一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方的制作方法
【專利摘要】一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其配方中包括密度梯度成分，如碘海醇、泛影酸鈉、碘克沙醇等，加入提高滲透壓和防止組織和細胞水腫的物質(zhì)，如棉子糖、海藻糖等，再加入釓噴酸葡胺，其溶劑為DMEM等培養(yǎng)液和HBSS等緩沖液。本發(fā)明解決了目前大動物及人的組織和細胞密度梯度分離困難，分離的組織和細胞活性低等問題，使那些消化或機械分散后不同密度的細胞和組織可通過本密度梯度液在離心條件下達到分離。我們設(shè)計了此種密度梯度溶液，對于促進國內(nèi)外組織和細胞的分離研究，具有一定的應(yīng)用價值。本發(fā)明原理簡單，制備容易、使用方便，可達到規(guī)?；a(chǎn)。本專利的申報為該密度梯度分離液的開發(fā)及應(yīng)用于打下了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種組織和細胞純化過程中單獨使用或與其他溶液共同配合使用的 密度梯度溶液配方，具體涉及一種基于細胞培養(yǎng)液基礎(chǔ)上的組織和細胞純化用的密度梯度 溶液，用于動物或人的組織和細胞的密度梯度純化。
【背景技術(shù)】
[0002] 美國著名生物學(xué)家喬治·戴利說："二十世紀是藥物治療的時代，二十一世紀是細 胞治療的時代"。人類移植學(xué)的發(fā)展是20世紀醫(yī)學(xué)中最杰出的成就之一，尤其是上世紀70年 代末至80年代初，新的免疫抑制劑問世，使移植物的存活率和器官移植的臨床療效大為提 高。近年來由于臨床移植病例大量增加，供體的短缺顯得非常突出。進入21世紀，臨床移植 術(shù)的研究和應(yīng)用又被再次推向高潮，細胞移植，如骨髓移植、干細胞移植和胰島細胞移植均 取得了顯著的療效。
[0003] 細胞移植是指將指將人體器官、組織來源的具有正常生理功能的適量游離的活細 胞移植到受體(人或動物)的血管、體腔或組織器官內(nèi)，以達到治療目的的技術(shù)。細胞移植的 臨床應(yīng)用日益廣泛，其中骨髓與造血干細胞移植備受矚目，可用于治療遺傳性聯(lián)合免疫缺 陷病、重癥地中海貧血等遺傳性疾病、重癥再生障礙性貧血，以及包括各種白血病在內(nèi)的血 液系統(tǒng)惡性腫瘤等疾病。此外，還有胰島細胞移植治療1型糖尿病，肝細胞移植治療重癥肝 炎肝昏迷，脾細胞移植治療重癥血友病甲，以及睪丸Leydig細胞移植治療男性性功能低下 (低睪酬血癥)等。
[0004] 細胞移植(如胰島細胞移植、骨髓移植、干細胞移植、肝細胞移植等)在糖尿病、癌 癥、肝病、遺傳病及組織損傷等疾病的治療上顯示出越來越高的應(yīng)用價值，在部分治療領(lǐng) 域，如糖尿病、白血病等方面已大大超越了大器官移植和放化療的治療手段，已成為目前外 科器官移植發(fā)展的重要方向。
[0005] 細胞移植是外科學(xué)移植的新方向，是國家863重點資助方向之一，屬于新興生物醫(yī) 藥產(chǎn)業(yè)，對細胞的研究與應(yīng)用是心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病等治療的新 途徑和新希望，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域國際競爭的熱點。該新興生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)具有高科技、高附加值、 成本低、污染少的優(yōu)勢，是政府重點扶持方向。
[0006] 胰島移植為根治臨床1型糖尿病和2型糖尿病終末期患者的好方法，胰島細胞移植 因其對胰腺供體要求低、移植操作簡單，幾乎不需要手術(shù)、副作用小，而全胰腺移植對供體 要求高、外分泌腺處理復(fù)雜，術(shù)后并發(fā)癥多;近幾年來隨著新型免疫抑制方案的應(yīng)用，胰島 細胞的基礎(chǔ)研究，胰島分離、純化的數(shù)量與質(zhì)量也得到了很大的提升，胰島移植在糖尿病的 臨床治療中獲得了重大進展;據(jù)2012年報道，胰島移植后5年胰島素不依賴率已經(jīng)達到了 50%，與全胰腺移植(52%)已沒有差異。醫(yī)學(xué)界一直將胰島細胞移植推崇為治療糖尿病最 理想的方法，胰島移植的臨床應(yīng)用已成為不可阻擋的趨勢，正如世界胰腺移植的鼻祖 Sutherland醫(yī)生在世界移植大會上所預(yù)言的，胰島移植正取代胰腺移植在世界上逐步推廣 應(yīng)用，成為糖尿病患者的福音。在未來幾十年里，胰島移植將可能成為治療血糖不穩(wěn)定1型 糖尿病和2型糖尿病終末期患者的最佳選擇。
