特異性針對(duì)mlaa-34的引物對(duì)和探針及熒光定量rt-pcr試劑盒和檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)MLAA?34的熒光定量RT?PCR試劑盒及其檢測(cè)方法,所述試劑盒中包括特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA?34的引物對(duì)和探針,以及檢測(cè)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA?34所需內(nèi)參基因ABL的引物對(duì)及探針;分子標(biāo)志物MLAA?34的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示,探針序列如SEQ ID NO.3所示。利用本發(fā)明提供的快速簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果好的試劑盒,對(duì)單核細(xì)胞白血病患者體內(nèi)MLAA?34基因表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測(cè),填補(bǔ)WHO在M5分子診斷及分型的空白并為疾病的預(yù)后提供參考。
【專利說明】
特異性針對(duì)MLAA-34的引物對(duì)和探針及黃光定量RT-PCR試劑 盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域,設(shè)及一種巧光定量RT-PC時(shí)式劑盒,具體設(shè) 及一種特異性針對(duì)MLAA-34的引物對(duì)和探針及巧光定量RT-PCR試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性白血病為一種惡性血液系統(tǒng)疾病。2001年,WHO提倡對(duì)白血病進(jìn)行MICM分型 (即根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)特征分型),MICM分型除了更深入細(xì)致地 分析白血病細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特征外,著重提出了急性白血病中非隨機(jī)染色體異常及其 分子改變與特定亞型的臨床表現(xiàn)和生物學(xué)特性之間的密切聯(lián)系,強(qiáng)調(diào)分子診斷的重要性; 并已在某些白血病類型中確定了特異基因,如急性早幼粒細(xì)胞白血病的PMkRARa基因、M2 的AMLl-ETO基因等。根據(jù)特異基因表達(dá)、特異染色體將急性非淋己細(xì)胞白血病分為低危、中 危、高危組,不同組別應(yīng)用不同方案治療;并分別應(yīng)用WTl基因、PMkRARa基因、BCR-ABL基因 對(duì)急性白血病、M3、慢性粒細(xì)胞性白血病進(jìn)行分子診斷、祀向治療、判斷復(fù)發(fā)及預(yù)后等。運(yùn)一 現(xiàn)象也反映了細(xì)胞遺傳一分子一臨床病理之間的密切聯(lián)系,為臨床診斷、療效監(jiān)測(cè)和微小 殘留病變(MRD)檢測(cè)提供了可靠的指標(biāo)。
[0003] 急性單核細(xì)胞白血病(M5)是急性髓性白血病(41山中較常見的類型,在我國(guó),M5發(fā) 病率僅次于M2,占 AML的23.2%-26.9%,明顯高于西方國(guó)家報(bào)道的8%,大多數(shù)M5患者臨床 上突出表現(xiàn)為髓外浸潤(rùn)、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)、不良染色體核型比例高、完全緩解率(CR)低、易復(fù) 發(fā)、無病存活時(shí)間短。M5的異質(zhì)性和復(fù)雜性決定其尚缺乏分子診斷和祀向治療的特異性腫 瘤標(biāo)志物。
[0004] 急性單核細(xì)胞白血病新型分子標(biāo)志物MLAA-34是
【申請(qǐng)人】課題組實(shí)驗(yàn)人員鑒定出的 具有特異性抗體、陽(yáng)性率高的M5抗原新基因,克隆出的其基因全長(zhǎng)CDNA序列已在GenBank登 錄,序列編號(hào)為AY288977.2,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn):MLAA-34基因是功能未知基因 CAB3化的一個(gè)新的剪接變體;應(yīng)用RNAi技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因是和急性單核細(xì)胞白血 病發(fā)生相關(guān)的新的抗調(diào)亡分子,慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)MLAA-34的U937細(xì)胞可顯著抑制細(xì)胞 調(diào)亡,并增加潛在的致瘤性。免疫共沉淀,鳥槍法測(cè)序和生物信息學(xué)分析示7巧巾蛋白質(zhì)設(shè)及 細(xì)胞調(diào)亡或增殖的生物過程和信號(hào)通路,
