水稻褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。通過將水稻抗蟲品系05BPH16(♂)與抗蚊青占(♀)雜交獲得的F2各單株的基因型，同時(shí)結(jié)合F2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級(jí)別進(jìn)行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品系05BPH16中抗性基因qBph30(t)的緊密連鎖分子標(biāo)記。本發(fā)明的分子標(biāo)記可以有效檢測抗蟲品系05BPH16及其衍生品種(系)中是否含有該抗性主效基因，快速提高抗褐飛虱水稻材料的選擇效率，獲得含有qBph30(t)基因的抗褐飛虱水稻品種。
【專利說明】水稻褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的 分子標(biāo)記及其在選育水稻抗褐飛虱品種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 稻褐飛風(fēng)（NilaparvatalugensStil.，簡稱BPH)屬于同翅目飛風(fēng)科 (Homoptera:Delphacidae)昆蟲，是水稻種植過程中最主要的蟲害之一。它具有刺吸式口 器，直接刺穿植株的維管束韌皮部攝取汁液中的可溶性糖類、無機(jī)鹽離子和氨基酸等營養(yǎng) 物質(zhì)，阻礙水稻植株正常生長，嚴(yán)重時(shí)整株死亡且顆粒無收，被稱為"飛虱火燒"；同時(shí)蟲體 做為病菌的媒介，傳播多種水稻病害，如病毒病、齒葉矮縮病和草叢矮縮病等。從20世紀(jì) 50年代開始褐飛虱對(duì)我國水稻生產(chǎn)為害的程度逐漸加劇，為害地域由南方水稻生產(chǎn)區(qū)域向 北方擴(kuò)展。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在1966、1969、1973、1977、1983等年份大爆發(fā)，而在 1987、1991、2003、2005、2006和2007年這幾年中我國水稻種植區(qū)發(fā)生全國性稻飛虱（主要 是褐飛虱）爆發(fā)，超過50%以上的水稻種植面積受到稻褐飛虱危害，對(duì)我國的水稻糧食生 產(chǎn)安全造成嚴(yán)重的威脅。
[0003]目前，使用化學(xué)殺蟲劑來控制褐飛虱危害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最主要的防治方法，這種 方法不僅加大了水稻生產(chǎn)成本，并且殺死褐飛虱天敵，容易引起褐飛虱的再爆發(fā)，同時(shí)對(duì)土 地、水體等生態(tài)因素造成污染，以及生物鏈中毒性的累積和相應(yīng)的人類健康問題；而利用寄 主植物的抗性基因，培育并推廣種植抗褐飛虱水稻品種是防治褐飛虱最為經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境 友好的方法。從早期的抗褐飛虱水稻品種Mudgo開始，研究人員培育了一批抗褐飛虱的品 種（系），如IR26、IR36、IR56和IR64等，這些抗蟲品種的推廣對(duì)控制褐飛虱的危害起到了 一定效果；但是，大面積推廣抗褐飛虱水稻品種引起了褐飛虱生物型的演變，攜帶抗性基因 的水稻品種會(huì)逐步喪失對(duì)褐飛虱的抗性。在新培育品種中引入抗性更強(qiáng)的基因或聚合多個(gè) 抗性基因的方式可以提高水稻品種的抗性水平和延長抗性持續(xù)的時(shí)間。由此也就需要挖掘 更多新的抗褐飛虱種質(zhì)資源，到2013年為止，在水稻中已報(bào)道了超過35個(gè)以上抗性位點(diǎn)， 其中超過28個(gè)抗褐飛虱主效基因被定位。目前分子標(biāo)記輔助選擇（MAS)已經(jīng)與傳統(tǒng)雜交 方法結(jié)合應(yīng)用于抗褐飛虱水稻品種的培育，通過基因聚合途徑來提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性 既可出于經(jīng)濟(jì)考慮，而且在生態(tài)和進(jìn)化方面可能也有很重要的價(jià)值。
[0004] 本研究利用構(gòu)建的雜交后代群體，對(duì)抗源05BPH16材料進(jìn)抗褐飛虱基因的定位， 獲得與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為水稻抗蟲分子育種提供抗源及有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的 分子標(biāo)記，可以有目的地進(jìn)行抗蟲基因的導(dǎo)入和聚合，以保證在水稻抗蟲育種中使用多樣 化的抗性資源，培育含有不同抗性基因的品種或含有多個(gè)抗性基因的品種以長期抵御不同 生物型的褐飛虱群體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的一種分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供上述分子標(biāo)記的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是提供的上述分子標(biāo)記在選育抗褐飛虱水稻中的用途。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] 水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標(biāo)記，其由下列引物對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得， 所述引物對(duì)的上游引物為SeqIDNO. 1所示的序列，所述引物對(duì)的下游引物為SeqIDN0. 2 所示的序列；