[0007] 胰島細胞移植治療血糖不穩(wěn)型1型糖尿病和2型糖尿病終末期患者的研究已在全 世界走過了40多年，尤其在2000年加拿大Sharpiro教授領(lǐng)導(dǎo)的團隊公布了 "Edmonton方案" 以后。事實證明，胰島移植不僅能控制病人的血糖，更重要的是能夠抑制和改善病人并發(fā)癥 的發(fā)生。但是Edmonton胰島移植治療計劃還不夠完善，病人能長期完全脫離胰島素依賴的 結(jié)果還不是很理想。胰島移植的臨床應(yīng)用在近幾年進展很快，早在2004年，由美國NIH投入 1.7億美元開展臨床胰島分離及移植程序的標準化和7個新的免疫治療方案的評估項目，其 中項目名為CIT07的免疫治療方案進行了臨床48例患者的治療，術(shù)后患者全部脫離胰島素 治療，部分病人完全不用胰島素治療已超過4年，胰島生存時間已達到全胰腺移植水平。加 拿大、歐洲和澳大利亞等國家已批準胰島移植進入醫(yī)療保險，自體胰島移植在美國也早已 進入醫(yī)療保險。目前隨著人口老齡化的加劇，國內(nèi)糖尿病、胰腺疾病等的發(fā)病率逐年上升， 細胞移植技術(shù)也必將在國內(nèi)將逐漸蓬勃發(fā)展起來。
[0008] 胰島分離純化的目的是從胰腺消化后的組織中提取完整的胰島，該步驟的主要原 理是胰島細胞比外分泌/導(dǎo)管組織有一個更低的密度。如果這些類型細胞在胰腺消化過程 中已被有效分離，則我們可以通過很多手段將胰島細胞純化出來。在人胰島的大規(guī)模純化 中最重要的進展是使用C0BE 2991細胞分離機用于胰島的純化。該離心機最初是專門用于 分離血液中不同的細胞成分，但基于胰腺消化后不同組織的密度差，該機器也適用于分離 人膜島。
[0009] 密度梯度離心(density gradient centrifugation)亦稱平衡密度梯度離心法。 用離心機對小分子物質(zhì)溶液，長時間加一個離心力場達到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到 底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子或組織、細胞溶液，則溶液內(nèi)比溶 劑密度大的部分就產(chǎn)生沉降，比溶劑密度小的部分就會上浮，最后在離心力和浮力平衡的 位置，集聚形成沉降物的帶狀物。利用這種現(xiàn)象，可測定核酸或蛋白質(zhì)等的浮游密度，或根 據(jù)其差別進行分離細胞或組織的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜(M.Meselson)，斯塔 爾(F. W. Stahl)，維諾格拉德(J. Vinograd)成功地分離了〔 15N〕DNA和〔14N〕DNA以來，該法取 得許多成果。該方法多采用濃氯化銫溶液，所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名 稱，還可采用氯化銣、溴化銫等溶液。
[0010] 但在細胞或組織等以純化為目的的分離，也常使用離心機利用預(yù)先制備好的蔗糖 等密度梯度液的密度差進行分離。其工作原理為:不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定 離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。密度梯 度介質(zhì)應(yīng)預(yù)先形成，介質(zhì)的最大密度要小于所有樣品顆粒的密度。
[0011] 密度梯度如果是不連續(xù)的，組織在密度相近的密度界面重疊;密度梯度也可以是 連續(xù)的密度梯度，這樣細胞可以根據(jù)梯度液的精確密度進行有效的分離。