【申請(qǐng)人】課題組已應(yīng)用SYBR Green I巧光染料法的 實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR及Western Blot技術(shù)對(duì)急性單核細(xì)胞白血病組、非M5白血病組及正常 健康組的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)中mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)MLAA-34基因的 mRNA及蛋白水平在AML-M5型白血病細(xì)胞中都是特異性高表達(dá)的,在非M5白血病組及正常健 康組中為低表達(dá)或不表達(dá)。
[0005] 白血病M畑的殘留白血病細(xì)胞數(shù)量少,一般方法難W檢測(cè),因此需要應(yīng)用敏感度高 的方法檢測(cè)。目前,可通過檢測(cè)已確定的特異分子標(biāo)記物的基因表達(dá)對(duì)某些類型白血病進(jìn) 行分子診斷及病情監(jiān)測(cè),其特異性強(qiáng)、敏感度高,是MRD檢測(cè)的理想分子標(biāo)志。近幾年發(fā)展起 來的實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)顯著提高了PCR產(chǎn)物定量的準(zhǔn)確性,且操作簡(jiǎn)單,在M畑檢測(cè)中顯 示巨大的作用。實(shí)時(shí)巧光定量PCR在PCR擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)PCR產(chǎn)物,因此確保在PCR擴(kuò)增的指 數(shù)期準(zhǔn)確定量,且PCR后無須再對(duì)樣本進(jìn)行操作,極大地減少了PCR產(chǎn)物的污染機(jī)會(huì)。目前, 臨床上已廣泛應(yīng)用實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白血病標(biāo)志分子BCR-A化(慢性粒細(xì)胞白血 病)、MLl-ETO(急性粒細(xì)胞白血病部分分化型)、PML-RARa (急性早幼粒細(xì)胞白血?。?、H0X11 (T細(xì)胞性急性淋己細(xì)胞白血病)等W進(jìn)行相應(yīng)類型白血病的分子診斷、療效判斷及M畑檢測(cè) 等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種特異性檢測(cè)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34 的巧光定量RT-PC時(shí)式劑盒及其檢測(cè)方法,該試劑盒特異性好,靈敏度高,能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)人 體中特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的表達(dá)水平;檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、易操 作。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0008] 一種特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的引物對(duì)和探針,特異 性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示,下游 引物序列如SEQ ID NO.2所示,探針序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009] 一種特異性檢測(cè)MLAA-34的巧光定量RT-PCR試劑盒,包括特異性針對(duì)急性單核細(xì) 胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的引物對(duì)和探針,W及檢測(cè)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物 MLAA-34所需內(nèi)參基因 A化的引物對(duì)及探針;其中:
[0010] 特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示,探針序列如SEQ ID NO.3所示;
[0011] 內(nèi)參基因 A化的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示,下游引物序列如SEQ ID NO. 5 所示,探針序列如SEQ ID NO.6所示。
[0012 ]試劑盒內(nèi)包括:1)待檢測(cè)標(biāo)本;2)陰性對(duì)照品;3)陽(yáng)性參考品;
[001引 4)分子標(biāo)志物MLAA-34反應(yīng)液;5)內(nèi)參基因 ABL反應(yīng)液;6) 2 X Mix;試劑盒中的試劑 量滿足20人份測(cè)試使用。
[0014] 1人份測(cè)試用量的目的基因巧光定量PCR反應(yīng)體系包括:
[0015] cDNA 模板 5ul;
[0016] MLAA-34 反應(yīng)液 7ul;
[0017] 2XMix 13ul;
[001引其中,cDNA模板為提取的待檢測(cè)標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物;
[0019] MLAA-34反應(yīng)液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及Iul探針。
