專利名稱：與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，特別涉及與水稻白背飛虱抗性基因相連鎖的分子標記及其獲得方法。
背景技術(shù)：
水稻白背飛風(Sogatella furcifera,Horvdth)是我國和東南亞水稻產(chǎn)區(qū)的主要害蟲之一，80年代以來，隨著我國高產(chǎn)雜交稻技術(shù)的推廣及可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)的作物生理因素，白背飛虱已成為水稻主要害蟲。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，在稻飛虱重發(fā)年份，受害面積超過我國水稻總面積的50%。1991年，我國發(fā)生的大范圍稻飛虱為害造成近16億公斤稻谷的損失，受害面積達2，933萬hm2 ；2005年稻飛虱又大爆發(fā)，加之與稻縱卷葉螟的疊加效應(yīng)，稻飛虱為害達2. 6億畝次以上。因此，對白背飛虱的防治已成為保障糧食生產(chǎn)的重要內(nèi)容。大面積種植的主要水稻品種不帶抗性基因，是白背飛虱爆發(fā)的內(nèi)在原因，加上化學肥料的大量施用，茂盛生長的感蟲水稻為白背飛虱的快速繁殖提供了充足的食源。長期以來，白背飛虱的防治主要是依靠施用化學殺蟲劑。然而，農(nóng)藥殺蟲劑的濫用，殺死了稻田中的稻飛虱天敵，反而誘發(fā)白背飛虱的再猖獗。另外，白背飛虱屬大范圍遷飛性害蟲，每年的水稻生長季節(jié)，白背飛虱隨春夏暖濕氣流，由南往北逐代逐區(qū)遷入我國稻區(qū)。白背飛虱發(fā)生初期，若蟲的蟲體小，隱蔽性強，不易被農(nóng)民發(fā)現(xiàn)，防治不及時使其得以大量繁殖，蟲害便得以流行；蟲害爆發(fā)的水稻成熟灌漿期，稻株長勢旺盛，將殺蟲劑施到稻株基部的操作非常困難，加上成蟲有很好的移動性和較強的抗藥性，結(jié)果屢屢造成危害和減產(chǎn)。水稻抗病蟲育種實踐證明，利用抗白背飛虱基因培育新品種是水稻白背飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟有效的方法。栽種的水稻品種即使只帶有中等水平的抗性基因，也足以將白背飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不會導(dǎo)致白背飛虱大爆發(fā)、或?qū)嶋H危害及產(chǎn)量損失。另一方面，隨著分子生物學的發(fā)展，使難以鑒定、易受環(huán)境影響的抗病蟲性狀采用分子輔助育種已成為可能，該技術(shù)不僅可在早代進行準確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服分離單株的顯隱性和純雜合問題，從而加速育種進程，提高育種效率，但該技術(shù)的基礎(chǔ)是必須擁有優(yōu)良的目標基因及與之緊密連鎖的分子標記。為實現(xiàn)上述任務(wù)，挖掘新的抗性基因，發(fā)展緊密連鎖的新標記成為水稻抗白背飛虱分子育種的關(guān)鍵。最早對水稻白背飛虱抗性開展分子定位研究的是McCouch，首先應(yīng)用 TNl (臺中本地I號)/IR36近等基因系將Wbphl定位到兩個RFLP標記RG146和RG445之間，但由于該RFLP標記是多拷貝標記，而難以用作選擇標記；此后，Wbph2和Wbph6(t)也先后被定位，但它們的遺傳距離分別為25. 6cM和21. 2cM，實際應(yīng)用仍有很大困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記及其開發(fā)方法，本發(fā)明所得的分子標記與白背飛虱抗性基因緊密連鎖，能用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，該分子標記引物選自下列任一引物對，其中的核苷酸序列為作為本發(fā)明的分子標記的改進觀401定位于水稻第4染色體上；Wbscal也定位于水稻第4染色體上(圖I)。