甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法，采用傳統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外，還采用家蠶（Bombyx mori）生物反應(yīng)器表達(dá)系統(tǒng)對(duì)TPO進(jìn)行表達(dá)，家蠶生物反應(yīng)器作為新型桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在醫(yī)藥制備方面發(fā)揮了重大的作用，展示了廣闊的應(yīng)用前景，方法成功構(gòu)建了帶有綠色熒光基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDMY?IG?TPO，利用Tn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)分別轉(zhuǎn)座到帶有病毒基因組的asd基因缺失的大腸桿菌受體菌AcMultiBac/rSW106?inv+asd?和BmMultiBac/rSW106?inv+asd?中，用重組AcMultiBac/rSW106/pFBDMY?IG?TPO菌液感染昆蟲細(xì)胞Spodoptera frugiperda 9（Sf9），得到重組病毒Ac/TPO?IG，利用家蠶幼蟲或蠶蛹表達(dá)蛋白，不僅顯著降低成本、增加蛋白表達(dá)量，活性也大大提高。
【專利說明】
甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于白蛋表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺，能分泌甲狀腺素(T4)，三碘甲狀腺原氨酸(T3)等激 素，這些激素受由腺垂體分泌的促甲狀腺素(TSH)的調(diào)節(jié)，在人體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞代謝和體 內(nèi)激素平衡，以及對(duì)維持糖、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝，骨骼肌和各器官系統(tǒng)的發(fā)育都起著十分 重要的調(diào)節(jié)作用。甲狀腺功能紊亂為內(nèi)分泌疾病中最常見者，至今并仍易被漏診，據(jù)美國(guó)對(duì) 11個(gè)城市4.6萬人的普查發(fā)現(xiàn)，約11%的人存在未被診斷出的各種甲狀腺功能紊亂。甲狀腺 功能紊亂分為甲狀腺功能充進(jìn)癥（hyperthyroidism，簡(jiǎn)稱甲充）和甲狀腺功能減退癥 (hy po thy r 〇 i d i sm，簡(jiǎn)稱甲減）。
[0003] 甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，ΤΡ0)是一種含有血紅素輔基的膜結(jié)合 糖蛋白，整個(gè)分子分為膜內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)和膜外區(qū)，cDNA全長(zhǎng)3 kb，跨膜區(qū)的存在使TPO在表達(dá) 時(shí)難以分泌出來，伸向充滿膠質(zhì)濾泡腔的部分具有催化活性。TPO作為甲狀腺激素合成過程 中的一種重要酶，能催化碘的活化、甲狀腺球蛋白上酪氨酸殘基的碘化及碘化酪氨酸殘基 的偶聯(lián)，最終生成甲狀腺素（T3、T4) JPO也是甲狀腺微粒體（thyroid microsomal，TM)的主 要抗原成分，當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變，濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞時(shí)，TPO于甲狀腺濾泡細(xì)胞腔的邊 緣即甲狀腺細(xì)胞頂部向外周血遺漏，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生TPO抗體(TPO-Ab) JPO抗體通 過激活補(bǔ)體、抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和致敏的T殺傷細(xì)胞直接殺傷等作用，引起甲 狀腺濾泡損傷，間接地抑制甲狀腺素的合成，導(dǎo)致甲狀腺功能減退。
[0004] 自身免疫性甲狀腺疾病(Autoimmune thyroid diseases，AITD)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的 器官特異自身免疫性疾病，患者血清內(nèi)存在多種針對(duì)甲狀腺抗原的自身抗體，甲狀腺過氧 化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)就是其中最重要的一種，普遍存在于 自身免疫性甲狀腺疾病中，血清中甲狀腺過氧化物酶抗體水平的測(cè)定，是對(duì)自身免疫性甲 狀腺疾病高危人群篩查、診斷和治療的有效手段。因此，TPO-Ab水平的檢測(cè)可用于對(duì)甲減、 AITD等甲狀腺疾病的診斷、病程進(jìn)展、用藥和愈后觀察。對(duì)于AITD的診斷，TPO-Ab檢測(cè)較甲 狀腺微粒體抗體(TM-Ab)檢測(cè)特異、直接和靈敏可靠，是診斷AITD的一項(xiàng)不可缺少的實(shí)驗(yàn)室 指標(biāo)，國(guó)際上已將TPO-Ab水平作為AITD-個(gè)重要的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。對(duì)原發(fā)性甲減患者，結(jié)合 hTSH升高，可以發(fā)現(xiàn)早期甲減病人。TPO-Ab的測(cè)定還可作為Graves病、橋本甲亢等診斷和鑒 別診斷的首選指標(biāo)，所以，對(duì)以TPO抗原為基礎(chǔ)的高效、低成本的甲狀腺疾病檢測(cè)試劑盒的 開發(fā)顯得尤為重要。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外所用的抗原都來自進(jìn)口，成本較高（10000元/mg)，且較難訂貨，主要 以羅氏公司生產(chǎn)抗體為多，有關(guān)TPO制備的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)也很少，只有4~5篇文獻(xiàn)。由于它分子量 大、糖基化修飾及磷酸化修飾非常豐富等的限制性，使它在大腸桿菌中難以表達(dá)，目前還是 以傳統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備ΤΡ0,1993年，HAUBRUCK等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對(duì)重組人甲 狀腺過氧化物酶進(jìn)行表達(dá)，分別將TPO的全長(zhǎng)cDNA和可溶性TPO(缺失C端跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)87 個(gè)氨基酸，并在C端增加含有親和配體6 XHis的融合蛋白）的序列克隆到桿狀病毒表達(dá)載 體，并轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda 9，Sf9)細(xì)胞。結(jié)果，含全長(zhǎng)cDNA的重組TPO 蛋白在Sf9細(xì)胞內(nèi)主要以不可溶的形式存在，重組可溶性TPO幾乎完全分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基 中。對(duì)全長(zhǎng)的TPO和可溶性的TPO利用方便特異的親和層析法純化，并測(cè)試了它們的抗TPO抗 體的自身抗原性，用純化后的可溶性TPO作為抗原建立的ELISA實(shí)驗(yàn)顯示它在篩選自身免疫 甲狀腺疾病病人血清中抗TPO抗體的特異性，可行性，和可重復(fù)性，在人甲狀腺中得到可溶 性TPO和天然TPO的高度相關(guān)性，以此得到的抗原能明確的檢測(cè)出病態(tài)血清，一致性達(dá)91%。