[0010] SeqIDNO. 1 ：5, -AGCCCAAATGGAACAAACAA-3J
[0011] SeqIDNO. 2 :5, -GCTCACGGTTAAGCAATGGT-3，。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記用于篩選水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的方 法，包括步驟：以待檢測的水稻基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，如果引物能夠擴(kuò)增出247bp的基因片段，說明待檢測的水稻存在抗褐飛虱主效基因 qBph30 (t)〇
[0013] 本發(fā)明公開了所述的分子標(biāo)記對(duì)在水稻輔助育種中的用途。
[0014] 另外，本發(fā)明還公開了一種篩選抗褐飛虱水稻品種的方法，其特征在于，使用權(quán)利 要求1中所述的分子標(biāo)記，以待檢測的水稻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并判斷是否能 擴(kuò)增出247bp的基因片段，如果能擴(kuò)增出所述247bp片段，則標(biāo)志著該待檢水稻為存在抗褐 飛虱主效基因qBph30(t)的抗性水稻材料。
[0015] 作為優(yōu)選，上述方法以待檢測的水稻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，可以通過 凝膠電泳檢測或測序的方式，判斷是否能擴(kuò)增出247bp的基因片段。
[0016] 本發(fā)明具各的有益效果
[0017] 1.通過本發(fā)明首次用SSR和STS標(biāo)記較精細(xì)定位了水稻品系05BPH16中攜帶的抗 褐飛虱主效基因qBph30(t)。
[0018] 2.通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的主效基因位點(diǎn)位置明確，鑒定方便。通過檢測與該 基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的褐飛虱抗性，用于水稻品種或品系的基 因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有褐飛虱抗性，進(jìn)而快速篩選抗蟲品種或品系用于 水稻育種。
[0019] 3.輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)抗蟲育種中，首先要收集具有抗蟲親 本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交，而且要對(duì)雜交后獲得的水稻材料進(jìn)行抗褐飛虱性狀的鑒定 并進(jìn)行選擇，操作復(fù)雜，同時(shí)還在很大程度上受環(huán)境的影響。此外，在進(jìn)行抗蟲鑒定之前，先 要獲得蟲源并飼養(yǎng)繁殖褐飛虱群體，同時(shí)還要求接種蟲源與水稻秧苗苗齡較同步，這同樣 給育種工作帶來麻煩，若不能有效地處理好蟲源、秧苗以及環(huán)境之間的關(guān)系，抗褐飛虱的表 型鑒定結(jié)果可靠性就很低。因此，抗蟲育種不僅費(fèi)時(shí)，而且難度大，成本高。然而，通過檢測 抗褐飛虱主效基因位點(diǎn)，可以在苗期就鑒定出高抗褐飛虱的單株，淘汰其他植株，不僅節(jié)約 生產(chǎn)成本而且大大提高抗褐飛虱水稻品種的選擇效率，極大地縮短抗蟲水稻品種的育種周 期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1.水稻品系05BPH16第4染色體短臂上的抗褐飛虱主效基因qBph30 (t)與分 子標(biāo)記QY14緊密連鎖關(guān)系。
[0021] 圖2.分子標(biāo)記QY14在親本及雜交后代單株中的PCR擴(kuò)增帶型。第1孔為抗蚊青 占，第2孔為05BPH16,第3至22點(diǎn)樣孔均為雜交育種后代單株。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和本質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023] 以下實(shí)施例中使用的儀器、試劑、試劑盒均可由市售得到；
[0024]QY14是基于日本晴和9311基因組相應(yīng)序列設(shè)計(jì)開發(fā)的一個(gè)分子標(biāo)記。
[0025] 實(shí)施例1:分子標(biāo)記的獲取
[0026](一）抗蚊青占/05BPH16F2群體構(gòu)建及表型鑒定
[0027] (1)抗源05BPH16是來源于高抗褐飛虱的廣西普通野生稻與栽培稻雜交、回交轉(zhuǎn) 育的抗性后代材料，抗蟲鑒定實(shí)驗(yàn)表明，05BPH16對(duì)取自廣西南寧市郊區(qū)水稻田的褐飛虱群 體具有高抗特性。為了尋找簡單有效且與qBph30(t)緊密連鎖的分子標(biāo)記，本發(fā)明以感蟲 品種抗蚊青占為母本，以抗褐飛虱品系05BPH16為父本雜交，得到的Fi再自交，從而構(gòu)建了 F2分離群體；每個(gè)F2單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系。
