一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。該分離培養(yǎng)方法包括：將口腔黏膜上皮組織采用胰酶消化后，再采用中性蛋白酶消化，終止消化后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得口腔黏膜上皮干細(xì)胞。本發(fā)明提供的分離培養(yǎng)方法可有效緩解酶劇烈消化組織對(duì)細(xì)胞的損傷，從而可獲得更多數(shù)量且活力高的口腔黏膜上皮干細(xì)胞。
【專利說明】
_種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分禹培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口腔頌面外科的許多疾病在手術(shù)之后常常遺留下需要修復(fù)的口腔創(chuàng)面。皮片移植雖然耐磨，但手術(shù)后往往收縮較嚴(yán)重，且即使處于口腔內(nèi)的環(huán)境，它也會(huì)出現(xiàn)毛發(fā)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，并不會(huì)完全化生為口腔黏膜。此外，與利用周圍的口腔黏膜移植相比較，移植區(qū)在相容性和顏色上也不如口腔黏膜移植的效果好。更讓病人難以接受的是在供區(qū)常有一些不適和并發(fā)癥的發(fā)生。黏膜移植是處于它的自然環(huán)境中，因此是更為合適的，但口腔自身可提供的組織量是非常有限的，且需開辟第二術(shù)區(qū)。近年來，組織干細(xì)胞的研究已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)，口腔黏膜上皮干細(xì)胞的成功培養(yǎng)有可能為構(gòu)建全新的人工黏膜組織帶來希望，從而解決以上難題。
[0003]目前，常用的口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法為:取部分正常人頰部黏膜標(biāo)本，將黏膜組織置于0.25%的胰酶中，4°C消化過夜，Hanks液輕洗3次，剝?nèi)ケ砥?，用滴管吹打成單?xì)胞懸液，過濾除去大塊組織和碎片，吸去細(xì)胞懸液用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活力的計(jì)算，然后接種于塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)條件為頂DM+10 %胎牛血清，37°C，5 %CO2。培養(yǎng)6h后，輕輕棄去懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。3天一換液。
[0004]張嵐在《兔口腔黏膜上皮干細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建組織工程黏膜的初步研究》中報(bào)道了一種兔口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具體為:
[0005]I)兔口腔黏膜上皮的獲取
[0006]取健康家兔，雌雄不限，體重0.5?1.0kg，耳緣靜脈注射空氣處死?？谇火つど掀ぜ?xì)胞的取材:0.5%碘伏消毒口腔，無菌操作取出兔雙側(cè)頰黏膜置于生理鹽水中送往潔凈間。超凈工作臺(tái)上用含慶大霉素2000U/mL的PBS液浸泡口腔黏膜10分鐘，再用含青霉素、鏈霉素(各100U/mL)的PBS漂洗3次。PBS沖洗后體視顯微鏡下用眼科剪盡量去除黏膜下組織，然后將組織塊置于含0.25%中性蛋白酶Dispase的無菌瓶中。4°C冰箱中消化16?18小時(shí)后，在體視顯微鏡下用眼科鑷分離表皮，即可得到包含基底層的較純的口腔黏膜上皮組織。
[0007]2)兔口腔黏膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)
[0008]將分離下的口腔黏膜表皮組織分為相等兩份，用眼科剪剪碎，用0.25%胰蛋白酶-
0.02 %EDTA等量混合消化液進(jìn)行消化。37 °C消化5?8分鐘后加入DMEM(含10 %FBS)終止胰蛋白酶消化。100rpm離心5分鐘，棄上清、PBS洗滌。第一組培養(yǎng)液為上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，第二組培養(yǎng)液為Defined K-SFM。兩組細(xì)胞分別加入不同培養(yǎng)液，吹打消化的組織和細(xì)胞，使其分散游離，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中。血球板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，臺(tái)盼蘭活細(xì)胞染色，然后以15個(gè)/mL的細(xì)胞數(shù)接種到培養(yǎng)皿。第二天換液去除未貼壁細(xì)胞，以后隔日換液。
[0009]然而，上述口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中分離的干細(xì)胞數(shù)量少，活力不高。因此，如何獲得更多數(shù)量且活力高的口腔黏膜上皮干細(xì)胞成為研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。該分離培養(yǎng)方法可獲得更多數(shù)量且活力高的口腔黏膜上皮干細(xì)胞。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0012]本發(fā)明提供了一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0013]將口腔黏膜上皮組織采用胰酶消化后，再采用中性蛋白酶消化，終止消化后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得口腔黏膜上皮干細(xì)胞。