[0006] Jones等研究了重組免疫原性的甲狀腺過氧化物酶在High Five昆蟲細(xì)胞系中的 高水平表達(dá)，將編碼膜外區(qū)的DNA序列克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBac III的多角體強(qiáng) 啟動(dòng)子下，并插入到AcMNPV基因組中，分別在兩個(gè)昆蟲細(xì)胞系，Sf9和High Five細(xì)胞中調(diào) 查重組TPO的表達(dá)水平，通過放射免疫性鑒定和SDS-PAGE及Western blot分析，這兩個(gè)細(xì)胞 系都能夠表達(dá)重組TPO蛋白，但High Five細(xì)胞的表達(dá)水平更高(30 mg/L培養(yǎng)基），并對(duì)培養(yǎng) 基中的TPO進(jìn)行純化和糖基化及免疫原性分析，凝集素親和印跡和糖苷酶處理發(fā)現(xiàn)高甘露 糖和復(fù)合型糖殘留這兩個(gè)都與重組蛋白相關(guān)，基于生物素標(biāo)記的ELISA和基于 125I標(biāo)記的 免疫沉淀反應(yīng)研究表明重組TPO和天然TPO對(duì)TPO自身抗體具有相同的活性， TPO的糖基化可能會(huì)破壞自身耐受性，然而，純化后糖基化的重組TPO膜外功能區(qū)是解 釋它在橋本氏甲狀腺炎中角色的先決條件，2013年，Liu等就TPO的糖基化對(duì)血清中甲狀腺 過氧化物酶抗體的識(shí)別是否有影響做了研究，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了 重組TPO膜外功能區(qū)蛋白，用ELISA分析了它的抗原性，重組TPO膜外功能區(qū)蛋白能夠被所有 的54個(gè)橋本氏甲狀腺炎病人血清和3個(gè)TPO單克隆抗體識(shí)別，海藻糖，唾液酸和半乳糖都能 在重組TPO膜外功能區(qū)蛋白上檢測(cè)出來，用高碘酸去糖基化后，血清TPO-Ab結(jié)合試驗(yàn)只有輕 微的減少，研究說明，High Five昆蟲細(xì)胞來源的重組TPO膜外功能區(qū)蛋白有N-糖基化位 點(diǎn)，但是它在血清TPO-Ab抗體識(shí)別中幾乎沒有影響。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)常用的表達(dá)系統(tǒng)： 1.大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用最廣，也是表達(dá)單個(gè)蛋白的首選系統(tǒng)，能在較短時(shí)間內(nèi)獲得表 達(dá)產(chǎn)物，方便快捷，可在載體構(gòu)建中引入合適標(biāo)簽以便于目標(biāo)產(chǎn)物的純化和檢測(cè)，但由于缺 乏翻譯后加工能力，許多真核來源蛋白復(fù)合物在原核中難以正確裝配或者裝配后無功能活 性，且對(duì)大片段目的基因難以翻譯表達(dá)，甲狀腺過氧化物酶序列較大，在原核中難以表達(dá)。
[0008] 2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠?qū)ζ渌磉_(dá)的外源蛋白進(jìn)行多種修飾，使其能 夠形成正確的天然構(gòu)象。但目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)尚不成熟，細(xì)胞生長(zhǎng)表達(dá)周期長(zhǎng)，生 產(chǎn)工藝不易操控，限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。
[0009] 3.植物表達(dá)系統(tǒng) 通過轉(zhuǎn)基因植物實(shí)現(xiàn)外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)雖然已經(jīng)比較成熟，已經(jīng)發(fā)展了多種 載體構(gòu)建方式和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，但是因?yàn)闄C(jī)制太復(fù)雜容易產(chǎn)生基因沉默，且利用植物表達(dá) 系統(tǒng)表達(dá)較多的是植物自身蛋白質(zhì)。
[0010] 4.昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 目前，甲狀腺過氧化物酶的表達(dá)也基本上都是在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，桿狀病毒 表達(dá)系統(tǒng)之所以能得到廣泛的應(yīng)用。盡管桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是由于病毒 自身的特點(diǎn)，該表達(dá)系統(tǒng)也有它的不足之處：昆蟲細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的糖基化修飾與哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的的糖基化修飾還有一些差異；昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基需要添加胎牛血清，且桿狀病毒對(duì)宿 主細(xì)胞感染的最終結(jié)果是導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，所以在實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)時(shí)，每一輪實(shí)驗(yàn)，都 需要重新培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使該系統(tǒng)的成本大大增加。
[0011] 5.桿狀病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng) 雖然傳統(tǒng)桿狀病毒(AcMNPV)表達(dá)系統(tǒng)能夠介導(dǎo)病毒顆粒在離體培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 裝配，但其培養(yǎng)成本依然較高，需嚴(yán)格的無菌培養(yǎng)環(huán)境和價(jià)格昂貴的血清和培養(yǎng)基。且大規(guī) 模發(fā)酵培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞技術(shù)還不成熟，導(dǎo)致用培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)病毒樣顆粒存在成本高、效率低 等不足之處。
[0012] 為提高桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)（BEVS)中重組蛋白的分泌水平，東京大學(xué) Futatsumori . Sugai等[19]在家蠶SPl基因的信號(hào)肽的基礎(chǔ)上，通過向其N末端區(qū)域引入堿 性氨基酸(精氨酸)或向其C末端區(qū)域引入極性氨基酸(天冬酰胺），設(shè)計(jì)了幾種新的信號(hào)肽， 將人白細(xì)胞介素 IL-4、IL-13以及IL-Il受體alphal(IL-llR alphal)的胞外區(qū)域分別與SPl 信號(hào)肽及改造后的SPl信號(hào)肽融合，然后采用ELISA方法逐一測(cè)試了這些信號(hào)肽對(duì)重組蛋白 分泌的提升效果。結(jié)果顯示，在N末端區(qū)域引入精氨酸并未促進(jìn)重組蛋白的分泌，但在C末端 區(qū)域引入天冬酰胺則提高了重組蛋白的分泌水平。該項(xiàng)研究提示，在桿狀病毒表達(dá)載體系 統(tǒng)中，信號(hào)肽C末端區(qū)域的極性氨基酸對(duì)于重組蛋白的分泌至關(guān)重要。家蠶皮下注射接種要 求技術(shù)高，需預(yù)防細(xì)菌感染，而且接種工作量大，效率低下，即使操作熟練的人員也很難在 短時(shí)間內(nèi)完成大規(guī)模接種，往往會(huì)錯(cuò)過病毒接種的最佳時(shí)機(jī)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種甲狀腺過氧化物酶 表達(dá)方法，該表達(dá)方法TPO蛋白在家蠶-桿狀病毒中的表達(dá)量和活性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)桿狀病 毒，活性大約是昆蟲細(xì)胞表達(dá)的12.3倍，是TPO蛋白大量制備的最優(yōu)表達(dá)系統(tǒng)。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案:該甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法，其特征 在于按下述步驟操作： 1) .TPO基因的克隆 ① 引物設(shè)計(jì)合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位點(diǎn)，下游添加 Sal I位點(diǎn)， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TPO用LaTaq酶PCR擴(kuò)增； ③ 瓊脂糖電泳檢測(cè)，檢測(cè)正確者用膠回收試劑盒回收； 2) . T載體連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證 為了方便測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增序列是否正確，將PCR回收產(chǎn)物連接到到pBackzero-T載體上。
