一種肝素鈉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種肝素鈉的制備方法，該制備方法包括粗品除雜、酶解、酸性除雜、氧化、凍干、粉碎，能夠去除肝素鈉中絲氨酸，克服了現(xiàn)有技術(shù)中肝素鈉制備方法不適宜大批量生產(chǎn)的局限，具有工藝操作簡單，提高肝素結(jié)構(gòu)完整度和效價(jià)。
【專利說明】
一種肝素鈉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種肝素及其衍生物，特別涉及一種肝素鈉的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是由糠醛酸和氨基葡萄糖以1-4糖苷鍵連起來的重復(fù)二糖單元組成的線性粘多糖，其廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織中，由結(jié)締組織性肥大細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生。肝素在動(dòng)物體內(nèi)大部分以肝素鈉-蛋白復(fù)合物的形式存在。由于肝素鈉解離不完全，肝素提取方法會(huì)殘留以共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白質(zhì)和以靜電結(jié)合的帶正電蛋白質(zhì)。
[0003]目前，國內(nèi)外發(fā)表了許多去除肝素中絲氨酸的方法，例如Keiichi Takagaki在2002年報(bào)道了采用具有β -內(nèi)切木糖苷酶活性的纖維素酶去除肝素絲氨酸的方法；Yu_kiMatsuno在2007年報(bào)道了堿性條件下β -消除反應(yīng)去除肝素絲氨酸的方法；ViskoV等在2008年報(bào)道了用高錳酸鉀除去絲氨酸的方法。上述前第一種方法和第二種方法都先要分離特定分子量的肝素片段，然后除去特定肝素片段的絲氨酸殘基，不符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。上述第三種方法對(duì)肝素的四糖連接區(qū)造成破壞性影響，不符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]基于上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種肝素鈉的制備方法，該制備方法能夠去除肝素鈉中絲氨酸，符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。
[0005]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案:
[0006]一種肝素鈉的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0007]I)在25?35°C下，以20% (g/mL)濃度將粗品肝素鈉溶解于純化水中，以4?5%(g/mL)的濃度加入氯化鈉，待溶解后調(diào)節(jié)pH至10.0?10.5，攪拌3.5?4.0小時(shí)，然后升溫至80?85°C，調(diào)節(jié)pH至9.5?10.0，靜置10分鐘，迅速降溫至20°C以下，靜置4?5小時(shí)后過濾，取濾液；
[0008]2)將步驟I得到的濾液升溫至45?50°C，用18 % (g/mL)的鹽酸水溶液或20 %(g/mL)的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0?9.0，加入胰酶反應(yīng)4?5小時(shí)，再以2% (g/mL)的濃度加入氯化鈣，攪拌溶解后升溫至80?85°C，繼續(xù)攪拌10分鐘，再降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0009]3)向步驟2得到的上清液補(bǔ)加清水至步驟I中粗品肝素鈉水溶液的初始體積，升溫至45?50°C,用18% (g/mL)鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5?5.5,加入纖維素酶攪拌下反應(yīng)6?8小時(shí)，加入氯化鈣，攪拌溶解，升溫至80?85°C，攪拌10分鐘，降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0010]4)向步驟3得到的上清液加入95% (體積比)乙醇水溶液，攪拌均勻，降溫至O?50C，調(diào)節(jié)pH至1.0?2.0，離心，取上清液，迅速調(diào)節(jié)pH至6.0?7.0 ;
[0011 ] 5)向步驟4得到的上清液加入95 % (體積比)乙醇水溶液至20 V下的乙醇濃度為40?45°，靜置12?24小時(shí)，抽取上層乙醇，得濕沉淀；
[0012]6)以30?35 % (g/mL)的濃度將步驟5得到的濕沉淀溶解在純化水中，加入25 %(g/mL)的次氯酸水溶液,用18% (g/mL)的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5?5.0, 20?30°C下靜置6?8小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6.0?7.0，以1.5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，攪拌溶解，力口入95 % (體積比)乙醇水溶液至20 V下的乙醇濃度為40?45°，靜置6?8小時(shí)，抽去上層乙醇得到濕沉淀。