[0012] 對于密度梯度溶液的配制，國外有一些相關(guān)的文獻介紹，其中一些已用于胰島純 化，包括鹿糖、聚鹿糖(Ficoll)、透析聚鹿糖(dialysed Ficoll)、聚鹿糖泛影葡胺(Ficoll Hypaque)、甲泛葡胺(Metrizamide)、膠體娃(Percoll)、聚鹿糖康瑞(Ficoll Conray)、葡聚 糖（Dextran)、牛血清白蛋白溶液、聚鹿糖泛影酸鈉 （Ficoll Diatrizoic)、碘克沙醇 (〇虹1&]1〇1)和碘海醇07〇〇(161^)，等。另外還有對5〇個等密度分離用密度梯度介質(zhì)的介紹 說不會改變胰島密度和外分泌組織密度重疊的事實。常用于人胰島分離純化的兩個密度梯 度介質(zhì)為Euro-Ficoll和高滲透壓牛血清白蛋白（500m0sm/kg/H20) jicoll和牛血清白蛋 白對于細胞分離的利弊已在一些文獻上有過論述。Ficoll的優(yōu)勢在于其溶液澄清透明，可 高壓滅菌和非動物來源。它的缺點是加劇細胞的聚集和高濃度時通過結(jié)合水來顯著增加滲 透性能。牛血清白蛋白的優(yōu)點是對細胞有一定的保護作用和降低細胞聚集，缺點是來源于 動物和易被污染。胰島分離純化的發(fā)展也已經(jīng)顯示溶解密度梯度成分的溶液組成比密度梯 度成分更重要，這個事實在其他細胞的分離中也已發(fā)現(xiàn)了多年。
[0013] 胰島分離的密度梯度液也在不斷的改進。如通過在UW液中增加額外的羥乙基淀粉 溶液或膠體硅(Percoll)來配制密度梯度液；由Ficoll密度梯度液(1.100g/ml)和UW液兩種 溶液組成新的密度梯度液，雖然這種修改減少了密度梯度的范圍，但它允許加載更多的消 化組織(原來的兩倍多），并可在一輪純化中進行有效分離。這加快了全部的胰腺處理時間 (原來的連續(xù)密度梯度技術(shù)往往需要2輪純化）。然而，這種調(diào)整可能并不適合所有的胰島分 離中心，因為UW液的最佳使用溫度在4°C，所以為了保證胰島活性，C0BE 2991必須改裝并在 這個溫度下運行，被安置在一個冷的房間。
[0014] 為了增加待分離的組織或細胞間的密度差，防止組織或細胞的水腫是一個重要的 措施。這方面可采用加入一些大分子非滲透的滲透壓促進劑來實現(xiàn)，如棉子糖、海藻糖、乳 糖酸鉀、羥乙基淀粉等。
[0015] 為了更好的保持待分離物質(zhì)在密度梯度分離液中的活性，本發(fā)明采用細胞培養(yǎng)液 DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199或緩沖液HBSS、Hanks液作為該密度梯度分離液的溶劑， 經(jīng)實驗證明，分離得到的組織和細胞活性良好。
[0016] IL噴酸葡胺（Gadopentetate dimeglumine)又稱為IL噴酸葡甲胺、二乙稀三胺五 醋酸釓雙葡甲胺、釓噴葡胺或馬根維顯，是一種常用的核磁共振的造影劑。本品靜脈給藥后 很快彌散到體內(nèi)各組織的細胞外液內(nèi)，然后經(jīng)腎小球濾過以原形排出，有少量分泌于胃腸 道后隨糞便排出，不良反應(yīng)少。其分子量為938，臨床用濃度為:37%-47%。經(jīng)實驗證明，將 釓噴酸葡胺加入至上述由聚蔗糖400、碘克沙醇、碘海醇等密度梯度成分與棉子糖、海藻糖、 乳糖酸鉀、羥乙基淀粉等成分，以細胞培養(yǎng)液DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199或緩沖液 HBSS、Hanks溶液為溶劑配成的密度梯度液中，可顯著增加待分離成分的分離效果。
[0017]本發(fā)明專利以碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅、聚蔗糖400-種或 幾種成分的混合作為主要密度梯度物質(zhì)，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉一種或 幾種成分的混合作為防止組織和細胞水腫的物質(zhì)，再加入釓噴酸葡胺，以DMEM、RPMI 1640、 CMRL 1066、M199培養(yǎng)液中的一種或其改進后的溶液中的一種為溶劑，配制得到的一種組織 和細胞密度梯度分離溶液。