[0020] 1人份測(cè)試用量的內(nèi)參基因反應(yīng)體包括:
[0021] cDNA 模板 加1;
[0022] 內(nèi)參基因A化反應(yīng)液 7ul;
[0023] 2 XMix 13ul;
[0024] 其中,cDNA模板為提取的待檢測(cè)標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物;
[0025] 內(nèi)參基因反應(yīng)液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及Iul探針。
[0026] 所述的陰性對(duì)照品采用工藝用水;所述的陽(yáng)性參考品采用質(zhì)粒混合液,包括IX 1〇2~I X 1〇6拷貝的MLAA-34參考品,W及I X 1〇2~I X 1〇6拷貝的ABL參考品。
[0027] 利用上述特異性檢測(cè)MLAA-34的巧光定量RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法,包括W 下步驟:
[002引1)采集人體骨髓或外周血1.5~2ml,邸TA抗凝,低溫冷藏備用;
[0029] 2)將采集的血液標(biāo)本在化內(nèi)用化izol法及經(jīng)典氯仿法抽提單核細(xì)胞RNA,DEPC水 溶解,-80°C保存;
[0030] 3)采用商用試劑盒對(duì)步驟2)獲得的樣本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到CDNA模板;
[0031] 4)將CDNA模板、MLAA-34反應(yīng)液及2 XMiX混合后,組成反應(yīng)體系,同時(shí),CDNA模板、 內(nèi)參基因 A化反應(yīng)液及2XMix混合后,組成該樣本的內(nèi)參反應(yīng)體系;再制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后 采用巧光定量PCR法檢測(cè)樣本骨髓或外周血中的分子標(biāo)志物MLAA-34的相對(duì)表達(dá)量。
[0032] 巧光定量PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min,94°C變性15s,60°C退火延伸Imin,共 45個(gè)循環(huán)。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有W下有益的技術(shù)效果:
[0034] 本發(fā)明將利用化qMan探針,分別擴(kuò)增目標(biāo)基因和管家基因 ABL,W管家基因作為內(nèi) 標(biāo)對(duì)目標(biāo)基因的定量結(jié)果進(jìn)行校正,消除反轉(zhuǎn)錄W及樣品制備過程產(chǎn)生的人為差異對(duì)定量 結(jié)果的影響,建立巧光定量RT-PCR方法檢測(cè)MLAA-34基因表達(dá)水平的方法。利用本發(fā)明提供 的快速簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果可靠、敏感的試劑盒,對(duì)單核細(xì)胞白血病患者體內(nèi)MLAA-34基因表達(dá) 水平進(jìn)行監(jiān)測(cè),敏感度、特異性均較高,且操作方法簡(jiǎn)單,無需跑凝膠電泳,能為急性單核細(xì) 胞白血病的輔助診斷及后續(xù)治療結(jié)果的判定提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0035] 圖1為樣本RNA完整度測(cè)定結(jié)果;
[0036] 圖2為6例樣本及標(biāo)準(zhǔn)品PCR擴(kuò)增曲線;
[0037] 圖3為MLAA-34與內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明,所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0039] 本發(fā)明的特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的引物對(duì)如SEQ ID NO. 1,SEQ ID NO.2所示,探針如沈Q ID NO.3所示。
[0040] 具體的引物、探針信息如下:
[0041 ] MLAA-34F:5 '-GCAAGCTGTGGTTGATCAGTG-3 '
[0042] MLAA-34R:5 '-GATGAAGTAGCCTTTATCGTC-3 '
[004;3] MLAA-34P: FAM-5 ' -ACAACTTCTAAGGAGGCAACCTC-3-TAMRA;
[0044] 檢測(cè)分子標(biāo)志物MLAA-34所需的內(nèi)參基因 ABL,其特異性引物對(duì)如SEQ ID NO.4, 沈Q ID NO.5所示,探針如沈Q ID NO.6所示。
[0045] 具體的引物、探針信息如下:
[0046] A化 F:5'-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3'
[0047] ABL R:5'-GCCTTGGCCATTTTGGTT-3'
[0048] A化 P:FM5'-TGGTGTGAAGCCC-3'TMRA。
