一個(gè)非常經(jīng)濟(jì)的方法產(chǎn)生大量的dsRNA。除此而外，細(xì)菌喂養(yǎng)也是一種非中斷技術(shù)保持處 理動(dòng)物的一致性。Timmons等是最早利用HT115生產(chǎn)的dsRNA喂食線蟲(chóng)使其體內(nèi)的革E1標(biāo)基因 抑制表達(dá)。利用大腸桿菌表達(dá)dsRNA已在昆蟲(chóng)桔小實(shí)繩(Bactrocera dorsalis)，甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)中得以實(shí)現(xiàn)。因此，至今為止，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有克隆到褐飛虱的相關(guān)靶 標(biāo)基因，可以通過(guò)人工喂養(yǎng)dsRNA沉默該基因而達(dá)到控制褐飛虱的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種褐飛虱基因 N1ABCB及其編碼產(chǎn) 物與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種褐飛虱基因 N1ABCB，它具有SEQ ID No.l的DNA序列。
[0008] 一種所述基因 N1ABCB的編碼蛋白，它包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或 者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或者添加 且具有與SEQ ID No.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在人工喂養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0010] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在作物育種中的應(yīng)用。
[0011] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0012] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是，通過(guò)對(duì)褐飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組分析，并結(jié)合褐飛虱基因組數(shù)據(jù) 庫(kù)獲得了N1ABCB基因全長(zhǎng)；構(gòu)建L4440-N1ABCB的dsRNA載體，轉(zhuǎn)化E. co 1 i HT115后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，形成NIABCB-dsRNA，喂養(yǎng)褐飛虱取食含NIABCB-dsRNA的人工飼料，分析N1ABCB基因在 RNAi沉默后，褐飛虱中N1ABCB mRNA的表達(dá)水平及相應(yīng)死亡率。該基因的分離克隆，對(duì)于作 物的抗蟲(chóng)育種，轉(zhuǎn)基因褐飛虱動(dòng)物培養(yǎng)，尤其對(duì)水稻的生物防治如生物農(nóng)藥的生產(chǎn)中將起 到重要的促進(jìn)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖l是RACE獲得的褐飛虱NlABCB基因電泳圖，圖中M為DL2000 DNAMarker，l-2泳 道為N1ABCB基因的5 ' cDNA片段和3 ' cDNA片段。
[0015] 圖2是L4440載體圖。
[0016] 圖3是L4440-NlABCB-dsRNA的電泳圖，圖中Μ為Markerlll，1-2泳道為L(zhǎng)4440和 L4440-NlABCB-dsRNA。
[0017] 圖4是是褐飛虱取食NIABCB-dsRNA后對(duì)其mRNA表達(dá)水平的抑制作用柱狀圖。
[0018] 圖5是褐飛虱取食NIABCB-dsRNA后對(duì)其存活率的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建褐飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序的方法獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， 在此基礎(chǔ)上獲得N1ABCB基因片段，以該基因序列為模板設(shè)計(jì)RACE引物。以提取的總RNA為模 板，使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。獲得N1ABCB CDS全長(zhǎng)序列并連接到pMD19- T克隆載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(ToplO)，搖菌，測(cè)序。隨后在N1ABCB CDS序列中選 取450bp長(zhǎng)度的片段設(shè)計(jì)合成L4440-N1ABCB，轉(zhuǎn)化E.coli HT115后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，形成 NIABCB-dsRNA，喂養(yǎng)褐飛虱取食含NIABCB-dsRNA的人工飼料，并用人工喂養(yǎng)對(duì)目的基因進(jìn) 行RNAi，檢測(cè)其對(duì)目的基因 mRNA表達(dá)水平抑制效果及對(duì)褐飛虱死亡率的影響。對(duì)該基因的 分離和克隆以及生物學(xué)功能的分析，對(duì)于轉(zhuǎn)基因褐飛虱動(dòng)物培養(yǎng)，水稻抗褐飛虱育種，以及 對(duì)采用生物農(nóng)藥抗蟲(chóng)起到重要的促進(jìn)作用。
[0020] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：
[0021] 1、N1ABCB基因的分離和序列分析
