一種食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及干細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)，尤其是涉及一種食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和成體干細(xì)胞(Adult Stem Cells, ASCs)。胚胎干細(xì)胞的增殖與分化是構(gòu)成個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)，由單個(gè)的受精卵發(fā)育成具備各種組織器官的個(gè)體;而成體干細(xì)胞可進(jìn)一步分化為復(fù)雜的組織器官，其研究幾乎涉及所有的生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具有光明的發(fā)展前景。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類:全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。干細(xì)胞(Stem Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。干細(xì)胞是機(jī)體生長和發(fā)育的起源細(xì)胞，具有持久自我更新、高度增殖分裂、多向分化潛能和對疾病損傷具有反應(yīng)能力的細(xì)胞群體。由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性和功能，使之成為生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域最引人注目的研究熱點(diǎn)之一。
[0003]食管的黏膜上皮是由一群復(fù)雜而有高度組織化的未角化復(fù)層扁平上皮排列而成。食管上皮可分為兩個(gè)帶:一是基底帶，包括幾層小的嗜堿性細(xì)胞，另一是分化帶，包括多層規(guī)則排列的分化的鱗狀上皮。基底帶中貼緊基底膜的一層細(xì)胞稱為基底層，覆蓋其上的數(shù)層稱上皮基底層。在解剖學(xué)上基底層可以進(jìn)一步的分為兩種成分:一種是扁平的稱乳頭間基底層(the interpapillary basal layer，IBL)，另一種是覆蓋在乳頭表面的，稱乳頭基底層(the papillary basal layer，PBL)。只有基底帶的細(xì)胞才有分化能力，并且這種分化是以細(xì)胞從基底層移向食管腔面完成的，細(xì)胞的迀移、分化起始與分化標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果有關(guān)。相對于IBL，PBL中的細(xì)胞分裂是比較均勾的，可產(chǎn)生2個(gè)子細(xì)胞緊貼基底膜，相反地，在IBL中細(xì)胞分裂本質(zhì)上是不均勻的，其細(xì)胞分裂主要發(fā)生于基底膜的右角，產(chǎn)生一個(gè)停留于基底層的子細(xì)胞及一個(gè)進(jìn)入基底上層的子細(xì)胞。因此，IBL中的細(xì)胞就相當(dāng)于食管上皮干細(xì)胞。
[0004]研究表明，人食管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法研究較多，但目前未有研究食管上皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的報(bào)道。食管上皮干細(xì)胞具有旺盛的增殖分化能力，在維持食管粘膜屏障結(jié)構(gòu)、功能的完整性、以及食管粘膜的損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。而食管干細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立，對于研究食管粘膜的增生與分化細(xì)胞以及食管腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其包括以下步驟: 步驟1、取食管黏膜組織及附著的上皮，去除肌肉組織，取黏膜上皮組織的基底層并將其剪成碎片，消化離心，將獲得的細(xì)胞鋪于包被有基質(zhì)的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中；
步驟2、加入添加有10?20mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(HEPES)、2?5mmol/L碳酸氫鈉、2?5mmol/L L-谷氨酸、體積分?jǐn)?shù)2?5%的胎牛血清(FBS)、20?30ng/mL人表皮生長因子(EGF)、3?6mg/mL胰島素、50?150mmol/L氫化可的松、0.05?0.2mg/mL霍亂弧菌毒素、4?6mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、20?40mg/mL牛垂體提取物(BPE)、0.01?0.02mmol/L類維生素A、8?25mmol/L細(xì)胞信號通路抑制劑的DMEM/Ham’s F-12培養(yǎng)液；