[0049] 所述試劑盒的統(tǒng)一濃度及I人份測(cè)試用量的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)為:
[(K)加]
[0化1 ]
[0052] 該巧光定量RT-PCR檢測(cè)方法包括如下步驟:
[0053] 1)血液標(biāo)本的收集:采集人體骨髓或外周血1.5-2ml,邸TA抗凝,低溫冷藏;
[0054] 2)標(biāo)本RNA的提取:標(biāo)本采集后化內(nèi)用化izol法及經(jīng)典氯仿法抽提單核細(xì)胞RNA, DEPC水溶解,-80°C保存;
[0055] 3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):采用商用試劑盒對(duì)步驟2)獲得的樣本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到 CDNA模板,具體每個(gè)樣本RNA用量為IOul,按照試劑盒說明書進(jìn)行;
[0056] 4)巧光定量PCR法檢測(cè)樣本骨髓或外周血中新型分子標(biāo)志物MLAA-34的相對(duì)表達(dá) 量。
[0化7] 5)統(tǒng)計(jì)分析:檢測(cè)599例樣本,包括骨髓血樣本385例(初發(fā)M5 42例、初發(fā)M4 31例、 初發(fā)AML 44例、初發(fā)ALL 32例、其他惡性腫瘤36例、其他非腫瘤疾病41例、完全緩解M5 33 例、復(fù)發(fā)M5 27例,完全緩解M4 32例、完全緩解其他類型AML 34例、完全緩解ALL33例)及外 周血樣本214例(初發(fā)M5 32例、完全緩解M5 30例,復(fù)發(fā)M5 22例,初發(fā)M4 34例、初發(fā)其他類 型AML 31例、初發(fā)ALL 34例、其他非腫瘤疾病31例)后對(duì)檢測(cè)結(jié)果行ROC曲線分析后發(fā)現(xiàn)對(duì) 于骨髓標(biāo)本,當(dāng)MLAA-34相對(duì)表達(dá)量含1.27E-3時(shí),可診斷為初發(fā)M5,此時(shí)診斷的敏感度為1, 特異度為0.815;當(dāng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞MLAA-34表達(dá)量^ 2. Ol祀-5時(shí),可判斷為為M5CR,此時(shí)診 斷的敏感度為0.833,特異度為0.733;當(dāng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞MLAA-34表達(dá)量含2.53祀-3時(shí),可 診斷為M5復(fù)發(fā),此時(shí)診斷的敏感度為0.929,特異度為0.918,診斷準(zhǔn)確度較高。對(duì)于外周血 標(biāo)本,當(dāng)單核細(xì)胞MLAA-34相對(duì)表達(dá)量含1.26祀-3時(shí),可診斷為初發(fā)M5,此時(shí)該檢驗(yàn)方法的 敏感度為0.917,特異度為0.8;當(dāng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞MLAA-34表達(dá)量< 2.014E-5時(shí),可 診斷為M5CR,診斷的敏感度為0.833,特異度為0.725;當(dāng)患者外周血單核細(xì)胞MLAA-34相對(duì) 表達(dá)量^ 2.41化-3時(shí),可診斷為M5復(fù)發(fā),此時(shí)診斷試劑盒的敏感度為0.96,特異度為0.88。
[0058] 具體的,巧光定量PCR反應(yīng)體系:
[0059] 特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病新型分子標(biāo)志物MLAA-34的巧光定量PCR反應(yīng)體 系及內(nèi)參基因 ABL反應(yīng)體系均為:
[0060] 取步驟3)所述的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物加,2XMixl3ul,上下游引物各3ul(加 M),探針 Iul (5uM),體系共25ul,另取濃度分別為1 X 100拷貝All、1 X 1000拷貝All、1 X 10000拷貝/ UiaxiOOOOO拷貝AiUl X 1000000拷貝All的MLAA-:M標(biāo)準(zhǔn)品加,2 XMixl3ul,上下游引物 各3ul (5uM),探針I(yè)ul (5uM),體系共25ul,分別加樣進(jìn)行PCR反應(yīng),內(nèi)參基因反應(yīng)體系同上。
[0061] 取如下各種反應(yīng)液及Mix,室溫融化并震蕩混勻后,短暫離屯、數(shù)秒。MLAA-34反應(yīng) 液、內(nèi)參反應(yīng)液體系I人份均按表1所示,各反應(yīng)液成分如表2所示。
[0062]表1擴(kuò)增試劑需求表 「nnw
[0070] 基線的確定:
[0071] 軟件默認(rèn)設(shè)定3-15個(gè)循環(huán)的平均巧光信號(hào)為基線。在實(shí)驗(yàn)中,一般選擇曲線波動(dòng) 較小,較穩(wěn)定的那段作為基線,可根據(jù)實(shí)際情況自行酌情調(diào)整。起點(diǎn)要避開開始幾個(gè)循環(huán)由 于高溫導(dǎo)致的信號(hào)增高,設(shè)在信號(hào)已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方,終點(diǎn)要避免覆 蓋信號(hào)已經(jīng)有明顯增長(zhǎng)的地方。根據(jù)實(shí)驗(yàn)曲線走勢(shì)的不同,一般start值可選擇在3-8之間; stop值選擇W起點(diǎn)與終點(diǎn)之間最好能間隔8個(gè)循環(huán)W上為原則,W更好滿足統(tǒng)計(jì)基線標(biāo)準(zhǔn) 偏差的數(shù)學(xué)要求。闊值的確定:在陰性對(duì)照物擴(kuò)增的情況下,闊值設(shè)定在無擴(kuò)增曲線樣本的 最高點(diǎn),即高于無擴(kuò)增增長(zhǎng)曲線(即在結(jié)果分析"Component"欄中無拐點(diǎn)出現(xiàn))的最高點(diǎn),切 陰性對(duì)照未檢出為原則,確定起始闊值。
[0072] 結(jié)果判定:
[0073] 陽(yáng)性參考品1-5在MLAA-34和內(nèi)參反應(yīng)中分別設(shè)定為:1 X 1〇6,1 X 1〇5,1 X 1〇4,1 X IO3,1 X IO2,在擴(kuò)增結(jié)束后,用獲得的相應(yīng)兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別得到各標(biāo)本MLAA-34的檢測(cè)濃 度(A)和內(nèi)參基因 AMj勺檢測(cè)濃度(B),報(bào)告為MLAA-34的檢測(cè)濃度(A)和內(nèi)參基因的檢測(cè)濃 度(B)的比值即(A/B) X 100%。
[0074] 實(shí)施例1
[0075] 本實(shí)施例中提供特異性針對(duì)單核細(xì)胞白血病新型分子標(biāo)志物MLAA-34檢測(cè)試劑盒 用于檢測(cè)患者骨髓血或外周血6例未知樣本的操作步驟。
[0076] 1、試劑準(zhǔn)備:
[0077] 根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量,取11份(6人份待測(cè)樣本+5份MLAA-34陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品)X 7ul (77ul )MLAA-34反應(yīng)液與 11 人份 X 13ul 2 XMIX液(143ul)充分預(yù)混成PCR-mixl (220ul),同 理11份(6人份待測(cè)樣本巧份內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品)X 7ul (77ul)內(nèi)參反應(yīng)液與11人份X 13ul 2 X MIX 液(143ul)充分預(yù)混成PCR-mix2(220ul),分別瞬時(shí)離屯、后備用。
[0078] 2、樣本處理和加樣:
[0079] 1)采集20人份骨髓或外周血1.5-2ml,邸TA抗凝,低溫冷藏;
[0080] 2)化izol法提取樣本中單核細(xì)胞RNA:取和樣本等體積的冷藏淋己細(xì)胞分離液加 入離屯、管靜置至室溫,緩慢小屯、吸取骨髓/外周血標(biāo)本距離淋己細(xì)胞分離液液面Icm高度緩 慢滴加,注意上下液面勿混勻;220化pm離屯、20min;小屯、吸取中間的白膜層于EP管中;加入 足量的PBS液吹打混勻,120化pm離屯、5min,棄去上清液,重復(fù)此步驟2-3遍;加入1血Trizol 吹打混勻后于-80°C保存;
[0081 ] 3)取上述-80°c保存的RNA提取液IOOul,加入300U1RNA抽提液用力徹底混勻,加入 200-400U1氯仿,混勻,室溫放置5分鐘。15000巧m離屯、10分鐘,離屯、后吸取無色上清液200-300ul,并轉(zhuǎn)移到1.5ml離屯、管中。在上述裝有上清液的1.5ml離屯、管中加入1-1.5倍體積預(yù) 冷的異丙醇,輕輕顛倒混勻后室溫放置10分鐘。ISOOOrpm離屯、10分鐘,吸棄上清;在上述離 屯、管中,加入700ul預(yù)冷的無水乙醇,ISOOOrpm離屯、10分鐘,吸棄上清。室溫10分鐘,使乙醇 揮發(fā)。加入50ul DEPC-dd出0混勻溶解,W此作為相關(guān)PCR反應(yīng)的模板;
[0082] 4)將上述樣本RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè),結(jié)果如表4所示,所測(cè)A260/280比值均 在1.8到2.0之間,表示RNA純度良好,無明顯有機(jī)溶劑及蛋白質(zhì)、DNA殘留。
[0083] 用化OZil試劑經(jīng)典法提取的樣本RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,漠化乙錠染色后 電泳產(chǎn)物28s 18s 5s條帶清楚無彌散,28s/18s約等于2:1,最上方無 DNA污染條帶,RNA完整 性良好,無明顯降解及DNA污染,如圖1所示。
[0084] 表4樣本RNA純度測(cè)定表
[n0R5l Luubo」 4 j聯(lián)上還FUK化應(yīng)候恢iUui,按化巧巧巧刑晶^閣于上巧概苛生物巧化巧限公巧; 說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);