[0022]利用對(duì)褐飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，獲得表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，并篩選到N1ABCB基 因。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)此轉(zhuǎn)錄組序列并沒(méi)有覆蓋該基因的完整編碼區(qū)。為了獲得該片段的完整 編碼區(qū)序列，我們比對(duì)褐飛虱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)初步得到N1ABCB基因序列。以提取的總RNA為模 板，使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。獲得N1ABCB CDS全長(zhǎng)序列并連接到pMD19- T克隆載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(ToplO)，搖菌，挑取4個(gè)克隆送北京擎科公司測(cè)序， 每個(gè)分別測(cè)2次。測(cè)序結(jié)果，用NCBI Blast(http://www.ncbi .nlm.nih. gov/BLAST/)進(jìn)行序 列比對(duì)分析。獲得N1ABCB基因 DNA序列，見(jiàn)序列表SEQ ID No.l表示的序列和褐飛虱N1ABCB 基因電泳圖1。根據(jù)該序列的開(kāi)放閱讀框(0RF)，推算出該基因編碼蛋白的氨基酸序列，如 SEQ ID No. 2所示。該序列由1468個(gè)核苷酸堿基組成，包含一個(gè)由459個(gè)核苷酸構(gòu)成的完整 的編碼框，編碼153個(gè)氨基酸殘基的小分子量蛋白。
[0023] 2、褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達(dá)及其RNAi效果
[0024]以褐飛虱cDNA為模板，擴(kuò)增褐飛虱N1ABCB基因片段。由于L4440載體（圖2)包含兩 個(gè)相向排列的T7啟動(dòng)子，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，分別轉(zhuǎn)錄出（+ )和(-)ssRNA，然后形成dsRNAAlABCB 基因雙酶切連入L4440載體后，轉(zhuǎn)入菌株HT115后，便可表達(dá)dsRNA(圖3)。分別讓褐飛虱取食 NIABCB-dsRNA進(jìn)行RNAi。首先檢測(cè)褐飛虱取食dsRNA后，對(duì)其體內(nèi)N1ABCB mRNA表達(dá)水平的 影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):褐飛虱取食dsRNA后，第二天抑制了25%，第四天抑制達(dá)到48%。因此，褐飛 虱人工喂養(yǎng)取食dsRNA的方法的確可以誘導(dǎo)靶基因 RNAi，使靶基因表達(dá)被持續(xù)抑制，效果顯 著（圖4)。同時(shí)，褐飛虱取食dsRNA后，檢測(cè)N1ABCB基因沉默后對(duì)其的致死效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì) 照組和試驗(yàn)組1天、2天、3天、4天的存活率分別為88.77 %和86.67%、76.9 %和70.78%、 65.75 %和55.67 %、56.72 %和46.69 %。取食NIABCB-dsRNA后，其存活率顯著低于對(duì)照組。 因此N1ABCB基因可以進(jìn)一步應(yīng)用于褐飛虱抗蟲(chóng)（圖5)。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0026] 實(shí)施例1 :N1ABCB基因的獲得和序列分析
[0027] 1)使用總RNA提取試劑盒RNAiso P1 us提取褐飛虱總RNA。以提取的總RNA為模板， 使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。
[0028] 2)0uter PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 2min，20個(gè)循環(huán)后72°C再延伸1 Omin。Inner PCR反應(yīng)程序與以上程序一樣，只是改為30個(gè)循 環(huán)。
[0029] 3)PCR產(chǎn)物通過(guò)克隆入Takara公司pMD19-T載體獲得pMD19-NlABCB載體，轉(zhuǎn)入 ToplO大腸桿菌，將含PMD19-N1ABCB載體的ToplO菌液送北京擎科公司測(cè)序。用NCBI Blast (http: //www· ncbi · nlm· nih · gov/BLAST/)進(jìn)行序列比對(duì)分析，獲得序列表中的序列SEQ ID No.l。將此cDNA的基因命名為N1ABCB。
[0030] 實(shí)施例2:褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達(dá)及其RNAi效果
[0031] 第一步:褐飛虱L4440-N1ABCB原核表達(dá)載體
[0032] 1)片段的擴(kuò)增
[0033] 挑選高表達(dá)N1ABCB序列設(shè)計(jì)引物，上游引物加入Nco I位點(diǎn)，上游引物加入Sma I 位點(diǎn)。以褐飛虱cDNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，利用高保真酶K0D PLUS在25yL反應(yīng)體系中 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性2min，然后以28個(gè)循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94°C 15s，55°C 30s，68°C 30s)擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(碧云天，中國(guó)）純化后，利用普通Taq進(jìn)行加 A反 應(yīng)，連接轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆鑒定，將測(cè)序正確的片段質(zhì)粒用Nco I和Sma I雙酶切后，切膠純化 回收，放入4 °C備用。