步驟3、將含有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿放入37°C孵箱中培養(yǎng)，2?3天可見到細(xì)胞貼壁，之后隔天更換一次培養(yǎng)液以去除雜質(zhì)細(xì)胞的影響，10?14天即可形成單層上皮干細(xì)胞。
[0007]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟I中，消化的方法是:將碎片加入含有0.1?0.3%膠原酶I型、0.1?0.3%鏈酶蛋白酶和0.5?1.0mg/ml脫氧核糖核酸酶I的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，37°C恒溫消化2?4h，離心后過濾，即得細(xì)胞。
[0008]進(jìn)一步地，上述的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，還含有10?20mg/ml牛血清蛋白(BSA)，以保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械和酶作用的損傷，還有去毒化的作用。
[0009]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟I中，包被在培養(yǎng)瓶上的基質(zhì)為膠原酶、牛血清白蛋白中的一種或兩種組合。
[0010]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟I中，培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿包被的方法為:加入含0.1?0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA )和/或30?50ug/mL膠原酶I的EBSS培養(yǎng)液，完全覆蓋培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿底部即可，在37°C恒溫孵箱中孵育I?2小時(shí)，孵育完后吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗3?5次。由于包被的基質(zhì)中含有膠原酶和蛋白等成分，能促進(jìn)干細(xì)胞較快地貼壁和生長。
[0011]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟2的培養(yǎng)液中，細(xì)胞信號通路抑制劑含有:濃度為5?1mM的ROCK1、濃度為I?5mM的TGF-β抑制齊ljA83_01、濃度為I?5mM的BMP抑制劑DMHl、濃度為I?5mM的GSK抑制劑CHIR99021。
[0012]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟2的培養(yǎng)液中還含有抗生素，抗生素為0.25?0.5mg/mL兩性霉素B和200?400mg/mL青霉素/鏈霉素液。
[0013]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其步驟2中的培養(yǎng)液中添加有12?16mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(HEPES)、3?4.5mmol/L碳酸氫鈉、3?4.5mmol/LL-谷氨酸、體積分?jǐn)?shù)2?4%的胎牛血清(FBS)、23?27ng/mL人表皮生長因子(EGF)、4?5.5mg/mL胰島素、70?130mmol/L氫化可的松、0.1?0.18mg/mL霍亂弧菌毒素、4.5?5.5mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、25?35mg/mL牛垂體提取物(BPE)、0.01?0.02mmol/L類維生素A、10?20mmol/L細(xì)胞信號通路抑制劑。
[0014]一種食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)液，其為添加有10?20mmol/L 4_羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(HEPES)、2?5mmol/L碳酸氫鈉、2?5mmol/L L-谷氨酸、體積分?jǐn)?shù)2?5%的胎牛血清(FBS)、20?30ng/mL人表皮生長因子、3?6mg/mL胰島素、50?150mmol/L氫化可的松、0.05?0.2mg/mL霍亂弧菌毒素、4?6mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、20?40mg/mL牛垂體提取物(BPE)、
0.01?0.0211111101/1類維生素4、8?25_01/1細(xì)胞信號通路抑制劑的01^]\1/他111’8 F-12培養(yǎng)液。
[0015]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)液中，細(xì)胞信號通路抑制劑含有:濃度為5?1mM的ROCK1、濃度為I?5mM的TGF-β抑制劑A83-01、濃度為I?5mM的BMP抑制劑DMHl、濃度為I?5mM的GSK抑制劑CHIR99021。
[0016]上述的食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)液中，其還含有抗生素，抗生素為0.25?