[0013]7)以30?35 % (g/mL)的濃度將步驟6得到的濕沉淀溶解在純化水中，用20 %(g/mL)的氫*氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.0?10.5,25?30°C下加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置4小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置8小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置12小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6?7，過濾，得濾液。
[0014]8)將上述步驟7的濾液凍干，粉碎。
[0015]本發(fā)明能夠達(dá)到如下有益效果:
[0016]I)產(chǎn)品中肝素結(jié)構(gòu)完整，不含絲氨酸殘基，效價(jià)更高；
[0017]2)符合USP和EP的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019]I)在25°C下，以20% (g/mL)濃度將粗品肝素鈉溶解于純化水中，以4% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，待溶解后調(diào)節(jié)PH至10.0，攪拌3.5小時(shí)，然后升溫至80°C，調(diào)節(jié)pH至
9.5，靜置10分鐘，迅速降溫至20°C以下，靜置4小時(shí)后過濾，取濾液；
[0020]2)將步驟I得到的濾液升溫至45°C，用18 % (g/mL)的鹽酸水溶液或20 % (g/mL)的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至8.0，加入胰酶反應(yīng)4小時(shí)，再以2% (g/mL)的濃度加入氯化鈣，攪拌溶解后升溫至80°C，繼續(xù)攪拌10分鐘，再降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0021]3)向步驟2得到的上清液補(bǔ)加清水至步驟I中粗品肝素鈉水溶液的初始體積，升溫至45°C，用18% (g/mL)鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，加入纖維素酶攪拌下反應(yīng)6小時(shí)，力口入氯化鈣，攪拌溶解，升溫至80°C，攪拌10分鐘，降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0022]4)向步驟3得到的上清液加入95% (體積比)乙醇水溶液，攪拌均勻，降溫至(TC，調(diào)節(jié)pH至1.0,離心,取上清液,迅速調(diào)節(jié)pH至6.0 ;
[0023]5)向步驟4得到的上清液加入95 % (體積比)乙醇水溶液至20 V下的乙醇濃度為40°，靜置12小時(shí)，抽取上層乙醇，得濕沉淀；
[0024]6)以30% (g/mL)的濃度將步驟5得到的濕沉淀溶解在純化水中，加入25 % (g/mL)的次氯酸水溶液，用18% (g/mL)的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，20°C下靜置6小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6.0，以1.5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，攪拌溶解，加入95% (體積比)乙醇水溶液至20°C下的乙醇濃度為40°，靜置6小時(shí)，抽去上層乙醇得到濕沉淀。
[0025]7)以30 % (g/mL)的濃度將步驟6得到的濕沉淀溶解在純化水中，用20 % (g/mL)的氣氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.0,25°C下加入30% (g/mL)的過氧化氣水溶液,靜置4小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置8小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置12小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6，過濾，得濾液。
[0026]8)將上述步驟7的濾液凍干，粉碎。
[0027]實(shí)施例2
[0028]I)在35°C下，以20% (g/mL)濃度將粗品肝素鈉溶解于純化水中，以5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，待溶解后調(diào)節(jié)PH至10.5，攪拌4.0小時(shí)，然后升溫至85°C，調(diào)節(jié)pH至
10.0，靜置10分鐘，迅速降溫至20°C以下，靜置5小時(shí)后過濾，取濾液；
[0029]2)將步驟I得到的濾液升溫至50°C，用18% (g/mL)的鹽酸水溶液或20% (g/mL)的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至9.0，加入胰酶反應(yīng)5小時(shí)，再以2% (g/mL)的濃度加入氯化鈣，攪拌溶解后升溫至85°C，繼續(xù)攪拌10分鐘，再降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0030]3)向步驟2得到的上清液補(bǔ)加清水至步驟I中粗品肝素鈉水溶液的初始體積，升溫至50°C，用18% (g/mL)鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，加入纖維素酶攪拌下反應(yīng)8小時(shí)，力口入氯化鈣，攪拌溶解，升溫至85°C，攪拌10分鐘，降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液；
[0031]4)向步驟3得到的上清液加入95% (體積比)乙醇水溶液，攪拌均勻，降溫至5°C，調(diào)節(jié)pH至2.0,離心,取上清液,迅速調(diào)節(jié)pH至7.0 ;