[0015] ①連接； ② 轉(zhuǎn)化到TOPlO感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落； ③ 菌液PCR驗(yàn)證； ④ 酶切驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證陽性的克隆，提質(zhì)粒做酶切驗(yàn)證； ⑤測(cè)序，酶切驗(yàn)證正確的T-TPO; 3) .轉(zhuǎn)移載體pFBDMY-TPO-IG的構(gòu)建 質(zhì)粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSCl上的Spe I位點(diǎn)，命名為pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位點(diǎn)之間插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，是mRNA分子內(nèi)（而非5'端)可被核糖體識(shí)別并啟動(dòng)翻譯 的一種順式元件，eGFP轉(zhuǎn)移到病毒基因組表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在病毒轉(zhuǎn)染和感染時(shí)起 報(bào)告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表達(dá)； 將測(cè)序正確的T-TPO和pFBDMY-IRES-eGFP分別用EcoR I/Sal I酶切，回收，連接，PCR 驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證，連接體系由如下試劑構(gòu)成:載體回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 連接混合物16°C反應(yīng)3 h，其余與T載體的構(gòu)建方法相同； 4) . Tn7位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座 齡制備 AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和 BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-轉(zhuǎn)座感受態(tài)； _轉(zhuǎn)座； 5) .重組病毒菌液感染Sf9昆蟲細(xì)胞 將構(gòu)建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 蟲細(xì)胞： ① 將 PCR 驗(yàn)證陽性的 AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液（2~3 個(gè)菌落)接種到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培養(yǎng)基，于32°C 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜;無 菌條件下分別取I mL菌液至滅菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm離心3 min，棄上清，用 無菌水重懸洗滌三次，洗掉菌液中DAP;最后無菌條件下用I mL無血清無雙抗的Grace培養(yǎng) 基重懸沉淀，再用雙無 Grace培養(yǎng)基稀釋成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板為例，前一天將生長(zhǎng)狀態(tài)良 好的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)移到六孔板，隔夜培養(yǎng)，細(xì)胞密度為70%~80%時(shí)，吸出培養(yǎng)基，每孔加入I mL 雙無 Grace(無血清，無雙抗)稀釋后的菌液，做好標(biāo)記，四小時(shí)后，吸走上清，加入I mL完全 Grace培養(yǎng)基，三天后焚光檢測(cè)； ② 將前一步驟①中獲得的細(xì)胞上清作為Pl代重組桿狀病毒，連續(xù)傳代Pl代病毒，獲得 P2、P3代重組桿狀病毒； 6) 重組病毒菌液注射家蠶或重組病毒口服感染家蠶，生產(chǎn)重組病毒粒子Bm/TP〇-IG和 Bm/TP〇-IG/IH。
[0016] ELISA檢測(cè)抗原活性 收集觀察有綠色熒光的Sf 9細(xì)胞，離心收集上清，用裂解液將細(xì)胞沉淀裂解。觀察有綠 色熒光的家蠶，從尾部取其血淋巴，解剖，棄中腸，將外皮粉碎。分別取細(xì)胞上清，在酶標(biāo)儀 上波長(zhǎng)450 nm處讀取數(shù)據(jù)。
[0017]載體的構(gòu)建 I) TPO的擴(kuò)增 以購(gòu)買的pGEM3Zf_TP0質(zhì)粒為模板，引物TP0E5El、TP0SalR，用LaTaq進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂 糖凝膠電泳見圖1。由圖1可見，擴(kuò)得約2500 bp的目的片段，也可見非特異性雜帶，屬于非特 異性擴(kuò)增，切膠，用膠回收試劑盒回收目的片段，克隆至T載進(jìn)行序列測(cè)定。
[0018] 2) pBackZero-T-TPO 酶切驗(yàn)證 將TPO回收片段與PBackZero-T載連接，因 PBackZero-T是一種陽性克隆率極高而背景 極低的PCR產(chǎn)物克隆（TA Cloning)專用載體，幾乎能達(dá)到99%，不需藍(lán)白斑篩選，不需菌落 PCR驗(yàn)證，可直接提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。pBackZero-T載體大小是3100 bp左右，酶切驗(yàn)證電泳圖 見圖2。由圖2可看出，pBackZero-T-TPO連接驗(yàn)證正確，送公司測(cè)序；目的條帶位置正確，較 亮，故先切膠凍存，如果測(cè)序正確，直接回收利用。
[0019] 3)測(cè)序結(jié)果 送去華大基因公司測(cè)序的pBackZero-T-TPO序列經(jīng)過NCBI網(wǎng)站BLAST比對(duì)和DNAMAN軟 件分析，TPO序列完全正確，沒有發(fā)生突變，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0020] 4) pFBDMY-TP〇-IG菌液PCR檢測(cè) 以設(shè)計(jì)的TP0E5El、TP0SalR為引物，轉(zhuǎn)化后的pFBDMY-TP〇-IG菌液為模板做菌液PCR檢 測(cè)，結(jié)果見圖3。1_9號(hào)是分別以9個(gè)單菌落搖起的菌液為模板的擴(kuò)增產(chǎn)物，10號(hào)為陰性對(duì)照， 11號(hào)為陽性對(duì)照，陽性對(duì)照是以驗(yàn)證正確的質(zhì)粒PBackZero-T-TPO為模板，陰性是以水為模 板，由圖3可見，1、2、3、4和6號(hào)為陽性，擴(kuò)得到2500 bp左右的片段，說明TPO基因可能已經(jīng)連 接到轉(zhuǎn)移載體上，取1、2和3號(hào)菌液接菌提質(zhì)粒進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0021] 5) pFBDMY-TP〇-IG酶切驗(yàn)證 取上述菌液PCR驗(yàn)證陽性的1、2和3號(hào)菌液接菌提質(zhì)粒，用EcoR I/Sal I酶切驗(yàn)證，目的 基因 TPO大小2500 bp左右，載體pFBDMY-IG大小6500 bp左右，結(jié)果見圖4。由圖4可見1號(hào)質(zhì) 粒分別切出2500 bp和6500 bp左右的大小，說明1號(hào)質(zhì)粒連接成功，2和3號(hào)沒有連上，菌液 PCR結(jié)果為假陽性，1號(hào)質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 6)重組病毒菌液PCR驗(yàn)證 分別將構(gòu)建好的質(zhì)粒pFBDMY-TPO-IG轉(zhuǎn)座進(jìn)大腸桿菌受體菌AcMultiBac/ rSW106-inv +ascf和BmMultiBac/rSW106-inv+ ascf中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，分別挑取4個(gè)白斑到含有抗生素和 營(yíng)養(yǎng)素 Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的培養(yǎng)基中，32 °C過夜培養(yǎng)，做菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖5。1、2、3 和4號(hào)為AcMul tiBac/pFBDMY-TP〇-IG 的PCR 結(jié)果，5、6、7和8 號(hào)為BmMul t iBac/pFBDMY-TP〇-IG 的PCR結(jié)果，P為以質(zhì)粒pFBDMY-TP〇-IG為模板進(jìn)行PCR的陽性對(duì)照，N為以水為模板的陰性對(duì) 照， 另外，將pFBDMY-TPO-IG和pUCDM-IH同時(shí)轉(zhuǎn)座進(jìn)BmMultiBac/rSW106-inv+ asd-中，由于 多角體基因的存在，可以在細(xì)胞或家蠶體內(nèi)形成包涵病毒粒子的多角體，當(dāng)用多角體喂食 家蠶時(shí)，家蠶中腸腸液的強(qiáng)堿性使多角體溶解，釋放出病毒粒子，多角體病毒對(duì)中腸上皮細(xì) 胞具有很強(qiáng)的感染性，這樣，可以省去人工注射家蠶的高難度操作。pFBDMY-TPO-IG和 pUCDM-IH同時(shí)轉(zhuǎn)座進(jìn)BmMultiBac/rSW106-inv+ asd-的重組病毒菌液TPO和ph的PCR驗(yàn)證，結(jié) 果見圖3-6。挑6個(gè)白斑，1-6號(hào)是TPO的菌液PCR，7號(hào)為以pFBDMY-TP〇-IG為模板的TPO陽性對(duì) 照，8號(hào)為以水為模板的TPO陰性對(duì)照，9-14號(hào)為菌液的ph PCR，15號(hào)為以pUCDM-IH為模板的 Ph陽性對(duì)照，16號(hào)為以水為模板的ph陰性對(duì)照， 由圖5可見，1、3、4、5、6、7和8號(hào)為陽性，分別挑3管菌接100 yL到5 mL培養(yǎng)基中，過夜 培養(yǎng)，感染Sf9細(xì)胞和家蠶。