[0018]除去聚蔗糖400,密度梯度溶液的配方中的密度梯度成分為碘克沙醇、碘海醇、泛 影酸鈉、膠體硅、甲泛葡胺、膠體硅一種或幾種成分的混合作為主要密度梯度物質(zhì)，以棉子 糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉一種或幾種成分的混合作為防止組織和細胞水腫的物 質(zhì)，再加入釓噴酸葡胺，還可以HBSS、Hanks液中的一種或其改進后的溶液中的一種為溶劑， 配制得到的一種組織和細胞密度梯度分離溶液。
[0019] 密度梯度液的質(zhì)量可通過對其溶液質(zhì)量、組織和細胞分離效率進行評價。
[0020] 犬或獼猴等大動物或人的組織和細胞移植往往先需要進行組織和細胞的分離，密 度梯度離心又是這些分離方法中較常用的方法，如胰島組織的分離。如果能得到大量高純 度、活性好的胰島細胞，將對其體內(nèi)移植和提高糖尿病治療效果有重要作用。本專利的申報 為該密度梯度分離液的開發(fā)及應(yīng)用于打下了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 針對目前大動物或人體組織和細胞移植的趨勢不斷發(fā)展，對組織分離的純度、量 和活性或功能的要求也越來越高，才能保證更好的移植效果，因此我們設(shè)計了此種新型組 織和細胞分離純化試劑，可提高組織和細胞的分離效率，彌補常規(guī)分離試劑在分離細胞的 效率和活性方面的不足，對于促進國內(nèi)細胞和組織的分離和移植研究，具有較好的應(yīng)用價 值。本組織和細胞分離溶液也為進行該產(chǎn)品的臨床細胞和組織移植應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0022] 本發(fā)明專利的目的在于提供一種原理簡單，制備容易，使用方便，組織和細胞分離 效率高，活性好的密度梯度純化試劑，使用此密度梯度液，結(jié)合密度梯度離心，可使相關(guān)的 密度不同的組織和細胞進行分離。
[0023] 本發(fā)明是采用下述方案實現(xiàn)的，一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的 密度梯度成分為碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅、聚蔗糖400中的一種或幾 種組合組成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉一種或幾種組合作為提高滲透壓和 防止組織和細胞水腫的物質(zhì)，其溶劑成分為DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199培養(yǎng)液中的 一種或其改進后的溶液中的一種。
[0024] -種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的密度梯度成分為碘克沙醇、碘海 醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅中的一種或幾種組合組成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥 乙基淀粉中的一種或幾種組合作為提高滲透壓和防止組織和細胞水腫的物質(zhì)，其溶劑成分 為HBSS、Hanks液中的一種或其改進后的溶液中的一種。
[0025] -種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中還含有釓噴酸葡胺。
[0026] 所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中密度梯度各成分通常在密 度梯度液中使用的濃度為碘克沙醇5%_70%，碘海醇3%-75%，泛影酸鈉3%-75%，甲泛葡 胺3%-75%，膠體硅3%-75%，聚蔗糖4003%-75%。
[0027] 所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的提高滲透壓和防止組織 和細胞水腫的成分通常在密度梯度液中使用的濃度為棉子糖〇 . 5 % -50 %、海藻糖0.5 % -55%、乳糖酸鉀0.5%-35%、羥乙基淀粉0.1 %-30%。