0.5mg/mL兩性霉素B和200?400mg/mL青霉素/鏈霉素液。
[0017]由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性:
由于人食管上皮組織分離獲得的干細(xì)胞數(shù)量較少，易分化和凋亡亦將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此食管干細(xì)胞原代培養(yǎng)較難獲得成功。本發(fā)明通過對細(xì)胞信號通路抑制劑和培養(yǎng)液的成分及用量的合理選擇和配合，分離培養(yǎng)得到了原代食管干細(xì)胞，培養(yǎng)液利用微量成分相輔相成、綜合作用，具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖和分裂，利于細(xì)胞貼附及抑制間質(zhì)細(xì)胞的干擾，細(xì)胞信號通路抑制劑能夠促進(jìn)干細(xì)胞增殖，抑制多向分化潛能，延續(xù)細(xì)胞活性，穩(wěn)定遺傳。
[0018]本發(fā)明的分離方法，其操作簡便，安全性好，分離得到食管上皮干細(xì)胞，干細(xì)胞的活性高，在組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景良好。
【附圖說明】
[0019]圖1是人體正常食管干細(xì)胞成功培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)和生物標(biāo)記的鑒定；圖中，A為人體正常食管上皮干細(xì)胞在P12的明視野圖像，左側(cè)是10x放大，右側(cè)是200x放大，左、右側(cè)的scale bar分別為100 mM和50mM;B為人體正常食管上皮干細(xì)胞(P12)的熒光免疫圖片，分別顯示了表達(dá)P63、S0X2、CK5等常規(guī)食管干細(xì)胞的表達(dá)因子，scale bar為50mM;
圖2是小鼠正常食管干細(xì)胞成功培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)和b1marker的鑒定；圖中，A為小鼠正常食管干細(xì)胞在P2和P20的明視野圖像，scale bar為100mM;B為小鼠正常干細(xì)胞(P12)的熒光免疫圖片，分別顯示表達(dá)P63、S0X2、CK5常規(guī)食管干細(xì)胞的表達(dá)因子，scale bar為50 mM；圖3是多次傳代后小鼠正常食管干細(xì)胞的分化功能鑒定；圖中，A為分化組織的H&E圖片;B為熒光免疫圖片，顯示了分化組織具有正常的生物分化標(biāo)記P63和CK13，scale bar為
20 mMo
【具體實(shí)施方式】
[0020]參照以下實(shí)施例可以對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明；但是，以下實(shí)施例僅僅是例證，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
[0021 ] 實(shí)施例1
人食管上皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定 1.1分咼培養(yǎng)
(1)、取材:無菌條件下切除69歲男性的棄置的食管正常上皮組織，置于內(nèi)含青霉素100ug /mL和鏈霉素100 ug/mL的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)/生理鹽水溶液的無菌管內(nèi)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室；
(2)、分離:用含200yg/mL青霉素/鏈霉素的PBS沖洗食管上皮組織3?5遍，并去除出血組織、壞死組織及纖維血管組織;在超凈工作臺下，用無菌眼科剪、眼科鑷將組織修剪成
0.5?Imm3的小塊，而后加入含有0.1%膠原酶I型、0.1%鏈霉蛋白酶和0.5mg/ml脫氧核糖核酸酶I的消化液的離心管中，再將離心管放入37°C培養(yǎng)箱恒溫消化2h，之后消化混合液通過200目細(xì)胞篩過濾后離心，100rpm離心5min后棄上清，收集細(xì)胞沉淀。
[0022](3)、將細(xì)胞鋪于包被過的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿在使用前先用含
0.1mg/mL BSA和30ug/mL膠原酶I的EBSS培養(yǎng)液包被2.5小時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次。
[0023](4)、并添加含有15 mmol/L HEPES、3.6 mmol/L碳酸氫鈉、4 mmol/L L-谷氨酸、體積分?jǐn)?shù)2%的FBS、20ng/mL EGF、3mg/mL胰島素、60mmol/L氫化可的松、0.lmg/mL霍亂弧菌毒素、4mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、20mg/mL ΒΡΕ、0.01_01凡類維生素4、51111]101/1^的1?00(丨、I mmol/L 的TGF-β抑制劑A83-01、2mmol/L 的BMP抑制劑DMHl、lmmol/L的GSK抑制劑CHIR99021 的DMEM/Ham’s F-12培養(yǎng)液。
[0024](5)、將含有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿放入37°C孵箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長情況，并拍照記錄，通常干細(xì)胞2?3天即可貼壁，10?14天可形成單層上皮干細(xì)胞。
[0025](6)、以后每天觀察細(xì)胞生長情況和培養(yǎng)液的顏色變化，同時(shí)觀察培養(yǎng)液是否有污染，每2?3天換液一次，以滿足細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)。
[0026]1.2 鑒定:
對分離培養(yǎng)得到的干細(xì)胞進(jìn)行鑒定:包括形態(tài)學(xué)鑒定和功能鑒定。
[0027](I)、形態(tài)學(xué)鑒定
在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
[0028](2)、免疫熒光鑒定干細(xì)胞B1marker
制備細(xì)胞爬片，細(xì)胞長滿至70 %?80 %融合時(shí)取出，用4%