[0023]由圖6可見，挑選的6個(gè)菌斑PCR鑒定都是陽性菌，接菌到含有Kan/Tet/Gm/Cm/Spe/ DAP的LB培養(yǎng)基，32 °C過夜培養(yǎng)，注射家蠶。
[0024] 7)重組病毒感染細(xì)胞檢測(cè) 按照前述表達(dá)的方法，用缺陷型重組病毒菌液AcMultiBac/rSW106-pFBDMY- TPO-IG- inv+ascf直接感染Sf9昆蟲細(xì)胞，三天后在倒置熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下可看見細(xì)胞發(fā)出綠 色熒光，結(jié)果見圖7 A，為提高病毒的滴度，將收獲的Pl代病毒盲傳3代，病毒在傳代過程中， 毒力增加使細(xì)胞病變的時(shí)間縮短，感染后表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞也增多，到第3代病毒感染細(xì) 胞72小時(shí)觀察，結(jié)果見圖7 B，幾乎所有細(xì)胞都被感染，都能在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出綠色熒 光，得到重組病毒Ac/TPO-IG。
[0025] 8)重組病毒感染家蠶熒光檢測(cè) 按照前述表達(dá)的方法，將含有重組病毒的細(xì)菌液BmMultiBac/rSW106-pFBDMY -TPO-IG-inv+ascf直接注射五齡家蠶，7天后觀察發(fā)現(xiàn)，被注射重組病毒菌液的家蠶與正常家蠶有 明顯的區(qū)別，體態(tài)透明，體節(jié)縮短，在NiKon熒光解剖鏡下觀察，可見注射重組病毒菌液的家 蠶有明顯的綠色熒光，而正常家蠶沒有熒光，隨機(jī)挑取家蠶拍照，結(jié)果見圖8。
[0026]從圖8 B可以看出，被注射重組病毒的家蠶7天后產(chǎn)生非常明顯的綠色熒光，也就 是說桿狀病毒攜帶的熒光蛋白基因得到了很好的表達(dá)。而且，被注射的家蠶幾乎沒有死亡， 這也證明了用缺陷型重組桿狀病毒細(xì)菌直接注射家蠶來高效表達(dá)外源基因，不僅高效方便 而且也是非常安全的。
[0027] 9重組病毒家蠶血淋巴細(xì)胞熒光和多角體檢測(cè) 將含有重組病毒的細(xì)菌液BmMultiBac/rSW106-pFBDMY-TP0-IG/pUCDM-IH /inv+ascf 注射五齡家蠶，7天后觀察發(fā)現(xiàn)，被注射重組病毒菌液的家蠶體態(tài)透明，體節(jié)縮短，在NiKon 熒光解剖鏡下觀察，可見注射重組病毒菌液的家蠶有明顯的綠色熒光，取其血淋巴，在 TE2000倒置熒光顯微鏡白光下觀察到多角體，見圖9 B;在藍(lán)色激發(fā)光下觀察到綠色熒光， 見圖9 C;取注射無菌水的家蠶血淋巴細(xì)胞做對(duì)照，沒有觀察到多角體和熒光，見圖9 A。在 注射了重組病毒菌液的家蠶血淋巴細(xì)胞內(nèi)可明顯看到多角體和綠色熒光，而正常家蠶沒 有，說明重組桿狀病毒成功在家蠶體內(nèi)產(chǎn)生，得到的多角體，可以直接口服感染家蠶。
[0028]蛋白表達(dá)成本分析 由于各系統(tǒng)表達(dá)的TPO后期都需要純化，所以純化成本和人力不計(jì)，主要比較表達(dá)過程 的成本。培養(yǎng)Sf 9細(xì)胞的主要成本有:Grace培養(yǎng)基干粉：100元/瓶(配制IL完全培養(yǎng)基），胎 牛血清：3200-9600元/L(配制10 L完全培養(yǎng)基），合計(jì)Grace培養(yǎng)基大約600元/L，酵母培養(yǎng) 的主要成本有:酵母提取物：236元/500 g，蛋白胨:380元/500 g，YNB:1100元/500 g(配制 20L培養(yǎng)基），Zeocin抗生素 :384元/mL，合計(jì)培養(yǎng)基大約80元/L，家蠶培養(yǎng)主要以桑葉為主， 大約0.1元/頭。
[0029]綜合以上表達(dá)量、活性、成本分析，比較TPO在這兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中的性價(jià)比，以成本 600元為定量，綜合以上數(shù)據(jù)，可得桿狀病毒昆蟲細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)TPO 9.5 mg、活性是3.7X 10411]，比活性是3.89\10311]/1職;桿狀病毒6000頭家蠶內(nèi)能表達(dá)87.6 11^、活性是4.55\ IO5 IU，比活性是5.19X103 IU/mg;酵母內(nèi)能表達(dá)SUM0/TP0 66.75 mg、活性是6.12X103 IU，比活性是0.92 XlO2 IU/mg;利用pPICZa-A載體能表達(dá)Z-TPO 30.75 mg、活性是 1.18 X IO4 IU，比活性是3.84 XlO2 IU/mg，見表9。
[0030]表9 TPO蛋白在相同成本600元下不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量、抗原活性和比活性比

可看出TPO蛋白在家蠶-桿狀病毒中的表達(dá)量和活性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)桿狀病毒，活性大 約是昆蟲細(xì)胞表達(dá)的12.3倍，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)，雖然目標(biāo)蛋白的表達(dá)量較高，但是活性卻 不如桿狀病毒，可以對(duì)其進(jìn)一步改進(jìn)或優(yōu)化，而桿狀病毒家蠶表達(dá)系統(tǒng)則可以是TPO蛋白大 量制備的最優(yōu)表達(dá)系統(tǒng)。
[0031] TPO主要借助于ELISA方法研究患者血清中甲狀腺過氧化物酶抗體(TPO-Ab)。主要 臨床應(yīng)用有診斷橋本氏病和自身免疫性甲狀腺疾?。患谞钕俟δ芸哼M(jìn)癥、原發(fā)性甲狀腺功 能減退癥;毒性彌慢性甲狀腺腫(Graves);監(jiān)測(cè)免疫治療效果;檢測(cè)家族甲狀腺疾病的發(fā)病 可能;預(yù)測(cè)孕婦產(chǎn)后甲狀腺功能障礙的發(fā)生。
[0032]本發(fā)明表達(dá)純化的TPO用于制備甲狀腺疾病檢測(cè)試劑盒，試劑盒里TPO的質(zhì)量要求 OD45q在1.0以上，原始設(shè)計(jì)方案中期望酵母的活性能達(dá)到要求值，并且能分泌到上清中，省 去后續(xù)純化的成本，但是實(shí)際在酵母表達(dá)體系中，測(cè)得OD值沒有達(dá)到1.0，靈敏度不夠，并且 TPO未分泌到上清中，所以目前排除酵母表達(dá)系統(tǒng)制備ΤΡ0。使用傳統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)ΤΡ0,開 發(fā)試劑盒，表達(dá)9.5 mg蛋白，表達(dá)成本是600元，純化成本是200元，人工計(jì)2000元，估計(jì)生產(chǎn) 的成本大約是295元/mg，也可以使用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，提高效率，與進(jìn)口 TPO價(jià)格的10000 元/mg相比，大大降低了TPO的成本，可用于代替進(jìn)口產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外出售，降低試劑盒的成 本。TPO在家蠶內(nèi)的生產(chǎn)效率更高，表達(dá)87.6 mg蛋白，表達(dá)成本是600元，純化成本是1850 元，人力計(jì)2000元，生產(chǎn)成本大約是51元/mg，且靈敏度更高。