[0087] 5)分別取上述同一逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物5ul/人份加入2個(gè)不同PCR反應(yīng)管中,取重組 MLAA-34陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品(濃度梯度依次為1 X IO2~1 X IO6拷貝All)各加1分別加入 5個(gè)不同PCR反應(yīng)管中,取陰性對(duì)照物加 1加入2個(gè)PCR反應(yīng)管中,靜置IOmin;
[0088] 6)將上述兩管相同逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物PCR反應(yīng)管及陰性對(duì)照物PCR反應(yīng)管中分別加 入20ul PCR-mixl與PCR-mix2,同理在MLAA-34陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品及A化標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)管中分別加入 20ul PCR-mixl與PCR-mix2,吸打混勻2-3次,蓋上管蓋(去除氣泡),2000巧m離屯、30s。
[0089] 3、在巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
[0090] 1)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽,按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱;
[0091] 2)巧光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Repor ter: FAM,如encher: None)檢測(cè)MLAA-34 與A化表達(dá)量;參比巧光設(shè)置為none;
[0092] 3)巧光定量PCR反應(yīng)條件為:
[0093] 94°C預(yù)變性3min,94°C變性15s,60°C退火延伸Imin,共45個(gè)循環(huán);
[0094] 4)結(jié)果分析:
[00%]反應(yīng)結(jié)束后,儀器自動(dòng)保存結(jié)果,可W利用儀器自帶的軟件進(jìn)行自動(dòng)分析(也可W 手動(dòng)調(diào)芐基線的開始值、結(jié)束值W及闊值線進(jìn)行分析),然后記錄樣本Ct值和定值結(jié)果。擴(kuò) 增曲線和闊值線的交點(diǎn),稱為Ct值(即cycle t虹eshold,指PCR反應(yīng)管內(nèi)的巧光信號(hào)達(dá)到設(shè) 定的闊值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)),擴(kuò)增曲線如圖2所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。
[0096] 使用儀器自帶的軟件分別對(duì)MLAA-34與內(nèi)參基因 A化的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí) 計(jì)算樣本MLAA-34與ABL基因表達(dá)量并導(dǎo)出到EXCEL表格中,MLAA-34表達(dá)量設(shè)為a,ABL表達(dá) 量設(shè)為b,計(jì)算a/b值,結(jié)果設(shè)為C,即為樣本MLAA-34相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果如表5所示。
[0097] 表5樣本MLAA-34相對(duì)表達(dá)量測(cè)定
[00981
[0099] 對(duì)所測(cè)之值進(jìn)行如下判定:
[0100] 對(duì)于骨髓標(biāo)本,樣本1目的基因相對(duì)表達(dá)量含1.27E-3,可診斷為初發(fā)或復(fù)發(fā)M5,樣 本2、3、4、5、6均為非]?5。
[0101] 本發(fā)明通過化qman探針巧光定量PCR法對(duì)人體內(nèi)單核細(xì)胞白血病新型分子標(biāo)志物 MLAA-34表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),對(duì)于骨髓血標(biāo)本,當(dāng)此試劑盒用于M5臨床診斷時(shí),診斷的敏感 度為1,特異度為0.815 ;當(dāng)此試劑盒用于判斷M5療效時(shí),診斷的敏感度為0.833,特異度為 0.733;當(dāng)此試劑盒用于判斷M5復(fù)發(fā)時(shí)診斷的敏感度為0.929,特異度為0.918,診斷準(zhǔn)確度 較高。對(duì)于外周血標(biāo)本,當(dāng)此試劑盒用于M5臨床診斷時(shí),該檢驗(yàn)方法的敏感度為0.917,特異 度為0.8;當(dāng)此試劑盒用于判斷M5療效時(shí),診斷的敏感度為0.833,特異度為0.725;當(dāng)此試劑 盒用于判斷M5復(fù)發(fā)時(shí),診斷的敏感度為0.96,特異度為0.88。