一種多肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種多肽及其應(yīng)用。所涉及的多肽的氨基酸序列為：ypyygkllqpkylqpllavq。本發(fā)明的多肽通過血腦屏障進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，干擾內(nèi)源性NDRG2與Na+/K+?ATPaseβ1的相互作用，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸，提高腦細(xì)胞外液谷氨酸濃度。為中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸代謝相關(guān)研究提供一種工具肽段，并可作為精神分裂癥和嗜睡癥等與腦中谷氨酸含量不足相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點(diǎn)選擇。
【專利說明】
一種多肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽及其在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要、含量最高的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。由于細(xì)胞外液缺乏 代謝谷氨酸的酶，突觸前膜釋放的谷氨酸主要通過周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取。星形膠質(zhì)細(xì) 胞主要以Na+/K +-ATPase依賴的方式攝取突觸間隙的谷氨酸。很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如精 神分裂癥和嗜睡癥等與腦中谷氨酸含量不足有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] NDRG2(Human N-myc downstream regulated gene 2)基因在腦、心臟、骨骼肌等 組織中表達(dá)含量很高。在哺乳動物腦中，NDRG2主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。
[0004] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中，NDRG2可以與Na VK+-ATPasem亞基相互作用，并 抑制NaVK+-ATPasem亞基的降解，從而調(diào)控NaVK+-ATPase依賴的谷氨酸攝取。NaVK +-ATPasem是Na+/K+-ATPase的組成性亞基，對于Na+/K+-ATPase全酶發(fā)揮正常的生理功能必 不可少。
[0005] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)NaVK+-ATPasem244-263片段是其與NDRG2相互作用的關(guān)鍵片段。外 源性給予該關(guān)鍵片段，可以通過競爭性結(jié)合阻斷內(nèi)源性NDRG2與Na+/K +-ATPasem的相互作 用，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的攝取能力，提高腦細(xì)胞外液中的谷氨酸濃度和中樞神經(jīng) 系統(tǒng)的興奮性。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，多肽β?244-263 : ypyygkl lqpkylcipl Iavq具有相關(guān)活性。
[0006] 為此本發(fā)明目的之一提供一種多肽，該多肽的氨基酸序列為：
[0007] ypyygkllqpkylqpllavq。
[0008] 本發(fā)明目的之二提供上述多肽干擾內(nèi)源性NaVK+-ATPasem與NDRG2結(jié)合的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明目的之三提供上述多肽干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取腦中突觸間隙的谷氨酸的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明目的之四提供了上述多肽用于制備治療精神分裂癥和嗜睡癥藥物的應(yīng)用。
[0011] 考慮到大于6個(gè)氨基酸的多肽一般不能穿過血腦屏障，難以在腦內(nèi)達(dá)到有效的蛋 白濃度。
[0012] 本發(fā)明目的之五提供了一種融合肽，該融合肽包括穿膜肽和上述多肽β1244-263 : ypyygkl lqpky Iqpl Iavq，所述穿膜肽為 TAT、VP22、AntP、Po Iyarginine 或 Poly lysine等，可 攜帶與其融合的肽段穿透血腦屏障并進(jìn)入細(xì)胞膜。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明目的之六提供了一種融合肽，該融合肽的氨基酸序列為：
[0014] YGRKKRRQRRRypyygk11qpkyIqp11avq 〇
[0015] 本發(fā)明目的之七提供了上述融合肽干擾內(nèi)源性Na+/K+-ATPasem與NDRG2結(jié)合的應(yīng) 用。
[0016] 本發(fā)明目的之八提供上述融合肽干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取腦中突觸間隙的谷氨酸 的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明目的之九提供了上述融合肽用于制備治療精神分裂癥和嗜睡癥藥物的應(yīng) 用。
[0018] 本發(fā)明的多肽通過血腦屏障進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，干擾內(nèi)源性NDRG2與NaVK+-ATPasem的相互作用，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸，提高腦細(xì)胞外液谷氨酸濃度。為中樞 神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸代謝相關(guān)研究提供一種工具肽段，并可作為精神分裂癥和嗜睡癥等與腦中 谷氨酸含量不足相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點(diǎn)選擇。