傳統(tǒng)桿狀病毒和桿狀病毒-家 蠶生物反應(yīng)器制備的TPO在今后甲狀腺疾病臨床檢測(cè)試劑盒的使用中起著非常重要的作 用，有著廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0033]圖 1 為TPO的PCR產(chǎn)物電泳分析，M:DL 5000 DNA Marker; 圖2為口8&。1^61〇-1^?0雙酶切產(chǎn)物電泳分析，]\1:01^ 5000 0嫩1&^1?^; 圖3為pFBDMY-TP〇-IG菌液PCR電泳檢測(cè)，1-9:以9個(gè)單菌落搖起的菌液作模板的擴(kuò)增 產(chǎn)物，1 〇:陰性對(duì)照，11:陽性對(duì)照，M: DL 5000 DNA Marker; 圖4為pFBDMY-TP〇-IG雙酶切產(chǎn)物電泳分析，1:1號(hào)質(zhì)粒，2:1號(hào)質(zhì)粒酶切，3:2號(hào)質(zhì)粒， 4:2號(hào)質(zhì)粒酶切，5:3號(hào)質(zhì)粒，6:3號(hào)質(zhì)粒酶切，M:DL 10000 Marker; 圖5重組病毒菌液TPO PCR檢測(cè)，l-4:AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG的4個(gè)單菌落PCR產(chǎn) 物，5-8:BmMultiBac/pFBDMY-TP〇-IG的4個(gè)單菌落PCR產(chǎn)物，P:陽性對(duì)照，N:陰性對(duì)照，M:DL 5000 Marker； 圖6 重組病毒菌液TPO和ph PCR檢測(cè)，1-6:6個(gè)BmMultiBac/pFBDMY-TP〇-IG/pUCDM-IH 單菌落的TPO PCR產(chǎn)物，7:TPO陽性對(duì)照，8:TPO陰性對(duì)照，9-14:6個(gè)BmMultiBac/pFBDMY-TPO-IG/pUCDM-ΙΗ單菌落的ph PCR，15:ph陽性對(duì)照，16:ph陰性對(duì)照，M:DL 5000 Marker; 圖7缺陷型重組病毒菌液直接感染Sf9細(xì)胞熒光結(jié)果，A:重組病毒菌液直接感染 胞三天后焚光結(jié)果B:盲傳三代后焚光結(jié)果； 圖8缺陷型重組病毒菌液直接注射家蠶熒光結(jié)果，A:注射重組病毒菌液的家蠶7天后 自然光下照片，B:注射重組病毒菌液的家蠶7天后NiKon焚光解剖鏡下的照片，con:用無菌 水注射作對(duì)照的家蠶，green:注射重組病毒發(fā)綠色焚光的家蠶； 圖9缺陷型重組病毒菌液直接注射家蠶血淋巴細(xì)胞多角體和熒光觀察，A:注射無菌水 的家蠶血淋巴細(xì)胞B:注射重組病毒菌液的家蠶血淋巴細(xì)胞的多角體觀察C:注射重組病毒 菌液的家蠶血淋巴細(xì)胞的熒光觀察； 圖10侵染蛋白介導(dǎo)的直接生產(chǎn)重組病毒的原理與過程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 1菌株、質(zhì)粒、病毒、細(xì)胞、家蠶 用于轉(zhuǎn)化普通質(zhì)粒的大腸桿菌E.coli TOPlO菌株，嚴(yán)謹(jǐn)型阿拉伯糖啟動(dòng)子控制的帶有 入侵蛋白（invasin)的二氨基庚二酸(DAP)營(yíng)養(yǎng)缺陷型SW106菌株由河南省伏牛山昆蟲生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。含兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子（PlO and polh)的質(zhì)粒pFBDM和pUCDM由T. J. Richmond惠贈(zèng)，質(zhì)粒pFBDMY-IG和pUCDM-IH是由本實(shí)驗(yàn)改造 pFBDM和pUCDM所得(缺失掉Spe I酶切位點(diǎn)，在BstB I位點(diǎn)和Pst I位點(diǎn)之間插入核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES基因（簡(jiǎn)寫I)和起報(bào) 告基因作用的加強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因 eGFP(簡(jiǎn)寫G)或多角體基因 ph(簡(jiǎn)寫H)，IRES有助于 綠色熒光蛋白和多角體蛋白的表達(dá)）。河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室用的TPO基因是由武 漢三鷹公司購(gòu)買，Sf 9細(xì)胞和家蠶品系由上述實(shí)驗(yàn)室保存。
[0035] 菌株63115，表達(dá)載體??吐31]]\?)8七3廣？？102€[4均由河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 室提供，PPahSUMOstar載體是在pPICZa-A的基礎(chǔ)上改造來的，在pPICZa-A載體的α信號(hào)肽后 增加 SUMO融合蛋白。載體又經(jīng)改造(增加酶切位點(diǎn)EcoR I、Nde I、Sph I、Xba I及氨芐抗性 基因 amp)，命名為pPahSUM0-Y，pPICZa-Y。
[0036] 1.2酶和試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB、Fermentas和TaKaRa公司；Solution I DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；Taq酶及PCR所需試劑、T載體pBackzero-T和DNA分子量MarkeKDL 2000、DL 5000和 DL 10000等)均購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，凝膠回收試劑盒，PCR溶液回收試劑盒 購(gòu)自AXYGEN公司；Tris平衡酚購(gòu)自Solarbio公司；二氨基庚二酸(DAP)、異丙基硫代半乳糖 苷(IPTG)W-半乳糖苷酶(X-Gal)、氨芐青霉素(Amp)、慶大霉素(Gm)、氯霉素(Cm)、博萊霉素 (Zeocin)等抗生素均為Invitrogen公司產(chǎn)品。
[0037] 蛋白MakeHPageRulerTM Prestained Protein Ladder)購(gòu)自Fermentas公司； Western blot顯色液、6XHis單克隆鼠抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購(gòu)自碧云天公司，TPO抗體的 活性ELISA試劑盒由鄭州安圖生物有限公司惠贈(zèng)，其他的常規(guī)生化及分子生物學(xué)試劑購(gòu)自 鄭州久是生物公司。引物合成和測(cè)序工作由華大基因公司合成。
[0038] 2分子生物學(xué)基本操作 2.1質(zhì)粒的提取 本方法參照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒提取說明書。
[0039] (1)取1~4 mL在LB培養(yǎng)集中培養(yǎng)過夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半 或更少），12000 g離心I min，棄盡上清； (2)加入250 yL的Buffer S1，在振蕩器上懸浮沉淀，使溶液完全混勻，不應(yīng)留有小的菌 塊； (3) 加入250 yL的Buffer S2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)5~6次混合均勻，使菌體充分裂解，直至 形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5 min; (4) 加入350 yL的Buffer S3,溫和并充分的上下翻轉(zhuǎn)顛倒6~8次，12000 g離心10 min; (5) 轉(zhuǎn)移上清到制備管(置于2 mL離心管(試劑盒內(nèi)提供）中），12000 g離心I min，棄濾 液； (6) 將制備管置回離心管，加500 uL Buffer Wl，12000 g離心I min，棄濾液； (7) 將制備管置回離心管，加700 yL Buffer W2,12000 g離心I min，以同樣的方法再 用700 nL Buffer W2洗滌一次，棄濾液； (8) 將制備管置回2 mL離心管中，12000 g離心I min; (9) 將制備管移入新的1.5 mL離心管(試劑盒內(nèi)提供）中，在制備膜中央加70 uL經(jīng)65°C 水浴預(yù)熱的Eluent，室溫靜置I min，12000 g離心I min; (10) DNA產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 2.2瓊脂糖凝膠電泳和膠回收 (1)瓊脂糖凝膠電泳 按1%比例，稱取Ig瓊脂糖，加入100 mL的I X TAE緩沖液，加熱融化瓊脂糖，待冷卻至50 °C左右，加入I uL EB混勻后倒板，插上梳子，注意不要有氣泡。待膠凝固后，取下梳子上樣， 以120 V電壓進(jìn)行電泳。