[0028] -種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中釓噴酸葡胺濃度可為0.1%-65%。 [0029] 所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的溶劑成分可以為DMEM、 RPMI1640、CMRL 1066、M199培養(yǎng)液中的一種或其改進后溶液中的一種，如溶劑分別為0.5-5 倍濃度的DMEM溶液，0.5-5倍濃度的RPMI 1640溶液，0.5-5倍濃度的CMRL 1066溶液，0.5-5 倍濃度的Ml 99溶液。
[0030] 所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的溶劑成分可以為HBSS、 Hanks液中的一種或其改進后溶液中的一種，如溶劑分別為0.5-5倍濃度的HBSS，0.5-5倍濃 度的Hanks液。
[0031] 所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液其制備方法一般為將密度梯度成分、 提高滲透壓和防止組織、細胞水腫的成分和釓噴酸葡胺，溶解于相應(yīng)的溶劑中，過濾除菌即 得。
[0032] 本發(fā)明由于采用上述方案，將碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅、聚 蔗糖400中的一種或幾種組合，提高滲透壓和防止細胞水腫成分棉子糖、海藻糖、乳糖酸 鉀、羥乙基淀粉中的一種或幾種組合，再加入釓噴酸葡胺，結(jié)合DMEM、RPMI 1640、CMRL1066、 M199培養(yǎng)液中的一種或其改進后溶液中的一種，制備成一種組織和細胞分離用的密度梯度 液。
[0033] 本發(fā)明由于采用上述方案，將碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅中的 一種或幾種組合，提高滲透壓和防止細胞水腫成分棉子糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉 中的一種或幾種組合，再加入釓噴酸葡胺，結(jié)合HBSS、Hanks液中的一種或其改進后溶液中 的一種，制備成一種組織和細胞分離用的密度梯度液。
[0034]本發(fā)明原理簡單，制備容易，使用方便，組織和細胞分離結(jié)果理想，可達到規(guī)?；?批量生產(chǎn)，起到促進組織和細胞分離，促進臨床和科研領(lǐng)域的細胞移植研究應(yīng)用。
【附圖說明】
[0035] 附圖1為實施例2高密度液和實施例3低密度液進行密度梯度混合的過程中，用 15ml離心管每1分鐘收集的密度梯度混合液，測得的混合液密度梯度變化曲線。
【具體實施方式】
[0036] 本發(fā)明的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液，由于采用上述方案，將碘克沙醇、 碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅、聚蔗糖400,提高滲透壓和防止細胞水腫成分棉子糖、 海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉，再加入釓噴酸葡胺，結(jié)合DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、 HBSS、Hanks、M199培養(yǎng)液或、HBSS、Hanks液其中一種或改進后溶液的一種，其制備方法一般 為將密度梯度成分、提高滲透壓和防止細胞水腫成分和釓噴酸葡胺，溶解于相應(yīng)的溶劑中， 過濾除菌即得一種組織和細胞分離用的密度梯度液。
[0037] 實施例1
[0038]本發(fā)明實施例1的一種組織和細胞純化過程中使用的密度梯度液配方如下：
[0039] (1)配方一:碘克沙醇248.0g，乳糖酸鉀15g，釓噴酸葡胺5g，RPMI1640定容至1L。
[0040] (2)制備工藝：
[0041 ] 1)取RPMI 1640各成分(RPMI 1640的成分可參考下表1)，先用80%的三蒸水進行 溶解，必要時先用HC1調(diào)酸進行溶解，再用NaOH進行調(diào)pH值中和，再用三蒸水定容至1L。
[0042] 表1RPMI 1640各成分表
[0043]
[0044]
