一種n端融合hlh功能域提高豬溶菌酶抗菌性能的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種N端融合HLH功能域提高豬溶菌酶抗菌性能的方法，屬于生物工程領域。本發(fā)明的方法包括融合豬溶菌酶基因的設計和大腸桿菌表達系統(tǒng)的表達及復性。經(jīng)抗菌活性檢測，本發(fā)明中的融合豬溶菌酶不僅對革蘭氏陽性菌具有明顯抗性，同時也可以殺滅多種革蘭氏陰性菌，為提高溶菌酶的抗菌活性提供了很好的案例。本發(fā)明中的融合豬溶菌酶制備工藝具有簡單、高效的特點，產(chǎn)物可達電泳純，純度在90％以上。
【專利說明】
一種N端融合HLH功能域提高豬溶菌酶抗菌性能的方法
技術(shù)領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種N端融合HLH功能域提高豬溶菌酶抗菌性能的方法，屬于生物工程 領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾十年來，抗生素通過抑制病原微生物增殖，減少其代謝毒素對動物的毒害作用 而在防治動物的疾病、促進動物的生長、提高畜禽產(chǎn)品的產(chǎn)量等方面起到了積極的作用。但 是長期的使用抗生素，尤其是飼養(yǎng)過程中使用抗病藥物、促生長添加劑等，會造成藥物的殘 留超標，產(chǎn)地的環(huán)境污染，導致肌肉的品質(zhì)和加工產(chǎn)品的質(zhì)量下降。除此之外，禽畜長期使 用抗生素作飼料添加劑，可使某些菌群變?yōu)槟退幘?，從而帶來預防與治療人畜某些疾病 的困難。
[0003] 歐盟監(jiān)管委員會決定，自2006年1月起在動物養(yǎng)殖業(yè)中禁用抗生素生長促進劑。從 2013年12月開始，美國FDA發(fā)布了《獸醫(yī)飼料指令》，要求有執(zhí)照的獸醫(yī)監(jiān)督抗生素的使用， 計劃從2014年起，用3年時間禁止在牲畜飼料中使用預防性抗生素，最大限度地減少食用牲 畜帶給消費者抗生素耐藥性問題。韓國也計劃在2018年7月全面禁止飼用抗生素的使用。
[0004] 隨著細菌對抗生素耐藥性和抗生素的殘留問題日益嚴重，研究和開發(fā)綠色飼料添 加劑產(chǎn)品已經(jīng)成為世界性的研究課題，大量研究表明，中草藥提取物、微生物制劑、酶制劑、 益生元、抗菌肽、酸化劑等新型飼料添加劑能有效減少或者替代飼用抗生素的使用。其中， 溶菌酶來自動物體內(nèi)，因為其同源性和高效性而備受人們親睞。
[0005] 豬溶菌酶是豬體內(nèi)抵抗外源微生物侵染的一道重要屏障，是其非特異性免疫的重 要組成部分。鑒于豬在畜牧業(yè)中的重要地位，豬溶菌酶的規(guī)?；a(chǎn)問題已經(jīng)提上日程。然 而，與其他C-型溶菌酶的作用類似，豬溶菌酶的抗菌譜主要集中在革蘭氏陽性菌，對革蘭氏 陰性菌基本沒有抑菌作用，這也限制了它的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明利用蛋白酶將豬溶菌酶水解成不同的片段，利用超濾 和色譜等技術(shù)，得到了對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性的活性肽，并得到了抗菌肽的氨基酸 序列A-W-V-A-W-K(SEQ ID N0.1 所示，命名為SP)。并利用Swiss-Model(http:// www. swissmode I. expasy. org/)軟件模擬，得到了豬溶菌酶靠近C端的含有抗菌肽序列A-W-V-A-W-K的一段30個氨基酸的功能域HLH(氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示）。然后利用融合 表達的技術(shù)手段，將該HLH功能域與豬溶菌酶進行N端融合，得到了既能抗革蘭氏陽性菌，又 可以殺滅革蘭氏陰性菌的融合豬溶菌酶產(chǎn)品。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為:A-W-V-A-W-K(如SEQ ID NO. 1所示）。所述抗菌肽屬于堿性肽，與抗菌肽數(shù)據(jù)庫(The Antimicrobial Peptide Database)等數(shù)據(jù)庫比對，此種抗菌肽是首次被報道。該抗菌肽對大腸桿菌、銅綠 假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種融合溶菌酶，所述融合溶菌酶是將編碼氨基酸序 列如SEQ ID NO.2的基因與豬溶菌酶編碼基因的N端進行融合得到的。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述融合是直接融合，即兩段基因之間不加切割位 點;也可以采用加連接肽或者酶切位點的方式進行融合。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述豬溶菌酶是NCBI上genebank號為AAA86644.1的 豬溶菌酶。