[0014]作為優(yōu)選，胰酶消化的溫度為4°C，時(shí)間為12?18h。
[0015]優(yōu)選地，胰酶消化的時(shí)間為12h。
[0016]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，胰酶為胰酶質(zhì)量百分含量為0.25%的胰酶-EDTA。
[0017]作為優(yōu)選，中性蛋白酶消化的溫度為37°C，震蕩轉(zhuǎn)速為200?500rpm，時(shí)間為15?30mino
[0018]優(yōu)選地，中性蛋白酶消化的震蕩轉(zhuǎn)速為200rpm，時(shí)間為15min。
[0019]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，中性蛋白酶為中性蛋白酶質(zhì)量百分含量為0.25%的消化液。
[0020]作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
[0021]作為優(yōu)選，無血清培養(yǎng)基的配方為L(zhǎng)onza培養(yǎng)基。
[0022]作為優(yōu)選，終止消化采用含血清的完全培養(yǎng)基。
[0023]作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)的接種密度為(I?10)X 13個(gè)/cm2。
[0024]優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)的接種密度為IX 14個(gè)/cm2。
[0025]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，細(xì)胞培養(yǎng)為:將細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后，在37°C、5%CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，第二天換液、去除貼壁細(xì)胞，以后隔日換液，共培養(yǎng)7?14天。
[0026]本發(fā)明提供了一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。該分離培養(yǎng)方法包括:將口腔黏膜上皮組織采用胰酶消化后，再采用中性蛋白酶消化，終止消化后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得口腔黏膜上皮干細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果為:
[0027]1、本發(fā)明提供的分離培養(yǎng)方法中消化方式采用先用胰酶消化，再采用中性蛋白酶進(jìn)行消化，可有效緩解酶劇烈消化組織對(duì)細(xì)胞的損傷，從而可獲得更多數(shù)量且活力高的口腔黏膜上皮干細(xì)胞；
[0028]2、本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，有效避免血清對(duì)細(xì)胞帶來的外源污染。
【附圖說明】
[0029]圖1示試驗(yàn)組分離的細(xì)胞原代生長(zhǎng)形態(tài)；
[0030]圖2示口腔黏膜上皮干細(xì)胞的活力檢測(cè)結(jié)果；
[0031]圖3示口腔黏膜上皮干細(xì)胞的流式鑒定結(jié)果;其中圖3-1、3-2、3_3為對(duì)照組流式鑒定結(jié)果，3-1示空白對(duì)照，3-2示⑶90、⑶45的表達(dá)情況，3_3示⑶73、HLA_DR的表達(dá)情況；圖3-
4、3-5、3-6為樣品組流式鑒定結(jié)果，3-4示空白對(duì)照，3_5示⑶90、⑶45的表達(dá)情況，3_6示CD73、HLA-DR的表達(dá)情況；
[0032]圖4示口腔黏膜上皮干細(xì)胞的成脂分化鑒定結(jié)果；
[0033]圖5示口腔黏膜上皮干細(xì)胞的成骨分化鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明公開了一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0035]術(shù)語解釋:
[0036]間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新、增殖能力強(qiáng)，及多向分化能力的干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。在口腔粘膜上皮細(xì)胞中，存在少量的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞常見的表面標(biāo)記物，并存在多向分化的能力；
[0037]中性蛋白酶(Dispase)，也稱為分散酶，是一種非特異性的金屬蛋白酶，被用來從各種不同組織或器官中消化細(xì)胞外基質(zhì)，釋放并制備原代單細(xì)胞;或用于細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞收獲或接種轉(zhuǎn)移;也被用于防止懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞意外結(jié)團(tuán)。
[0038]本發(fā)明提供的口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中所用生物材料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0039]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0040]實(shí)施例1