【附圖說明】
[0019] 圖1:高效液相色譜檢測TAT-W244-263融合肽純度大于99% ;
[0020]圖2:體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NDRG2可以與NaVK+-ATPasem亞基相互作用； [0021] 圖3:將NaVK+-ATPasem亞基逐步截短并利用免疫共沉淀篩選出其與NDRG2相互作 用的位點(diǎn)位于NaVK +-ATPasem亞基244-304肽段中；
[0022] 圖4:將NaVK+-ATPasem亞基244-304肽段進(jìn)一步截短并連接TAT穿膜肽段:ΤΑΤ-β 1244-263，ΤΑΤ-βΙ 264-283，ΤΑΤ-βΙ 284-304 ,在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中利用免疫共沉淀證實(shí) ΤΑΤ-β1244-263可以干擾內(nèi)源性NDRG2與NaVK+-ATPasem亞基相互作用；
[0023]圖5:使用綠色熒光素 FITC標(biāo)記的谷氨酸(FITC-Glu)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞對于谷氨 酸的再攝取，發(fā)現(xiàn)ΤΑΤ-β1244-263處理后與對照肽段處理組相比，谷氨酸攝取明顯減少；
[0024]圖6:小鼠鎖骨下靜脈注射ΤΑΤ-β1244-263后，分別提取小鼠皮層和紋狀體組織蛋白， 利用免疫共沉淀證實(shí)ΤΑΤ-β1244-263可以干擾內(nèi)源性NDRG2與NaVK+-ATPasem亞基相互作用； [0025]圖7:微透析實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用ΤΑΤ-β1244-263處理后小鼠腦外液谷氨酸含量明顯升高。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)驗(yàn)中所選用穿膜肽為ΤΑΤ，攜帶與其融合的肽段穿透血腦屏障并進(jìn)入細(xì)胞 膜，實(shí)現(xiàn)該功能的穿膜肽還有評22、4拉？、？〇173坪;[11；[116或?017178；[116等。
[0027] 一、構(gòu)建多肽：
[0028] 發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NDRG2可以與NaVK+-ATPasem 亞基相互作用（圖2 )，并抑制Na+A+-ATPasem亞基的降解。通過逐步截短N(yùn)aVK+-ATPasem 亞基，篩選并發(fā)現(xiàn)NaVK+-ATPasem第244-304片段中，包含兩種蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn) (圖3)。為進(jìn)一步明確這61個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽段中與NDRG2相互作用的最重要的肽段，發(fā)明 人將244-304肽段進(jìn)一步截短，分別構(gòu)建了 ： β?244-263、β?264-283和β?284-304 ;
[0029] 二、構(gòu)建融合肽
[0030] 構(gòu)建:ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β?264-283和ΤΑΤ-β?284-304,使三個(gè)肽段均具有穿透血腦屏障 進(jìn)入腦內(nèi)的能力。
[0031] 以ΤΑΤ-β?244-263融合肽為例，其制備方法如下：
[0032] (A)稱取Ig氯樹脂于150ml的反應(yīng)器中，用50ml的DCM浸泡；
[0033] (B)2小時(shí)后，用DMF洗滌樹脂，然后抽干，如此重復(fù)四次，將樹脂抽干后待用；
[0034] (C)稱取182mg Fmoc-Asn(trt)-〇H(根據(jù)樹脂取代度計(jì)算）于IOml的離心管中，加 入5ml的DCM將其溶解，然后加入1ml的DIEA振蕩搖勻lmin，待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中， 然后將反應(yīng)器置于30°C的搖床中反應(yīng)；
[0035] (D)2小時(shí)后，用IOML的甲醇封頭（甲醇:DIEA: DCM= 1:1:2)半小時(shí)，然后用DMF洗滌 四次，抽干待用；
[0036] (E)向反應(yīng)器中加入20ML的20 %哌啶（哌啶/DMF = 1: 4)，放在脫色搖床上搖晃 20min，以此來脫去樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫完保護(hù)后用DMF洗滌四次，然后抽干；
[0037] (F)取少量樹脂用茚三酮法檢測（檢A(茚三酮）、檢B(吡啶）各兩滴，100°C反應(yīng) Imin)，樹脂有顏色，說明脫保護(hù)成功；
[0038] (G)稱取一定量的Fmoc-Ser(tbu)-〇H和HOBT于IOml的離心管中，加入5ml的DMF將 其溶解，然后加入〇.5ml的DIC振蕩搖勻lmin，待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器 置于30°C的搖床中反應(yīng)；
[0039] (H) 1小時(shí)后，取少量樹脂檢測，用茚三酮法檢測（檢A、檢B各兩滴，10 0 °C反應(yīng) Imin )，若樹脂為無色，說明反應(yīng)完全，若樹脂有顏色，說明縮合不完全，繼續(xù)反應(yīng)；
[0040] (I)待反應(yīng)完全后，用DMF洗滌樹脂四次，然后抽干，向反應(yīng)器中加入一定量的20 % 哌啶(哌啶/DMF=I :4)，放在脫色搖床上搖晃20min，以此來脫去樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫 完保護(hù)后用DMF洗滌四次，然后抽干檢測保護(hù)是否脫去；