本發(fā)明還提供了上述分子標記的開發(fā)方法，包括以下步驟I)、以粳稻品種春江06作為抗蟲基因供體親本與作為感蟲品種的臺中本地I號進行雜交，從而獲得作為雜交后代的抗蟲單株；2)、用 CTAB (十六燒基三乙基溴化銨，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide) 法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA ；3)、采用SSR(簡單重復(fù)序列，simple sequence repeat)和/或STS (序列標簽位點sequence-tagged site)分子標記方法進行水稻白背飛風抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM401和一個STS分子標記Wbscal。與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記RM401和Wbscal，具體是用下述方法得到的I)、抗蟲基因供體親本來自中國水稻研究所的粳稻品種春江06 (CJ06)，與感蟲品種普通秈稻品種臺中本地I號(TNl)進行雜交，抗、感蟲單株是通過雜交、回交和自交，獲得的抗、感蟲近等基因系用于配組和基因定位。2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA。3)、采用SSR和STS分子標記方法進行水稻白背飛虱抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM401和一個STS分子標記Wbscal，經(jīng)連鎖分析，發(fā)現(xiàn)這兩個標記與水稻抗白背飛虱基因相連鎖。采用SSR和STS分子標記進行篩選與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記的方(I)、SSR、STS引物在抗、感親本以及它們的雜交后代間DNA多態(tài)性分析用SSR標記技術(shù)篩選,采用根據(jù)Temnykh在2000年發(fā)表的分布于水稻12條染色體設(shè)計SSR引物，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR儀上進行PCR擴增，PCR 反應(yīng)體系為20ng/ul 水稻基因組DNA lul, 10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2. Oul，IOuM 引物 2. 0ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶 0. 2ul，ddH20 11. 8ul，總體系 20ul。 反應(yīng)程序95°C變性5分鐘；94變性I分鐘，55退火I分鐘，72延伸I分鐘，40個循環(huán)'72 補齊10分鐘；產(chǎn)物檢測在含有0. 5% ug/ul EB的4. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。用STS標記技術(shù)篩選，首先對基因組已完成測序的日本晴(http://rgp.dna.

RM401 正向TGGAACAGATAGGGTGTAAGGG 反向CCGTTCACAACACTATACAAGC ； Wbscal 正向CAATGTTAGTATCGATCTGCTCAT 反向TCCTTTGACAGAATGAAACACC。
法具體是affrc. go. jp)和 93-11 (http://www. rise, genomics, org. cn)的序列進行序列比對，根據(jù)日本晴和93-11序列比對的結(jié)果設(shè)計合適的引物用于CJ06和TNl的多態(tài)性篩選，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225 PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為20ng/ul水稻基因組 DNA lul, 10XPCR Buffer 2. 0ul,25mM MgCl2 2. 0ul,2mM dNTP 2.0ul，10uM 引物 2. 0ul，5U/ul TaqDNA 聚合酶 0. 2ul，ddH20 11. 8ul，總體系 20ul。反應(yīng)程序95°C變性 5 分鐘；94°C變性I分鐘，52°C退火I分鐘，72°C延伸I分鐘，40個循環(huán)；72°C 10分鐘；產(chǎn)物檢測在含有0. 5% ug/ul EB的4. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結(jié)果。(2)、分子標記的連鎖分析CJ06和TNl雙親及其后代的白背飛虱抗性鑒定在田間進行，在田間自然誘發(fā)條件下，于分蘗早期分別從遷入蟲數(shù)、蟲害發(fā)生密度和被害程度等方面對雙親及后代分離群體進行抗蟲性鑒定；分別提取抗蟲、感蟲單株的總DNA，用與前面同樣的反應(yīng)體系、篩選獲得的多態(tài)性引物及程序進行單株的PCR擴增，統(tǒng)計抗、感單株標記帶的出現(xiàn)頻率和交換類型并計算交換值，用MapnakerEXP3. Ob計算標記與抗蟲基因之間的遺傳距離。本發(fā)明還同時公開了上述分子標記的用途用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。本發(fā)明是用分子生物學方法以高抗白背飛虱水稻品種CJ06為材料，篩選和尋找新的、而且穩(wěn)定存在與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記及其方法，用于水稻白背飛虱抗性輔助選擇育種；由于研究所用的材料對白背飛虱表現(xiàn)高抗的特性，其對我國稻區(qū)的白背飛虱具有普遍的抗性。另外，根據(jù)所得分子標記也有助于水稻抗白背飛虱新基因的克隆。白背飛虱是危害水稻生產(chǎn)的主要蟲害。本發(fā)明是利用分子標記方法得到兩個新的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記。利用這種方法，不僅克服了常規(guī)育種方法所需時間周期長等缺點，可以有目標地將抗蟲基因在實驗室內(nèi)選擇獲得并有目的地進行多個抗性基因的聚合，從而培育出具有穩(wěn)定抗性的水稻新品種。同時，也可利用這兩個白背飛虱抗性基因分子標記，深入進行抗白背飛虱基因的克隆并對其進行結(jié)構(gòu)和功能分析，這對于進一步了解水稻抗白背飛虱的分子遺傳學機制有積極的意義。因此，本發(fā)明結(jié)果在水稻育種實踐及抗蟲理論研究上都有重要意義。其優(yōu)點具體歸納如下(I)本發(fā)明的與白背飛虱抗性基因緊密連鎖的分子標記，是在對水稻高抗白背飛虱的CJ06及其抗性穩(wěn)定的雜交后代單株中獲得的新標記，對水稻白背飛虱具有很強的抗性，而且穩(wěn)定存在，可用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。(2)本發(fā)明所用的材料高抗水稻白背飛虱，還有著較強的抗褐飛虱能力，具有普遍的抗蟲特性。因此，根據(jù)所得的分子標記有望克隆到新的白背飛虱抗性基因。(3)為克隆水稻白背飛虱抗性基因、基因序列分析以及轉(zhuǎn)抗白背飛虱基因水稻研究奠定了良好基礎(chǔ)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I是SSR分子標記RM401和STS分子標記Wbscal與抗蟲基因WBPH4間的遺傳距離示意圖2是檢測分子標記RM401與抗蟲性連鎖的分子標記的電泳譜帶圖；圖3是檢測分子標記Wbscal與抗蟲性連鎖的分子標記的電泳譜帶圖；圖4是分子標記RM401鑒定水稻品種白背飛虱抗性的電泳譜帶圖；圖5是SSR分子標記RM401輔助篩選獲得的3份抗蟲育種材料的電泳譜帶圖；圖6是分子標記Wbscal鑒定水稻品種白背飛虱抗性的電泳譜帶圖；圖7是STS分子標記Wbscal輔助篩選獲得的3份抗蟲育種材料的電泳譜帶圖；對上述圖I I中的符號分別作如下說明I代表抗蟲親本春江06 ；2代表感蟲親本TNl;3代表春江06/TN1的Fl植株；4,5,6均代表春江06和TNl雜交后代的抗蟲單株，此抗蟲單株是通過雜交后并自交，經(jīng)分子標記篩選后獲得；S代表不帶抗白背飛虱基因的雜交后代的感蟲單株；P1-P5分別指抗蟲水稻材料嘉花I號、秀水04、農(nóng)虎6號、輻709、單209 ；P6-P10分別指感蟲水稻材料珍汕97B、農(nóng)墾58、IR26、靈峰、金南鳳。