[0041 ](一)分離培養(yǎng)口腔黏膜上皮干細(xì)胞
[0042]試驗(yàn)分為試驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2:
[0043]1、試驗(yàn)組的分離培養(yǎng)口腔黏膜上皮干細(xì)胞的方法為:
[0044]取正常人頰部黏膜組織，置于含青霉素、鏈霉素(各100U/mL)生理鹽水中，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，在無菌操作臺(tái)中，將黏膜組織轉(zhuǎn)移置含青霉素、鏈霉素(各100U/mL)的PBS中清洗2-3次;將黏膜組織放置在0.25 %胰酶-EDTA中，放置在4°C冰箱中消化12小時(shí)后，在顯微鏡下用眼科鑷去除表皮，得到口腔黏膜上皮組織。再用含0.25%中性蛋白酶Dispase在37°C，200rpm恒溫震蕩消化15min，用無血清完全培養(yǎng)基(含血清替代物)終止中性蛋白酶消化。100rpm離心5分鐘，棄上清、PBS洗滌。加入上皮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù)血球板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，臺(tái)盼蘭進(jìn)行活細(xì)胞染色，計(jì)算細(xì)胞活力與數(shù)量，然后以14個(gè)/cm2的細(xì)胞數(shù)接種到培養(yǎng)皿。第二天換液去除未貼壁細(xì)胞，以后隔日換液。7-14d左右在顯微鏡下能觀察到克隆的形成，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%匯時(shí)，0.125 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。圖1為細(xì)胞原代生長(zhǎng)形態(tài)，形態(tài)符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0045]2、對(duì)照組I的分離培養(yǎng)口腔黏膜上皮干細(xì)胞的方法為:
[0046]取部分正常人頰部黏膜標(biāo)本，將黏膜組織置于0.25%的胰酶中，4°C消化過夜，Hanks液輕洗3次，剝?nèi)ケ砥ぃ玫喂艽荡虺蓡渭?xì)胞懸液，過濾除去大塊組織和碎片，吸去細(xì)胞懸液用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活力的計(jì)算，然后接種于塑料培養(yǎng)瓶，接種密度為14個(gè)/cm2，培養(yǎng)條件為頂DM+10 %胎牛血清，37°C，5 %CO2。培養(yǎng)6h后，輕輕棄去懸浮細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)滿瓶底大部分后，胰酶消化，常規(guī)傳代。3天一換液。原代細(xì)胞的形態(tài)與圖1相近，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0047]3、對(duì)照組2的分離培養(yǎng)口腔黏膜上皮干細(xì)胞的方法為:
[0048]I) 口腔黏膜上皮的獲取
[0049]取部分正常人頰部黏膜標(biāo)本，用含慶大霉素2000U/mL的I3BS液浸泡口腔黏膜10分鐘，再用含青霉素、鏈霉素(各100U/mL)的PBS漂洗3次。PBS沖洗后體視顯微鏡下用眼科剪盡量去除黏膜下組織，然后將組織塊置于含0.25%中性蛋白酶Dispase的無菌瓶中。4°C冰箱中消化16小時(shí)后，在體視顯微鏡下用眼科鑷分離表皮，即可得到包含基底層的較純的口腔黏膜上皮組織。
[0050]2) 口腔黏膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)
[0051 ]將分離下的口腔黏膜表皮組織分為相等兩份，用眼科剪剪碎，用0.25 %胰蛋白酶-
0.02%EDTA等量混合消化液進(jìn)行消化。37 V消化8分鐘后加入DMEM(含10 % FBS)終止胰蛋白酶消化。100rpm離心5分鐘，棄上清、PBS洗滌。第一組培養(yǎng)液為上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，第二組培養(yǎng)液為Defined K-SFM。兩組細(xì)胞分別加入不同培養(yǎng)液，吹打消化的組織和細(xì)胞，使其分散游離，重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中。血球板計(jì)算細(xì)胞數(shù)，臺(tái)盼蘭活細(xì)胞染色，然后以14個(gè)/cm2的細(xì)胞數(shù)接種到培養(yǎng)皿。第二天換液去除未貼壁細(xì)胞，以后隔日換液。原代細(xì)胞的形態(tài)與圖1相近，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
[0052](二)細(xì)胞活力檢測(cè)試驗(yàn)
[0053]將試驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2中原代分離的細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，結(jié)果見圖2。
[0054]如圖2所示，試驗(yàn)組分離的原代細(xì)胞活力高于對(duì)照組I和對(duì)照組2中的細(xì)胞活力。
[0055](三)口腔黏膜上皮干細(xì)胞Pl代細(xì)胞的流式鑒定
[0056]當(dāng)試驗(yàn)組Pl代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%?90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后收集細(xì)胞，取兩個(gè)