此試劑盒檢測(cè)敏感度、特異度 較高且操作方法簡(jiǎn)單,能為急性單核細(xì)胞白血病的輔助診斷及后續(xù)治療結(jié)果的判定提供依 據(jù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的引物對(duì)和探針,其特征 在于,特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1 所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示,探針序列如SEQ ID NO.3所示。2. -種特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于,包括特異性針對(duì)急 性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的引物對(duì)和探針,以及檢測(cè)急性單核細(xì)胞白血病分 子標(biāo)志物MLAA-34所需內(nèi)參基因 ABL的引物對(duì)及探針;其中: 特異性針對(duì)急性單核細(xì)胞白血病分子標(biāo)志物MLAA-34的上游引物序列如SEQ ID NO. 1 所示,下游引物序列如SEQ ID NO.2所示,探針序列如SEQ ID NO.3所示; 內(nèi)參基因 ABL的上游引物序列如SEQ ID NO.4所示,下游引物序列如SEQ ID NO.5所示, 探針序列如SEQ ID NO.6所示。3. 如權(quán)利要求2所述的特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于,試 劑盒內(nèi)包括:1)待檢測(cè)標(biāo)本;2)陰性對(duì)照品;3)陽(yáng)性參考品;4)分子標(biāo)志物MLAA-34反應(yīng)液; 5)內(nèi)參基因 ABL反應(yīng)液;6) 2 X Mix;試劑盒中的試劑量滿足20人份測(cè)試使用。4. 如權(quán)利要求3所述的特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于,1人 份測(cè)試用量的目的基因熒光定量PCR反應(yīng)體系包括: cDNA模板 5ul; MLAA-34反應(yīng)液 7ul; 2XMix 13ul; 其中,cDNA模板為提取的待檢測(cè)標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物; MLAA-34反應(yīng)液中包含3u 1上游引物、3u 1下游引物及l(fā)u 1探針。5. 如權(quán)利要求3所述的特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于,1人 份測(cè)試用量的內(nèi)參基因反應(yīng)體包括: cDNA模板 5ul; 內(nèi)參基因ABL反應(yīng)液 7ul; 2XMix 13ul; 其中,cDNA模板為提取的待檢測(cè)標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物; 內(nèi)參基因 ABL反應(yīng)液中包含3ul上游引物、3ul下游引物及l(fā)ul探針。6. 如權(quán)利要求3所述的特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒,其特征在于,所 述的陰性對(duì)照品采用工藝用水;所述的陽(yáng)性參考品采用質(zhì)粒混合液,包括IX 1〇2~IX 1〇6拷 貝的MLAA-34參考品,以及1 X 102~1 X 106拷貝的ABL參考品。7. 利用權(quán)利要求3~6中任意一項(xiàng)所述的特異性檢測(cè)MLAA-34的熒光定量RT-PCR試劑盒 進(jìn)行檢測(cè)的方法,其特征在于,包括以下步驟: 1) 取采集的人體骨髓或外周血1.5~2ml,用EDTA抗凝,低溫冷藏備用; 2) 將采集的血液標(biāo)本在2h內(nèi)用Trizol法及經(jīng)典氯仿法抽提單核細(xì)胞RNA,DEPC水溶 解,-80 °C保存; 3) 采用商用試劑盒對(duì)步驟2)獲得的樣本RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到cDNA模板; 4) 將cDNA模板、MLAA-34反應(yīng)液及2 XMix混合后,組成反應(yīng)體系,同時(shí),cDNA模板、內(nèi)參 基因 ABL反應(yīng)液及2 XMix混合后,組成該樣本的內(nèi)參反應(yīng)體系;再制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后采用 熒光定量PCR法檢測(cè)樣本骨髓或外周血中的分子標(biāo)志物MLAA-34的相對(duì)表達(dá)量。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法,其特征在于,熒光定量PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 3min,94°C變性15s,60°C退火延伸lmin,共45個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861720SQ201610368148
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】何愛麗, 楊云, 白菊, 陳娜, 王劍利, 王芳俠, 張鵬宇, 張王剛, 王佰言, 陳紅利, 王夏曼, 沈瑩, 蒙昕
【申請(qǐng)人】西安交通大學(xué)