具體實施例方式實施例I、用SSR分子標記獲得與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記RM401 具體做法是抗蟲基因供體親本來自中國水稻研究所的粳稻品種春江06 (CJ06)， 與感蟲品種普通秈稻品種臺中本地I號(TNl)進行雜交，自交獲得F2分離群體，從該群體后代中鑒定得到85株隱性個體(即，表現(xiàn)為感蟲的個體)用于連鎖關(guān)系分析。一、提取 DNAI)、配制DNA提取緩沖液按順序依次加I 體積的 DNA 提取溶液(0. 35M sorbitol ；0. IM Tris, pH8. 2 ； 0. 005MEDTA ;其余為水)，I 體積的核裂解液(0. 2M Tris, pH7. 5 ；0. 05M EDTA ；2M NaCl ； 0. 055MCTAB ;其余為水)和0. 4體積的5% (質(zhì)量濃度)sarkosyl溶液(即十二酰-N-甲基甘氨酸鈉的水溶液);最后加入亞硫酸氫鈉，配制成DNA提取緩沖液；亞硫酸氫鈉在DNA提取緩沖液中的終濃度為0. 02M。2)、對上述CJ06、TNl和85株抗蟲隱性個體的水稻葉片分別進行如下處理①、稱取0. Ig的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入700 U I的上述步驟I)配制的DNA提取緩沖液，65°C水浴40分鐘。再加700 的氯仿異戊醇(24 I的體積比)， 并混勻。10，OOOrpm離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。②、在上述步驟①離心后所得的上清液中加2/3 I倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。13，OOOrpm離心8分鐘,倒出上清液。③、再用70% (體積濃度)的己醇200 U I洗滌上述步驟②所得的DNA沉淀物。④、將上述洗滌后的DNA涼干并溶于100 U I TE緩沖液或純水中。⑤、紫外分光光度法檢測上述步驟④所得的DNA樣品的濃度，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。完整合適的DNA用于PCR擴增，不完整的DNA則重新提取，直至獲得完整的DNA。
二、SSR 分析
根據(jù)Temnykh在2000年發(fā)表的分布于水稻12條染色體上的SSR引物序列，委托上海申能博彩公司合成引物90對，具體如表I所示
表I.合成的90對SSR引物序列
引物名稱左翼引物序列右翼引物序列
RM428AACAGATGGCATCGTCTTCCCGCTGCATCCACTACTGTTGRM151GGCTGCTCATCAGCTGCATGCGTCGGCAGTGGTAGAGTTTGATCTGCRM259TGGAGTTTGAGAGGAGGGCTTGTTGCATGGTGCCATGTRM493TAGCTCCAACAGGATCGACCGTACGTAAACGCGGAAGGTGRM9GGTGCCATTGTCGTCCTCACGGCCCTCATCACCTTCRM488CAGCTAGGGTTTTGAGGCTGTAGCAACAACCAGCGTATGCRM128AGCTTGGGTGATTTCTTGGAAGCGACGACGAGGAGTCGCCGTGCAGRM486CCCCCCTCTCTCTCTCTCTCTAGCCACATCAACAGCTTGCRM472CCATGGCCTGAGAGAGAGAGAGCTAAATGGCCATACGGTGRM14CCGAGGAGAGGAGTTCGACGTGCCAATTTCCTCGAAAAARM233CCAAATGAACCTACATGTTGGCATTGCAGACAGCTATTGARM53ACGTCTCGACGCATCAATGGCACAAGAACTTCCTCGGTACRM145CCGGTAGGCGCCCTGCAGTTTCCAAGGACCCCATCCTCGGCGTCRM324CTGATTCCACACACTTGTGCGATTCCACGTCAGGATCTTCRM341CAAGAAACCTCAATCCGAGCCTCCTCCCGATCCCAATCRM475CCTCACGATTTTCCTCCAACACGGTGGGATTAGACTGTGCRM263CCCAGGCTAGCTCATGAACCGCTACGTTTGAGCTACCACGRM240CCTTAATGGGTAGTGTGCACTGTAACCATTCCTTCCATCCRM250GGTTCAAACCAAGCTGATCAGATGAAGGCCTTCCACGCAGRM535ACTACATACACGGCCCTTGCCTACGTGGACACCGTCACACRM22GGTTTGGGAGCCCATAATCTCTGGGCTTCTTTCACTCGTCRM545CAATGGCAGAGACCCAAAAGCTGGCATGTAACGACAGTGGOSR13CATTTGTGCGTCACGGAGTAAGCCACAGCGCCCATCTCTCRM251GAATGGCAATGGCGCTAGATGCGGTTCAAGATTCGATCRM473DTATCCTCGTCTCCATCGCTCAAGGATGTGGCGGTAGAATGRM16CGCTAGGGCAGCATCTAAAAACACAGCAGGTACGCGCRM426ATGAGATGAGTTCAAGGCCCAACTCTGTACCTCCATCGCCRM55CCGTCGCCGTAGTAGAGAAGTCCCGGTTATTTTAAGGCGRM520AGGAGCAAGAAAAGTTCCCCGCCAATGTGTGACGCAATAGRM422TTCAACCTGCATCCGCTCCCATCCAAATCAGCAACAGCRM570GTTCTTCAACTCCCAGTGCGTGACGATGTGGAAGAGCAAGRM335GTACACACCCACATCGAGAAGGCTCTATGCGAGTATCCATGGRM456BTTGTAGTCCGGGTCGTAACCGATAGAATAGGGAGGGGGGGRM471ACGCACAAGCAGATGATGAGGGGAGAAGACGAATGTTTGC.RM564CATGGCCTTGTGTATGCATCATGCAGAGGATTGGCTTGAGRM252TTCGCTGACGTGATAGGTTGATGACTTGATCCCGAGAACGRM241GAGCCAAATAAGATCGCTGATGCAAGCAGCAGATTTAGTGRM255TGTTGCGTGTGGAGATGTGCGAAACCGCTCAGTTCAACRM280ACACGATCCACTTTGCGCTGTGTCTTGAGCAGCCAGGRM413GGCGATTCTTGGATGAAGAGTCCCCACCAATCTTGTCTTCRM437ACACCAACCAGATCAGGGAGTGCTCGTCAATGGTGAGTTC
權(quán)利要求
1.與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，其特征是所述分子標記引物選自下列任一引物對，其中的核苷酸序列為5' —3'，RM401 正向TGGAACAGATAGGGTGTAAGGG 反向CCGTTCACAACACTATACAAGC ；Wbscal 正向CAATGTTAGTATCGATCTGCTCAT 反向TCCTTTGACAGAATGAAACACC。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，其特征是所述 RM401定位于水稻第4染色體上；所述Wbscal定位于水稻第4染色體上。
3.如權(quán)利要求I或2所述的分子標記的開發(fā)方法，其特征是包括以下步驟1)、以粳稻品種春江06作為抗蟲基因供體親本與作為感蟲品種的臺中本地I號進行雜交，從而獲得作為雜交后代的抗蟲單株；2)、用CTAB法提取水稻親本幼苗及雜交后代幼苗基因組DNA；3)、采用SSR和/或STS分子標記方法進行水稻白背飛虱抗性分子標記的篩選；4)、篩選出一個SSR分子標記RM401和一個STS分子標記Wbscal。
4.如權(quán)利要求I或2所述的分子標記的用途，其特征是用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與水稻抗白背飛虱基因相連鎖的分子標記，以水稻作為物種，分子標記引物選自下列任一引物對，其中的核苷酸序列為5′→3′，RM401正向TGGAACAGATAGGGTGTAAGGG，反向CCGTTCACAACA CTATACAAGC；Wbsca1正向CAATGTTAGTATCGATCTGCTCAT，反向TCCTTTGACAGAATGAAACACC。RM401定位于水稻第4染色體上；Wbsca1定位于水稻第4染色體上。本發(fā)明還同時公開了上述分子標記的開發(fā)方法。該分子標記用于水稻白背飛虱抗性品種的鑒定和水稻抗蟲后代的輔助選擇育種。
文檔編號C12Q1/68GK102586240SQ20121004539
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉堅, 張光恒, 曾大力, 朱麗, 李家洋, 胡興民, 胡江, 董國軍, 郭龍彪, 錢前, 顏美仙, 高振宇 申請人:中國水稻研究所