[0032]5)向步驟4得到的上清液加入95 % (體積比)乙醇水溶液至20 V下的乙醇濃度為45°，靜置24小時(shí)，抽取上層乙醇，得濕沉淀；
[0033]6)以35% (g/mL)的濃度將步驟5得到的濕沉淀溶解在純化水中，加入25 % (g/mL)的次氯酸水溶液，用18% (g/mL)的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，30°C下靜置8小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至7.0，以1.5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，攪拌溶解，加入95% (體積比)乙醇水溶液至20°C下的乙醇濃度為45°，靜置8小時(shí)，抽去上層乙醇得到濕沉淀。
[0034]7)以35 % (g/mL)的濃度將步驟6得到的濕沉淀溶解在純化水中，用20 % (g/mL)的氣氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至10.5, 30°C下加入30% (g/mL)的過氧化氣水溶液,靜置4小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置8小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置12小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至7，過濾，得濾液。
[0035]8)將上述步驟7的濾液凍干，粉碎。
[0036]上述實(shí)施例應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體描述，不應(yīng)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明做出的各種相同或等同的變形，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種肝素鈉的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟: 1)在25?35°C下，以20%(g/mL)濃度將粗品肝素鈉溶解于純化水中，以4?5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，待溶解后調(diào)節(jié)pH至10.0?10.5，攪拌3.5?4.0小時(shí)，然后升溫至80?85°C，調(diào)節(jié)pH至9.5?10.0，靜置10分鐘，迅速降溫至20°C以下，靜置4?5小時(shí)后過濾，取濾液； 2)將步驟I得到的濾液升溫至45?50°C，用18%(g/mL)的鹽酸水溶液或20% (g/mL)的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0?9.0，加入胰酶反應(yīng)4?5小時(shí)，再以2% (g/mL)的濃度加入氯化鈣，攪拌溶解后升溫至80?85°C，繼續(xù)攪拌10分鐘，再降溫至40°C以下，以2% (g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液； 3)向步驟2得到的上清液補(bǔ)加清水至步驟I中粗品肝素鈉水溶液的初始體積，升溫至45?50°C,用18% (g/mL)鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5?5.5,加入纖維素酶攪拌下反應(yīng)6?8小時(shí)，加入氯化鈣，攪拌溶解，升溫至80?85°C，攪拌10分鐘，降溫至40°C以下，以2%(g/mL)的濃度加入碳酸鈉，持續(xù)攪拌30分鐘，離心，取上清液； 4)向步驟3得到的上清液加入95%(體積比)乙醇水溶液，攪拌均勻，降溫至O?5°C，調(diào)節(jié)pH至1.0?2.0,離心,取上清液,迅速調(diào)節(jié)pH至6.0?7.0 ; 5)向步驟4得到的上清液加入95%(體積比)乙醇水溶液至20°C下的乙醇濃度為40?45°，靜置12?24小時(shí)，抽取上層乙醇，得濕沉淀； 6)以30?35%(g/mL)的濃度將步驟5得到的濕沉淀溶解在純化水中，加入25% (g/mL)的次氯酸水溶液，用18% (g/mL)的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至4.5?5.0,20?30°C下靜置6?8小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6.0?7.0，以1.5% (g/mL)的濃度加入氯化鈉，攪拌溶解，加入95% (體積比)乙醇水溶液至20°C下的乙醇濃度為40?45°，靜置6?8小時(shí)，抽去上層乙醇得到濕沉淀； 7)以30?35%(g/mL)的濃度將步驟6得到的濕沉淀溶解在純化水中，用20% (g/mL)的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH至10.0?10.5，25?30°C下加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置4小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置8小時(shí)，加入30% (g/mL)的過氧化氫水溶液，靜置12小時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6?7，過濾，得濾液； 8)將上述步驟7的濾液凍干，粉碎。
【文檔編號(hào)】C08B37/10GK105884936SQ201410550163
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月17日
【發(fā)明人】楊軍
【申請(qǐng)人】北京海吉星醫(yī)療科技有限公司