[0041] (2)瓊脂糖凝膠回收(參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒） ① 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計(jì)算 凝膠數(shù)量(提前記錄1.5 mL離心管重量），該重量作為一個(gè)凝膠體積； ② 加入3個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱，間斷混合(每 2~3 min)，直至凝膠塊完全恪化(約6~8 min); ③ 加入0 · 5個(gè)Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻；吸取溶膠管中的混合液，轉(zhuǎn) 移到DNA制備管(置于2 mL離心管中），12000 g離心I min，棄濾液； ④ 將制備管置回2 mL離心管，加500 uL的Buffer Wl，12000 g離心30 s，棄濾液； ⑤ 將制備管置回2 mL離心管，加700 yL的Buffer W2，12000 g離心30 s，以同樣的方法 再用700 μL的BufferW2洗滌一次，12000 g離心I min; ⑥ 將制備管置回2 mL離心管中，12000 g離心I min; ⑦ 將制備管移入新的1.5 mL離心管(試劑盒內(nèi)提供）中，在制備膜中央加25仙經(jīng)65°C水 浴預(yù)熱的Eluent，室溫靜置I min，12000 g離心I min; ⑧ DNA產(chǎn)物-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0042] (3) PCR溶液回收 本方法參照AxyPrep PCR清潔試劑盒回收說明書。
[0043] ①在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的Buffer PCR-A(若Buffer PCR-A不足100 uL，加至100 uL);混勻后，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2mL離心管(試劑 盒內(nèi)提供)中，12000 g離心I min，棄濾液； ② 將制備管置回2 mL離心管，加700 uL Buffer W2,12000 g離心I min，棄濾液(確認(rèn) 在Buffer W2 concentrate中已按試劑瓶上的指定體積加入無水乙醇）； ③ 將制備管置于離心管中，將制備管置回2 mL離心管，加500 nL Buffer W2，12000g離 心lmin，建議提醒:從離心機(jī)中取出2 mL離心管時(shí)，注意不要讓管底的Buffer W2接觸到制 備管； ④將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管（試劑盒內(nèi)提供）中，在制備管膜中央加25 nL Eluent，室溫靜置I min，12000 g離心I min洗脫DNA，將Eluent加熱至65°C將提高洗脫效 率。
[0044] 2.4感受態(tài)細(xì)胞的制備方法 (I) CaCl2感受態(tài)的制備 ① 在無抗LB固體培養(yǎng)基上劃線，過夜培養(yǎng)； ② 接種一個(gè)單菌落于一個(gè)5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜； ③ 按1:100的比例將過夜培養(yǎng)菌液加入到新鮮無抗的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C振蕩培 養(yǎng)2~3 h至OD6QQ達(dá)到0.4~0.6之間； ④ 將菌液轉(zhuǎn)移至50mL預(yù)冷的高壓滅菌的聚丙烯離心管中，冰上放置20 min，4°C，3000 g離心10 min，棄上清； ⑤ 細(xì)胞沉淀用10 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸，4°C，3000 g離心10 min，棄上 清； ⑥ 細(xì)胞沉淀用10 mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，4°C，3000 g 離心10 min，棄上清； ⑦ 用I mL預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重懸細(xì)胞，冰上放置4 h; ⑧ 加入終濃度為15%的甘油，輕輕混勾，按每管100 yL分裝到預(yù)冷的1.5 mL Eppendorf 管中，立即凍存于-80°C冰箱。
[0045] (2)酵母感受態(tài)的制備 ① 在無抗YPDS固體培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)2~3天，至長(zhǎng)出單菌落； ② 挑取單菌落GS115菌接種于5 mL YH)液體培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)過液； ③ 取過液培養(yǎng)的菌液2 mL接種于100 mL新鮮YPD液體培養(yǎng)基，再于30°C培養(yǎng)至 0D600=1.3~1.5; ④ 在4°C，4000 rpm離心2 min，用 10 mL (TC LiAc:DTT(9:l)重懸，處理20 min; ⑤ 離心同上，再重懸于10 mL 0°C無菌水； ⑥ 重復(fù)⑤； ⑦ 離心同上，重懸于10 mL (TC I M山梨醇溶液； ⑧ 離心同上，再重懸于I mL (TC I M山梨醇溶液，分裝，每80 nL-管，置于冰上（當(dāng)天 使用）。
[0046] 2.5昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基本操作 (1)細(xì)胞的復(fù)蘇 非原代培養(yǎng)細(xì)胞一般凍存于液氮之中，需要培養(yǎng)時(shí)要先從液氮中取出使之復(fù)蘇： ① 水浴鍋溫度調(diào)至37°C，并將含10% FBS的培養(yǎng)液置于其中預(yù)熱； ② 從液氮罐中取出所要細(xì)胞，立即置于37°C水浴鍋使其快速解凍； ③ 將凍存管及培養(yǎng)液瓶的外表面用醫(yī)用酒精擦拭，放入超凈臺(tái)； ④ 將細(xì)胞懸液移到離心管中，并加入I mL培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打； ⑤ 1500 rpm離心3 min; ⑥ 棄去上清液，加入I mL培養(yǎng)液，吹打均勻，使細(xì)胞懸浮； ⑦ 將細(xì)胞懸液移到50 mL培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加約5 mL培養(yǎng)液;置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0047] (2)細(xì)胞的傳代 培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累(可見 到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長(zhǎng)空間也受到限制，就會(huì)影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存，這時(shí)就需 要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過程就叫做傳代。
[0048]懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即 可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000~ 1500 rpm離心3 min，棄上清，加入約2 mL培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2~3滴至已加入新鮮培 養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(抒松培養(yǎng)基瓶蓋）。
[0049] (3)細(xì)胞的凍存 ① 細(xì)胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害； ② 貼壁細(xì)胞經(jīng)消化、離心收集，懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集； ③ 大約IO6個(gè)細(xì)胞加入I mL凍存液，用吸管吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液； ④ 把細(xì)胞懸液加入到凍存管中。如用1.8 mL的凍存管，每個(gè)凍存管最好不要加入超過 1.5 mL細(xì)胞懸液； ⑤ 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期； ⑥ 用厚布或衛(wèi)生紙包裹凍存管，置于4°C 0.5 h，然后置于-20°C 2 h，再置于-40°C 2 h，然后置于-80°C過夜;第二天將細(xì)胞置于液氮中； ⑦ 記下凍存管存放的位置，作好凍存記錄。