[0041] (J)按照步驟(G)-(I)依次接上剩余氨基酸；
[0042] (K)脫去最后一個(gè)氨基酸Y的保護(hù)后，用切割試劑切割下肽鏈凍干，送純化用高效 液相色譜進(jìn)行純化分離；
[0043] (L)待純化制備檢測純度大于99%可進(jìn)行使用；
[0044] (M)_20°C保存制備好的粉劑，使用時(shí)準(zhǔn)確稱量，溶解于生理鹽水中，離體實(shí)驗(yàn)濃度 為20μΜ，在體實(shí)驗(yàn)濃度為10mg/kg。
[0045]給小鼠鎖骨下靜脈注射ΤΑΤ-β1244-263融合肽段，2小時(shí)后利用微透析系統(tǒng)收集小鼠 腦細(xì)胞外液，并通過HPLC檢測腦細(xì)胞外液中谷氨酸的濃度，結(jié)果表明ΤΑΤ-β1244-263融合肽段 能顯著增加小鼠腦細(xì)胞外液中谷氨酸的含量。
[0046] 三、體外實(shí)驗(yàn)
[0047] 實(shí)驗(yàn)所用材料:ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β1264-283、ΤΑΤ-β?284-304三種肽段、體外培養(yǎng)2周的 小鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞、綠色熒光素 FITC標(biāo)記的谷氨酸。
[0048] 實(shí)驗(yàn)過程：
[0049] 在細(xì)胞水平利用免疫共沉淀的方法證實(shí):體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分別用終 濃度20μΜ ΤΑΤ-β?244-263、ΤΑΤ-β?264-283、ΤΑΤ-β?284-304三種肽段處理2小時(shí)，完成免疫共沉淀實(shí) 驗(yàn)。結(jié)果表明ΤΑΤ-β?244-263處理組內(nèi)源性NDRG2與NaVK +-ATPasem亞基相互作用幾乎被完全 阻斷（圖4)。而ΤΑΤ-β1264-283和ΤΑΤ-β?284-304處理組沒有明顯的阻斷效應(yīng)。
[0050] 將制備好的TAT-m244-263融合肽段加入體外培養(yǎng)2周的星形膠質(zhì)細(xì)胞，終濃度20μ Μ，不同時(shí)間點(diǎn)在激光共聚焦活細(xì)胞工作站下觀察FITC標(biāo)記的谷氨酸的攝取情況，結(jié)果顯示 ΤΑΤ-β1244-263融合肽可顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對培養(yǎng)液中外源谷氨酸的攝?。▓D5)。
[0051] 四、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0052] 實(shí)驗(yàn)所用材料:ΤΑΤ-β1244-263融合肽、C57小鼠。
[0053] 實(shí)驗(yàn)過程：
[0054]在體實(shí)驗(yàn)通過給小鼠鎖骨下靜脈注射TAT-m244-263肽段后，2小時(shí)后分別取皮層及 紋狀體組織提取蛋白，采用免疫共沉淀方法進(jìn)行檢測，進(jìn)一步證實(shí):經(jīng)過TAT-m244-263處理 后，內(nèi)源性NDRG2與NaVK +-ATPasem亞基相互作用明顯減弱（圖6)。
[0055] 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ΤΑΤ_β?244-263肽段可與NDRG2結(jié)合并干擾內(nèi)源性NaVK+-ATPasem亞 基與NDRG2結(jié)合，從而干擾內(nèi)源性NaVK+-ATPasem亞基的作用，影響了NaVK+-ATPase全酶 的正常功能，使星形膠質(zhì)細(xì)胞無法維持Na +跨膜濃度梯度，谷氨酸攝取能力明顯降低。ΤΑΤ-β 1244-263肽段靜脈注射2h后，采用微透析技術(shù)，獲得小鼠紋狀體腦區(qū)的細(xì)胞外液，通過HPLC法 檢測細(xì)胞外液中的谷氨酸含量，結(jié)果表明小鼠腦中谷氨酸濃度顯著提高（圖7)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其特征在于，該多肽的氨基酸序列如SEQ NO 1所示。2. 權(quán)利要求1所述多肽干擾內(nèi)源性Na+/K+-ATPaSem與NDRG2結(jié)合的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述多肽干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取腦中突觸間隙的谷氨酸的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述多肽用于制備治療精神分裂癥或嗜睡癥藥物的應(yīng)用。5. -種融合肽，其特征在于，該融合肽包括穿膜肽和權(quán)利要求1所述多肽，所述穿膜肽 為TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。6. -種融合肽，其特征在于，該融合肽的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。7. 權(quán)利要求5所述融合肽干擾內(nèi)源性Na+/K+-ATPaSem與NDRG2結(jié)合的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求5所述融合肽干擾星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取腦中突觸間隙的谷氨酸的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求5所述融合肽用于制備治療精神分裂癥和嗜睡癥藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P25/18GK105861462SQ201610207801
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月5日
【發(fā)明人】熊利澤, 李燕, 尹安琪, 郭航
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)