1.5mL EP管，每管2 X 15個(gè)細(xì)胞，用染色緩沖液(10 %胎牛血清+90 %PBS)洗兩遍，每管加入200yL染色緩沖液，樣品分別加入下列四個(gè)抗體⑶90、⑶73、HLA-DR、⑶45各2yL，陰性對(duì)照不加抗體，4°C孵育20min，用染色緩沖液洗兩遍，后用500yL DMEM培養(yǎng)基重懸，用流式細(xì)胞儀采集100000個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)⑶90、⑶73、HLA-DR、⑶45等在豬脂肪干細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果見圖3。
[0057]從圖3的結(jié)果可以看出，樣品高表達(dá)⑶73、CD90;低表達(dá)HLA-DR、CD45，符合口腔上皮干細(xì)胞特性，本發(fā)明可獲得純度較高的口腔黏膜上皮細(xì)胞。
[0058](四)成脂分化鑒定
[0059]收集試驗(yàn)組P3代的上皮干細(xì)胞，以IX 103/cm2的細(xì)胞密度接種于24孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時(shí)，換用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2-3天更換新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，2周之后采用油紅O染色檢測(cè)成脂分化結(jié)果。圖4為成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化(X 200)。
[0060]由圖4可見，在體外向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞形態(tài)從成纖維狀，縮短成為短梭形，誘導(dǎo)15d后可見大多數(shù)細(xì)胞充滿紅色的油滴空泡。
[0061](五)成骨分化鑒定
[0062]收集試驗(yàn)組P3代的上皮干細(xì)胞，分別以IX 103/cm2的細(xì)胞密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至60?70 %融合時(shí)，換用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每3天更換新鮮的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，3周之后采用茜素紅染色檢測(cè)成骨分化結(jié)果。結(jié)果見圖5。
[0063]由圖5可以看出，口腔黏膜上皮干細(xì)胞在體外成骨誘導(dǎo)分化過程中，21天時(shí)可見明顯的礦化結(jié)節(jié)，用茜素紅染色可將其形成的鈣結(jié)節(jié)染成紅色。
[0064]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種口腔黏膜上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: 將口腔黏膜上皮組織采用胰酶消化后，再采用中性蛋白酶消化，終止消化后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，獲得口腔黏膜上皮干細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述胰酶消化的溫度為4°C，時(shí)間為12?18h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述胰酶為胰酶質(zhì)量百分含量為0.25%的胰酶40丁八。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述中性蛋白酶消化的溫度為37°C，震蕩轉(zhuǎn)速為200?500rpm，時(shí)間為15?30min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述中性蛋白酶為中性蛋白酶質(zhì)量百分含量為0.25 %的消化液。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基的配方為L(zhǎng)onza培養(yǎng)基。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述終止消化采用含血清的完全培養(yǎng)基。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)的接種密度為(I?10) X 14個(gè)/cm2 O10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)為:將細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后，在37°C、5%C02條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，第二天換液、去除貼壁細(xì)胞，以后隔日換液，共培養(yǎng)7?14天。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK105861426SQ201610338840
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】陳海佳, 王飛, 王一飛, 葛嘯虎, 馮德龍
【申請(qǐng)人】廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司