[0045] 2)準確稱取碘克沙醇248. Og，乳糖酸鉀15g，釓噴酸葡胺5g，至1L滅菌后玻璃瓶中， 用800ml上述RPMI 1640溶液溶解，再用上述RPMI 1640溶液定容至1L。必要時用IN HC1或 NaOH調(diào)pH至7.2±0.2，用手持式電子密度計測定密度為1.132±0.001g/ml，如果沒有，則可 少量加入碘克沙醇或RPMI 1640進行密度調(diào)整。
[0046] 3)在B級背景下局部A級潔凈區(qū)先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔濾膜過濾，500mL/瓶。
[0047] (3)配方二:碘克沙醇248.0g，乳糖酸鉀15g，RPMI1640定容至1L。
[0048] (4)制備工藝：制備工藝同配方一。用手持式電子密度計測定密度為1.132土 0.001 g/ml，如果沒有，則可少量加入碘克沙醇或RPMI 1640進行密度調(diào)整。
[0049] (5)密度梯度液的質(zhì)量評價
[0050] 1)用滲透壓測定儀測定溶液的滲透壓是否為310-360m0sm/kg;內(nèi)毒素測定確定內(nèi) 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0051 ] 2)蓋緊瓶蓋，并用塑料封蓋膜熱封;細菌培養(yǎng)結(jié)果為無菌。
[0052] (6)胰島組織分離的方法
[0053] 1)采用連續(xù)密度梯度離心方法，將消化和洗滌后的胰島組織20ml，混懸于4°C的 RPMI1640溶液中并定容至100ml。
[0054] 2)高密度液:采用上述配制的密度為1.132±0.001g/ml的密度梯度溶液約470ml， 用市售的器官保存液UW液在4°C左右稀釋，得到密度為1.10±0.001g/ml的高密度液約 500ml〇
[0055] 3)低密度液:采用市售Optiprep溶液約30ml，用UW液在4°C左右稀釋成密度為1.06 ±0.01g/ml的低密度液，總共約250ml。
[0056] 4)采用蠕動栗將120-130ml的高密度液先導(dǎo)入至⑶BE 2991細胞分離機中的細胞 純化袋中，開啟細胞分離機，2000rpm，除去細胞純化袋中的氣泡。
[0057] 5)采用密度梯度混合器，將上述高密度液和低密度液分別放置于兩個桶中，再打 開兩個桶中間的連接器，將低密度液通過連接器緩慢流至高密度液中并混合，再通過蠕動 栗導(dǎo)入至高速離心的細胞純化袋中。
[0058] 6)等全部的密度梯度液導(dǎo)入至細胞分離袋中后，再逐漸將含胰島組織的液體緩慢 導(dǎo)入至細胞分離袋中，使胰島組織與外分泌組織分布在不同的密度梯度液層中，達到分離 的目的。
[0059] 7)將分離的胰島逐步收集到含CMRL 1066的不同的收集管中。進行純化后的質(zhì)量 檢驗。
[0060] (5)胰島純化的結(jié)果
[0061] 1)胰島回收率:收集純化得到的>30%純度的人胰島組織，胰島回收率=純化后 的胰島當(dāng)量/純化前的胰島當(dāng)量*100%;配方一得到的胰島回收率達70.6%，而配方二不含 釓噴酸葡胺的密度梯度液胰島回收率為51.4%，說明加釓噴酸葡胺后的密度梯度液胰島回 收率明顯增加。
[0062] 2)胰島的活性:采用純化后的胰島組織進行ro-PI染色，在熒光顯微鏡下檢查胰島 的活性，發(fā)綠色熒光的為活細胞，發(fā)紅色熒光的為死細胞，以活細胞占整個細胞團的體積比 率來定義胰島細胞團的活性，結(jié)果配方一得到的胰島平均活性為88.7%，配方二得到的胰 島平均活性為86.8%，說明兩個配方的密度梯度液得到的胰島活性接近。
[0063] 實施例2
[0064] 本發(fā)明實施例2的一種組織和細胞純化過程中的高密度的密度梯度液配方如下：
[0065] (1)配方:碘克沙醇204 · 0g，泛影酸鈉 7 · 36g，釓噴酸葡胺10 · 0g，CMRL 1066定容至 lL〇
[0066] (2)制備工藝：
[0067] 1)取CMRL 1066各成分(CMRL 1066的成分可參考下表2)，先用80%的三蒸水進行 溶解，必要時先用HC1調(diào)酸進行溶解，再用NaOH進行調(diào)pH值中和，再用三蒸水定容至1L。
[0068] 表2CMRL 1066各成分表