[0050] 2.6家蠶品系與飼養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)室所用的家蠶品系為大造 P50，蠶卵保存在4°C，相對(duì)濕度75%~85%，使用時(shí)，給蠶卵 解除滯育： (1) 取4°C條件下保存的滯育蠶卵，25°C條件下在21.92%的HCl(取59 mL 37%的HCl定 容至100 mL)中浸泡80 min; (2) 用清水沖洗干凈，25°C條件下再用3%的甲醛(取8.1 mL 37%的甲醛溶液定容至100 mL)浸泡30 min; (3) 用清水沖洗至無味，陰干后在28°C條件下恒溫培養(yǎng)至孵化。
[0051] 孵化后的幼蟲在恒溫25°C左右，自然光周期條件下，用新鮮桑葉飼養(yǎng)。
[0052]該甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法，按下述步驟操作： I).TPO基因的克隆 ① 引物設(shè)計(jì)合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位點(diǎn)，下游添加 Sal I位點(diǎn)， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TPO用LaTaq酶PCR擴(kuò)增，以購(gòu)買的pGEM3Zf-TP0為模板，配制PCR體系：LaTaq 0·5μ UlOXLaTaq Buffer 5yL、10X dNTP 4yL、引物TP0E5El(20mM)lyL、引物TP0SalR(20mM)ly L、模板〇.5yL、ddH2〇 up to 5〇yL。
[0053] ③PCR擴(kuò)增程序，95°C預(yù)變性5 min，95°C變性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸3 min，從第二步開始循環(huán)，總共30個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸10 min。
[0054] ④瓊脂糖電泳檢測(cè)。120 V電壓，電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析，檢測(cè)正確者 用膠回收試劑盒回收。
[0055] 2). T載體連接 為了方便測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增序列是否正確，將PCR回收產(chǎn)物連接到到pBackzero-T載體上。
[0056] :書連接，配制連接體系：T載體0.3uL、PCR片段SJyUSolution I 2.5uL，連接混 合物16°C反應(yīng)30 min。
[0057] ②轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，連接產(chǎn)物全量（5 uL)加入至100 uL冰上解凍的 T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min，42°C熱激90 S后，再冰浴2 min，加入800 UL LB培養(yǎng) 基，37 °C振蕩培養(yǎng)60 min，在含有Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。
[0058]③菌液PCR驗(yàn)證，挑選5~10個(gè)單菌落，分別接種到800 uL添加有Amp抗生素的LB液 體培養(yǎng)基，37°C，200 rpm振蕩過夜培養(yǎng)，各取I uL菌液為模板，用TP0E5E1、TP0SalR作引物， 做PCR檢測(cè)，并作陰陽性對(duì)照。
[0059] ④酶切驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證陽性的克隆，接菌到5 mL含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，200 rpm振蕩過夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒做酶切驗(yàn)證。
[0060] ⑤測(cè)序，酶切驗(yàn)證正確的Τ-ΤΡ0,取兩個(gè)克隆的菌液500 UL加15%甘油寄到北京奧 科生物公司測(cè)序。
[0061 ] 3).轉(zhuǎn)移載體pFBDMY-TP〇-IG的構(gòu)建 質(zhì)粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSCl上的Spe I位點(diǎn)，命名為pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位點(diǎn)之間插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，是mRNA分子內(nèi)（而非5'端)可被核糖體識(shí)別并啟動(dòng)翻譯 的一種順式元件，eGFP轉(zhuǎn)移到病毒基因組表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在病毒轉(zhuǎn)染和感染時(shí)起 報(bào)告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表達(dá)； 將測(cè)序正確的T-TPO和pFBDMY-IRES-eGFP分別用EcoR I/Sal I酶切，回收，連接，PCR 驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證，連接體系由如下試劑構(gòu)成:載體回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 連接混合物16°C反應(yīng)3 h，其余與T載體的構(gòu)建方法相同。
[0062] 4乂 Tn7位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座 二制備 AcMul tiBac/rSWl 06-inv+asd-和 BmMul tiBac/rSWl 06-inv+ asd-轉(zhuǎn)座感受態(tài) 取一管保種的AcMultiBac/rSW106-inv+asd-菌液，在加有Kan/Tet/Spe/DAP/ IPTG/X-Gal抗生素平板上面劃線，32°C培養(yǎng)48 h，挑取藍(lán)斑單菌落接種于5 mL含Kan/Tet/Spe/DAP 的LB培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)過夜;按1:100吸取過夜的AcMultiBac/rSW106-inv+ascT菌液至含 DAP的LB培養(yǎng)基中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)至0D600=0.2時(shí)，加入終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖誘 導(dǎo)激活宿主菌rSW106上Cre酶，繼續(xù)培養(yǎng)至OD 6qq=O . 4~0.6，CaCl2常規(guī)方法制備感受態(tài)細(xì)胞， 每管分裝100 ]jL，按相同的方法制備BmMultiBac/rSW106-inv+ascT感受態(tài)。
[0063] ζ 轉(zhuǎn)座 取一管上面做好的AcMultiBac/rSW106_inv+asd-感受態(tài)，冰上解凍，加入8 yL質(zhì)粒 pFBDMY-TPO-IG，冰浴30 min，42°C熱激90 s，再置于冰上冷卻3 min，后加入I mL含有DAP的 LB培養(yǎng)基，32 °C 恒溫，200 rpm，振蕩培養(yǎng)6 h左右，涂含Kan/Tet/Gm/DAP/Spe/IPTG/X-Gal 的 LB平板，32°C恒溫培養(yǎng)24 h~48 h，至藍(lán)白斑出現(xiàn)，在藍(lán)斑附近挑取5~10個(gè)大且圓的白斑到 Kan/Tet/Cm/DAP的LB培養(yǎng)基，32 °C恒溫振蕩過夜培養(yǎng)，用TPO的引物做PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的 菌種保留備用；按照同樣的方法，將質(zhì)粒pFBDMY-TPO-I G和pUCDM-1H同時(shí)轉(zhuǎn)座到 BmMultiBac/rSW106-inv+asd_感受態(tài)細(xì)胞，得到重組病毒的陽性菌液； 5) .