[0011]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述豬溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。 [0012]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述融合溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示， [0013]在本發(fā)明的一種實施方式中，所述融合溶菌酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014] 本發(fā)明的第三個目的是提供含有所述融合溶菌酶編碼基因的基因表達框、重組載 體、重組菌。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體是以pET-28a( + )為表達載體構(gòu)建得到 的。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組菌，是以大腸桿菌為宿主構(gòu)建得到的。
[0017] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種表達所述融合溶菌酶的方法，所述方法是將融合 溶菌酶編碼基因克隆到表達載體中得到重組載體，然后將重組載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，以得 到的重組菌表達融合溶菌酶。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達載體為pET-28a( + )、宿主為大腸桿菌BL21 (DE3)〇
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述表達融合溶菌酶，是在30°C、200r/min條件下， 利用0 . lmmol/L的IPTG誘導8h，離心發(fā)酵液獲得菌體，然后獲得菌體中的重組蛋白包涵體， 對包涵體進行復性，得到具有生物活性的融合溶菌酶。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述復性是采用稀釋法對融合蛋白進行復性。復性 液為pH 8.0的50mM Tris-HC1，0.15M NaCl，5mM EDTA，1M Urea，0.5M Arg，2mM GSH(還原型 谷胱甘肽），〇.5mM GSSG(氧化型谷胱甘肽）。
[0021 ]在本發(fā)明的一種實施方式中，復性后的蛋白用分子量為3000Da的超濾膜超濾，然 后用截留分子量為3500的半透膜對pH 8.0的50mM Tris-HCl和0.15M NaCl溶液透析，之后 冷凍干燥。
[0022] 本發(fā)明的第五個目的是提供所述融合溶菌酶的應用，是作為飼料添加劑。
[0023] 本發(fā)明的第六個目的是提供一種抑制多種革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的方 法，是使用所述的融合溶菌酶。
[0024] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述革蘭氏陽性菌，為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌等;所述革蘭氏陰性菌，為大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺 炎克雷伯氏菌和沙門氏桿菌等。
[0025]本發(fā)明的有益效果：
[0026] (1)本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性的活性肽(A-W-V-A-W-K)，并得 到了豬溶菌酶靠近C端的含有抗菌肽序列A-W-V-A-W-K的一段30個氨基酸的功能域HLH，再 將此功能域HLH與豬溶菌酶進行融合，得到了融合溶菌酶。該HLH功能域本身存在于豬溶菌 酶的結(jié)構(gòu)之中，但是可能由于空間位阻的原因并沒有充分發(fā)揮其抗菌功能，本發(fā)明把該功 能域暴露在豬溶菌酶的結(jié)構(gòu)表面，充分發(fā)揮了其抗菌作用。
[0027] (2)本發(fā)明的融合溶菌酶，對枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭 氏陽性菌和大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性菌均有明顯的殺菌 作用，拓寬了豬溶菌酶的抗菌譜。
[0028] (3)本發(fā)明獲得的融合溶菌酶可作為飼料添加劑使用，有望在將來替代抗生素和 解決食品安全問題中發(fā)揮重要作用。
[0029] (4)本發(fā)明工藝具有簡單、快速、高效的特點，所涉及的各種緩沖液配方均可以在 實驗手冊中查到，制備得到的產(chǎn)品純度高，復性后的產(chǎn)品可達電泳純，純度在90%以上。
【附圖說明】
[0030] 圖1:融合溶菌酶的SDS-PAGE;其中M，蛋白Marker; 1，豬溶菌酶;2，融合豬溶菌酶。
【具體實施方式】