[0034] 2)表達(dá)載體L4440雙酶切
[0035]將L4440質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli HT115菌株后劃線培養(yǎng)(含氨芐和四環(huán)素 LB固體培養(yǎng)基） 過(guò)夜，挑取單菌落于含氨芐和四環(huán)素 LB液體培養(yǎng)基37° 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，Nco I和Sma I雙酶切切膠純化回收。
[0036] 3)褐飛虱N1ABCB片段和表達(dá)載體L4440的連接反應(yīng)體系：雙酶切線性L4440質(zhì)粒，5 Μ1;雙酶切N1ABCB片段，3yL; 10 X連接緩沖液，1.2yL; T4DNA連接酶，lyL;雙蒸水，1.8yL; 4° 連接過(guò)夜。
[0037] 4)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli HT115(DE3)
[0038] 第二步:原核表達(dá)褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA和dsRNA的提取。
[0039] 1) dsRNA的誘導(dǎo)
[0040]取鑒定為E.coli HT115(DE3)陽(yáng)性克隆的菌種于含氨芐和四環(huán)素的LB固體平板劃 線，挑取單菌落于(含lOOyg/mL Amp、50yg/mL Tet)50ml LB液體培養(yǎng)基中，37°200rpm振蕩 培養(yǎng)過(guò)夜。次日按1:100體積取lml至含同樣抗生素的100ml LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)， 加入100yL的IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)3h后，用Trizol法提取dsRNA。
[0041 ] 2) dsRNA 的提取
[0042] 各取lmL培養(yǎng)的菌液，4°C，8000離心力離心5min，棄上清。然后加入lml TRIZ0L試 劑，旋禍劇烈振蕩lmin將菌體溶解，室溫下靜置5min。隨之加入200yL氯仿，用力振蕩20sec， 室溫孵育l〇min，4°C，8000離心力離心15min。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的Eppendorf管中。加入 500yL異丙醇，混合均勻，置于-20°放置30分鐘。4°C，8000離心力離心15min。棄上清，溶液中 加入500μ1 70%的乙醇沖洗沉淀3次(RNase Free dH20配制），4°C，8000離心力離心5min， 棄上清，室溫干燥。干燥RNA 5min，沉淀溶于30yL含10mmol/L Tris(pH = 7.5)，lmmol/L EDTA(TE)緩沖液中。
[0043] 第三步:人工喂養(yǎng)htL N1ABCB對(duì)褐飛虱N1ABCB mRNA表達(dá)及死亡率的影響
[0044] 將按上述誘導(dǎo)表達(dá)好的L4440-NlABCB-dsRNA的大腸桿菌htLNIABCB，在室溫條件 下富集菌體，按照250:1的比例添加 ddH20溶解富集的菌體，充分混勻。
[0045]挑選大小一致的褐飛虱三齡幼蟲(chóng)，放入直徑3cm離心管中，人工飼料用雙層封口膜 包住，離心管用黑布遮住，褐飛虱因趨光性到管口取食人工飼料，每l〇〇ul人工飼料添加 20ul菌液。每組挑選10頭，設(shè)置無(wú)菌液為對(duì)照，每天定時(shí)更換飼料和菌液，喂養(yǎng)4天，提取總 RNA，定量分析mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率。
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種褐飛虱基因 N1ABCB，其特征在于，它具有SEQ ID No.l的DNA序列。2. -種權(quán)利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB的編碼蛋白，其特征在于，它包含SEQ ID No. 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè) 氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID No.2的氨基酸殘基序列相同活性的由 SEQ ID No.2衍生的蛋白質(zhì)。3. -種權(quán)利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在人工喂養(yǎng)中的應(yīng)用。4. 一種權(quán)利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在作物育種中的應(yīng)用。5. -種權(quán)利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培養(yǎng)中的應(yīng)用。6. -種權(quán)利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK105838721SQ201610227151
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月13日
【發(fā)明人】游艾青, 閘雯俊, 周雷, 李三和, 楊國(guó)才, 陳志軍, 劉凱, 徐華山, 李培德
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所