重組病毒菌液感染Sf9昆蟲細(xì)胞 將構(gòu)建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 蟲細(xì)胞： I 將PCR驗(yàn)證陽性的AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液（2~ 3個(gè)菌落)接種到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培養(yǎng)基，于32°C200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜;無 菌條件下分別取I mL菌液至滅菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm離心3 min，棄上清，用 無菌水重懸洗滌三次，洗掉菌液中DAP;最后無菌條件下用I mL無血清無雙抗的Grace培養(yǎng) 基重懸沉淀，再用雙無 Grace培養(yǎng)基稀釋成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板為例，前一天將生長(zhǎng)狀態(tài)良 好的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)移到六孔板，隔夜培養(yǎng)，細(xì)胞密度為70%~80%時(shí)，吸出培養(yǎng)基，每孔加入I mL 雙無 Grace(無血清，無雙抗)稀釋后的菌液，做好標(biāo)記，四小時(shí)后，吸走上清，加入I mL完全 Grace培養(yǎng)基，三天后焚光檢測(cè)； ②將前一步驟①中獲得的細(xì)胞上清作為Pl代重組桿狀病毒，連續(xù)傳代Pl代病毒，獲得 P2、P3代重組桿狀病毒； 6) 重組病毒菌液注射家蠶或重組病毒口服感染家蠶，生產(chǎn)重組病毒粒子Bm/TP〇-IG和 Bm/TP〇-IG/IH。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法，其特征在于按下述步驟操作： 1).TP0基因的克隆 ① 引物設(shè)計(jì)合成，上游添加 EcoR V、EcoR I位點(diǎn)，下游添加 Sal I位點(diǎn)， TP0E5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttc TPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg； ② TP0用LaTaq酶PCR擴(kuò)增； ③ 瓊脂糖電泳檢測(cè)，檢測(cè)正確者用膠回收試劑盒回收； 2 ). T載體連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序驗(yàn)證 為了方便測(cè)序檢測(cè)擴(kuò)增序列是否正確，將PCR回收產(chǎn)物連接到到pBackzero-T載體上； :1:連接； ② 轉(zhuǎn)化到T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落； ③ 菌液PCR驗(yàn)證； ④ 酶切驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證陽性的克隆，提質(zhì)粒做酶切驗(yàn)證； ⑤ 測(cè)序，酶切驗(yàn)證正確的T-TP0; 3) .轉(zhuǎn)移載體pFBDMY-TPO-IG的構(gòu)建 質(zhì)粒pFBDMY-IRES-eGFP是先缺失原始pFBDM中MSC1上的Spe I位點(diǎn)，命名為pFBDMY，后 又在BstB I和Pst I位點(diǎn)之間插入IRES和eGFP基因，IRES( internal ribosome entry site)基因，即內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，是mRNA分子內(nèi)（而非5'端)可被核糖體識(shí)別并啟動(dòng)翻譯 的一種順式元件，eGFP轉(zhuǎn)移到病毒基因組表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在病毒轉(zhuǎn)染和感染時(shí)起 報(bào)告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表達(dá)； 將測(cè)序正確的T-TP0和pFBDMY-IRES-eGFP分別用EcoR I/Sal I酶切，回收，連接，PCR 驗(yàn)證，酶切驗(yàn)證，連接體系由如下試劑構(gòu)成:載體回收lyL、片段回收4yL、Solution I 5yL， 連接混合物16°C反應(yīng)3 h，其余與T載體的構(gòu)建方法相同； 4) . Τη7位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座 X.制備AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-轉(zhuǎn)座感受態(tài)； S轉(zhuǎn)座； 5) .重組病毒菌液感染Sf9昆蟲細(xì)胞 將構(gòu)建的pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆 蟲細(xì)胞： T 將PCR驗(yàn)證陽性的AcMultiBac/pFBDMY-TP0-IG/rSW106-inv+asd-重組病毒菌液（2~3 個(gè)菌落)接種到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培養(yǎng)基，于32°C200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜;無 菌條件下分別取1 mL菌液至滅菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm離心3 min，棄上清，用 無菌水重懸洗滌三次，洗掉菌液中DAP;最后無菌條件下用1 mL無血清無雙抗的Grace培養(yǎng) 基重懸沉淀，再用雙無 Grace培養(yǎng)基稀釋成ΙΟ'ΙΟΛ以六孔板為例，前一天將生長(zhǎng)狀態(tài)良 好的Sf 9細(xì)胞轉(zhuǎn)移到六孔板，隔夜培養(yǎng)，細(xì)胞密度為70%~80%時(shí)，吸出培養(yǎng)基，每孔加入1 mL 雙無 Grace(無血清，無雙抗)稀釋后的菌液，做好標(biāo)記，四小時(shí)后，吸走上清，加入1 mL完全 Grace培養(yǎng)基，三天后焚光檢測(cè)； ②將前一步驟①中獲得的細(xì)胞上清作為P1代重組桿狀病毒，連續(xù)傳代P1代病毒，獲得 P2、P3代重組桿狀病毒； 重組病毒菌液注射家蠶或重組病毒口服感染家蠶，生產(chǎn)重組病毒粒子Bm/TPO-IG和Bm/ TPO-IG/IHo2.如權(quán)利要求1所述的甲狀腺過氧化物酶表達(dá)方法，其特征在于：步驟4)Tn7位點(diǎn)的轉(zhuǎn) 座按下述操作： ::Γ.制備 AcMultiBac/rSW106_inv+asd-和 BmMultiBac/rSW106_inv+ asd-轉(zhuǎn)座感受態(tài) 取一管保種的AcMultiBac/rSW106-inv+asd-菌液，在加有Kan/Tet/Spe/DAP/ IPTG/X-Gal抗生素平板上面劃線，32°C培養(yǎng)48 h，挑取藍(lán)斑單菌落接種于5 mL含Kan/Tet/Spe/DAP 的LB培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)過夜;按1:100吸取過夜的AcMultiBac/rSW106-inv+ascT菌液至含 DAP的LB培養(yǎng)基中，30°C恒溫振蕩培養(yǎng)至0D600=0.2時(shí)，加入終濃度為0.1%的L-阿拉伯糖誘 導(dǎo)激活宿主菌rSW106上Cre酶，繼續(xù)培養(yǎng)至0D 6Q()=0.4~0.6，CaCl2常規(guī)方法制備感受態(tài)細(xì)胞， 每管分裝100 ]jL，按相同的方法制備BmMultiBac/rSW106-inv+ascT感受態(tài)； ?轉(zhuǎn)座 取一管上面做好的AcMultiBac/rSW106_inv+asd-感受態(tài)，冰上解凍，加入8 yL質(zhì)粒 pFBDMY-TPO-IG，冰浴30 min，42°C熱激90 s，再置于冰上冷卻3 min，后加入1 mL含有DAP的 LB培養(yǎng)基，32 °C 恒溫，200 rpm，振蕩培養(yǎng)6 h左右，涂含Kan/Tet/Gm/DAP/Spe/IPTG/X-Gal 的 LB平板，32°C恒溫培養(yǎng)24 h~48 h，至藍(lán)白斑出現(xiàn)，在藍(lán)斑附近挑取5~10個(gè)大且圓的白斑到 Kan/Tet/Cm/DAP的LB培養(yǎng)基，32 °C恒溫振蕩過夜培養(yǎng)，用TP0的引物做PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的 菌種保留備用；按照同樣的方法，將質(zhì)粒pFBDMY-TPO-I G和pUCDM-1Η同時(shí)轉(zhuǎn)座到 BmMultiBac/rSW106-inv+asd_感受態(tài)細(xì)胞，得到重組病毒的陽性菌液。
【文檔編號(hào)】C12N15/866GK105861458SQ201610246851
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】姚倫廣, 王鐵軍, 闞云超, 胡小敏, 郭保黨, 呂慧芳, 邢秋婷, 王立方
【申請(qǐng)人】南陽師范學(xué)院