[0028] (2)采用苗期接種對(duì)親本、F2:3家系進(jìn)行抗蟲性鑒定。為確保親本和F2:3群體中 的每個(gè)家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個(gè)家系（品種）各50粒 種子播種于一個(gè)長45cm、寬35cm、高8cm，且盛有5cm厚營養(yǎng)土的鐵質(zhì)托盤中。每盤每個(gè) 材料播種2個(gè)重復(fù)，其中隨機(jī)播種親本和TN1 (感性對(duì)照）各2個(gè)重復(fù)。播種7天后，淘 汰病弱苗。待苗長到兩葉一芯期時(shí)，按8頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上 尼龍紗網(wǎng)。當(dāng)感蟲品種TN1全部死亡時(shí)，參照Qiu等（2010，High-resolutionmapping ofthebrownplanthopperresistancegeneBph6inriceandcharacterizingits resistanceinthe9311andNipponbarenearisogenicbackgrounds.TheorAppl Genet121:1601-1611)的方法對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行0、1、3、5、7或9級(jí)的抗性評(píng)價(jià)（表1)，對(duì)親 本材料和群體的每個(gè)家系通過加權(quán)平均計(jì)算該家系的抗性級(jí)別，并根據(jù)抗性級(jí)別推測此單 株基因型。
[0029] (二）抗蚊青占/05BPH16F2群體的分子標(biāo)記分析
[0030] (1)用CTAB法(Murray&Thompson, 1980Rapidisolationof high-molecular-weightplantDNA.NucleicAcidsRes8:4321-4325)提取親本及F2 群 體各單株的葉片基因組DNA。
[0031] (2)根據(jù)gramene網(wǎng)站（http://www.gramene.org/)公布的標(biāo)記按照較均勻的 遺傳距離選擇一定數(shù)目分子標(biāo)記。另外，基于該基因最后的定位區(qū)段，參考水稻品種日本 晴相應(yīng)的基因組序列，利用SSR搜索工具SSRIT(http://www.gramene.org/db/markers/ ssrtool)來尋找SSR基序，并根據(jù)其側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，為備選標(biāo)記。其中，SSRIT設(shè)置參 數(shù)為：最大基序長度為3聚體，最小重復(fù)數(shù)為5,搜索所有的SSR基序。選擇所有大于15個(gè) 堿基（基序長度X重復(fù)數(shù)）的SSR基序，最后，基于該基因后期的定位區(qū)段，比較測序水稻 品系9311與日本晴相應(yīng)的基因組序列，在兩者具有差異的區(qū)段設(shè)計(jì)STS標(biāo)記用于進(jìn)一步的 精細(xì)定位。
[0032] (3)SSR、STS標(biāo)記的分析參照Temnykh的方法（TemnykhSetal，2〇00.Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100 :697-712)。反應(yīng)體系組分如下：
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的分子標(biāo)記，其由下列引物對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得， 所述引物對(duì)的上游引物為Seq ID NO. 1所示的序列，所述引物對(duì)的下游引物為Seq ID NO. 2 所示的序列； Seq ID NO. 1 :5' -AGCCCAAATGGAACAAACAA-3， Seq ID NO. 2 :5, -GCTCACGGTTAAGCAATGGT-3，。
2. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記用于篩選水稻抗褐飛虱主效基因qBph30(t)的方法，其 特征在于，包括步驟：以待檢測的水稻基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1所述的引物對(duì)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，如果引物能夠擴(kuò)增出247bp的基因片段，說明待檢測的水稻存在抗褐飛虱主效基 因 qBph30 (t)。
3. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記對(duì)在水稻輔助育種中的用途。
4. 一種篩選抗褐飛虱水稻的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1中所述的分子標(biāo)記，以 待檢測的水稻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并判斷是否能擴(kuò)增出247bp的基因片段，如 果能擴(kuò)增出所述247bp片段，則標(biāo)志著該待檢水稻為存在抗褐飛虱主效基因qBph30 (t)的 抗性水稻材料。
5. 按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：以待檢測的水稻基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增后，可以通過凝膠電泳檢測或測序的方式，判斷是否能擴(kuò)增出247bp的基因片段。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328168SQ201410500123
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】李容柏, 邱永福, 覃寶祥, 焦曉真, 楊萌, 薛艷霞, 劉芳 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)