[0031]實施例1:融合豬溶菌酶的生產(chǎn)
[0032] 1、將利用Swiss-Model軟件模擬得到的功能域HLH(氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示）的編碼基因與豬溶菌酶編碼基因的N端進行融合，兩段基因中間不加切割位點，融合后 的基因的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
[0033] 2、將融合后的基因序列與表達載體pET_28a( + )連接，雙酶切所用限制酶為BamH I 和Hind ΙΠ ，轉(zhuǎn)入宿主E.coli BL21(DE3)中進行表達，在30°C、200r/min條件下，利用 0.1mm〇l/L的IPTG誘導8h，離心發(fā)酵液獲得菌體。對其進行超聲破碎獲得重組蛋白包涵體。 [0034] 3、采用稀釋法對上述獲得的包涵體進行復性，所用到的溶液為pH 8.0的50mM Tris-HCl、0·15Μ NaCl、5mM EDTA、IM Urea、0.5M L-Arg、2mM GSH、0.5mM GSSG0
[0035] 4、對復性后的融合蛋白進行超濾，截留分子量為3000Da，之后采用截留分子量為 3500的半透膜對pH 8.0的50mM Tris-HCl和0.15M NaCl溶液透析，透析之后進行冷凍干燥， 獲得具有生物活性的融合豬溶菌酶產(chǎn)品HLH-SSL。
[0036] 實施例2:融合溶菌酶的抗菌性能檢測
[0037] 融合豬溶菌酶的抑菌活性測定參照文獻的方法進行。測試菌經(jīng)過二級活化之后， 以1 %的接種量接種至含30mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)至OD6qq為0.6，取0.2mL菌液與 0.4mL TSB培養(yǎng)基混合后加入0.2mL含有融合溶菌酶(豬溶菌酶SSL和抗菌肽SP作對照）的 ros(0.05mol/L，pH 7.0)緩沖液混勻，使融合溶菌酶(或?qū)φ眨┑慕K濃度為8.3 X ΙΟΛιοΙ/L。 混合體系于37 °C、200r/min條件下培養(yǎng)2h后，稀釋涂布至TSB平板上，待長出菌落后進行計 數(shù)。計算抑菌系數(shù)log NoM，其中No是指空白組的菌落數(shù)，即只加 PBS溶液;他是實驗組(或 對照組)的菌落數(shù)。結(jié)果如表1所示。
[0038] 表1本發(fā)明融合豬溶菌酶的抑菌效果
[0040] 本發(fā)明的融合豬溶菌酶，對枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏 陽性菌和大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性菌均有明顯的殺菌作 用，拓寬了豬溶菌酶的抗菌譜。
[0041] 實施例3:融合溶菌酶的應用
[0042] 本發(fā)明的融合溶菌酶不僅可以抗多種革蘭氏陽性菌，又可以殺滅多種革蘭氏陰性 菌，包括多種病原菌，可作為飼料添加劑替代抗生素的使用。
[0043]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種融合溶菌酶，其特征在于，所述融合溶菌酶是將編碼氨基酸序列如SEQ ID NO.2 的基因與豬溶菌酶編碼基因的N端進行融合得到的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述豬溶菌酶是NCBI上genebank號 為AAA86644.1的豬溶菌酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述豬溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述融合是直接融合，兩段基因之 間不加切割位點。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合溶菌酶，其特征在于，所述融合溶菌酶的氨基酸序列如 SEQIDNO.^/f*。6. 含有權(quán)利要求1-5任一所述融合溶菌酶編碼基因的基因表達框、重組載體或重組菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以大腸桿菌為宿主構(gòu)建得 到的。8. -種表達權(quán)利要求1-5任一所述融合溶菌酶的方法，其特征在于，所述方法是將融合 溶菌酶編碼基因克隆到表達載體中得到重組載體，然后將重組載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，以得 到的重組菌表達融合溶菌酶。9. 一種權(quán)利要求1-5任一所述融合溶菌酶的應用。10. -種抑制多種革蘭氏陽性菌和/或革蘭氏陰性菌的方法，其特征在于，所述方法是 使用權(quán)利要求1-5任一所述的融合溶菌酶。
【文檔編號】C12N1/21GK105861468SQ201610394485
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】蔡國林, 陸健, 朱德偉
【申請人】江南大學