[0069]
[0070]
[0071] 2)準確稱取碘克沙醇204. Og，泛影酸鈉7.36g，釓噴酸葡胺10.0 g，至1L滅菌后玻璃 瓶中，用800ml上述CMRL 1066溶液溶解，再用上述CMRL 1066溶液定容至1L。必要時用1N HC1或NaOH調(diào)pH至7.2±0.2,用手持式電子密度計測定密度為1.10±0.01g/ml，如果沒有， 則可少量加入碘克沙醇、泛影酸鈉或CMRL 1066進行密度調(diào)整。
[0072 ] 3)在B級背景下局部A級潔凈區(qū)先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔濾膜過濾，500mL/瓶。
[0073] (3)密度梯度液的質(zhì)量評價
[0074] 1)用滲透壓測定儀測定溶液的滲透壓是否為410-460m0sm/kg;內(nèi)毒素測定確定內(nèi) 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0075] 2)蓋緊瓶蓋，并用塑料封蓋膜熱封;細菌培養(yǎng)結(jié)果為無菌。
[0076] 實施例3
[0077] 本發(fā)明實施例3的一種組織和細胞純化過程中的低密度的密度梯度液配方如下：
[0078] (1)配方：碘克沙醇10 · 22g，泛影酸鈉3 · 59g，釓噴酸葡胺15g，CMRL 1066定容至 250ml〇
[0079] (2)制備工藝：
[0080] 1)準確稱取碘克沙醇l〇.22g，泛影酸鈉3.59g，釓噴酸葡胺15g至1L滅菌后玻璃瓶 中，用200ml上述CMRL 1066溶液溶解，再用上述CMRL 1066溶液定容至250ml。必要時用1N HC1或NaOH調(diào)pH至7.2 ± 0.2，用手持式電子密度計測定密度為1.06 ± 0.01 g/ml，如果沒有， 則可少量加入碘克沙醇、泛影酸鈉或CMRL 1066進行密度調(diào)整。
[0081 ] 3)在B級背景下局部A級潔凈區(qū)先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔濾膜過濾，500mL/瓶。
[0082] (3)密度梯度液的質(zhì)量評價
[0083] 1)用滲透壓測定儀測定溶液的滲透壓是否為450-530m0sm/kg;內(nèi)毒素測定確定內(nèi) 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0084] 2)蓋緊瓶蓋，并用塑料封蓋膜熱封;細菌培養(yǎng)結(jié)果為無菌。
[0085] (4)胰島組織分離的方法
[0086] 1)采用連續(xù)密度梯度離心方法，將消化和洗滌后的胰島組織20ml，混懸于4°C的 RPMI1640溶液中并定容至100ml。
[0087] 2)高密度液：用蠕動栗將采用上述實施例2配制的密度為1.10±0.01g/ml的密度 梯度溶液約125ml先導(dǎo)入至C0BE 2991細胞分離機中的細胞純化袋中，開啟細胞分離機， 2000rpm，除去細胞純化袋中的氣泡。
[0088] 5)采用密度梯度混合器，將上述實施例2高密度液和實施例3低密度液分別放置于 密度梯度混合器的兩個桶中，再打開兩個桶中間的連接器，將低密度液通過連接器緩慢流 至高密度液中并混合，再通過蠕動栗導(dǎo)入至高速離心的細胞純化袋中。
[0089] 6)等全部的密度梯度液導(dǎo)入至細胞分離袋中后，再逐漸將含胰島組織的液體緩慢 導(dǎo)入至細胞分離袋中，使胰島組織與外分泌組織分布在不同的密度梯度液層中，達到分離 的目的。
[0090] 7)將分離的胰島逐步收集到含CMRL 1066的不同的收集管中，進行純化后的質(zhì)量 檢驗。
[0091] (5)結(jié)果
[0092] 1)密度梯度結(jié)果:將上述實施例2高密度液和實施例3低密度液進行密度梯度混合 的過程中，用15ml離心管每1分鐘收集一管密度梯度混合液，測定其密度，得到的密度梯度 變化曲線如圖1所示，由圖1可知，高密度液和低密度液混合過程中，密度是從高到低逐漸下 降，混合液的起始密度接近于高密度液，終末密度接近于低密度液，這樣有利于組織在各個 密度層的找到各自適合的密度層，進而有利于組織的分離。
[0093] 2)胰島組織回收率和活性:可收集得到不同純度的人胰島組織，胰島的回收率可 達72.5%;活性達89.3%。
【主權(quán)項】
1. 一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配方中的密度梯度成分 為碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅、聚蔗糖400中的一種或幾種成分組合組 成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉中的一種或幾種成分組合作為提高滲透壓和 防止組織和細胞水腫的物質(zhì)，其溶劑成分為DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199培養(yǎng)液中的 一種或其改進后的溶液中的一種。2. -種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配方中的密度梯度成分 為碘克沙醇、碘海醇、泛影酸鈉、甲泛葡胺、膠體硅中的一種或幾種成分組合組成，以棉子 糖、海藻糖、乳糖酸鉀、羥乙基淀粉中的一種或幾種成分組合作為提高滲透壓和防止組織和 細胞水腫的物質(zhì)，其溶劑成分為HBSS、Hanks液中的一種或其改進后的溶液中的一種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在 于:配方中還含有IL噴酸葡胺0.1 %-65%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配 方中密度梯度各成分使用的濃度為碘克沙醇5 % -70 %，碘海醇3 % -75 %，泛影酸鈉3 % -75 %，甲泛葡胺3%-75%，膠體硅3 %-75 %，聚蔗糖4003%-75% ;其配方中的提高滲透壓和 防止組織和細胞水腫的成分通常在密度梯度液中使用的濃度為棉子糖0.5 % -50 %、海藻糖 0· 5%-55%、乳糖酸鉀0· 5%-35%、羥乙基淀粉0· 1 %-30%。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配 方中密度梯度各成分使用的濃度為碘克沙醇5 % -70 %，碘海醇3 % -75 %，泛影酸鈉3 % -75%，甲泛葡胺3%-75%，膠體硅3%-75% ;其配方中的提高滲透壓和防止組織和細胞水腫 的成分通常在密度梯度液中使用的濃度為棉子糖0.5%-50 %、海藻糖0.5%-55%、乳糖酸 鉀0· 5%-35%、羥乙基淀粉0· 1 %-30%。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的溶劑成分可以為DMEM、RPMI 1640、 CMRL 1066、M199培養(yǎng)液中的一種或其改進后的溶液中的一種，如溶劑分別為0.5-5倍濃度 的DMEM溶液，0.5-5倍濃度的RPMI1640溶液，0.5-5倍濃度的CMRL 1066溶液，0.5-5倍濃度的 Ml 99溶液。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方中的溶劑成分可以為HBSS、Hanks液中的 一種或其改進后的溶液中的一種，如溶劑分別為〇. 5-5倍濃度的HBSS，0.5-5倍濃度的Hanks 液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液其制備方法為將密度梯度成分、提高滲透壓和防 止組織和細胞水腫的成分、釓噴酸葡胺溶解于相應(yīng)的溶劑中，過濾除菌即得。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一種組織和細胞純化用密度梯度溶液其制備方法為將密度梯度成分、提高滲透壓和防 止組織和細胞水腫的成分、釓噴酸葡胺溶解于相應(yīng)的溶劑中，過濾除菌即得。
【文檔編號】C12N5/071GK105886454SQ201610205894
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】傅紅興, 劉成洋, 蔣煊, 趙應(yīng)征
【申請人】溫州市怡康細胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司