與大麥抗白粉病相關(guān)的HvMIR1及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了與大麥抗白粉病相關(guān)的HvMIR1及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域與作物分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的HvMIR1來源于大麥，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在大麥表皮細(xì)胞中瞬時過表達(dá)HvMIR1能夠使大麥細(xì)胞對白粉菌的小種?；剐詼p低。本發(fā)明的與大麥抗白粉病相關(guān)的HvMIR1可用于大麥種質(zhì)資源的改良及遺傳育種領(lǐng)域，還可用于培育抗白粉病的大麥品種，具有良好的市場應(yīng)用前景。
【專利說明】
與大麥抗白粉病相關(guān)的HvMIRI及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及作物分子生物學(xué)和分子育種領(lǐng)域，更具體地，涉及與大麥抗白粉病相 關(guān)的HvMIRI及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麥?zhǔn)窃谌驈V泛種植的主要糧食作物之一，其世界播種面積僅次于小麥、水稻 和玉米，位列第四。大麥可做食品、飼料和啤酒釀制原料，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。大麥白粉病 (barley powdery mildew)是大麥主要的真菌病害之一，由布氏白粉菌大麥?；?(Blumeria graminis f.sp.hordei)引起。該病原真菌屬子囊菌綱白粉菌目，主要在宿主大 麥葉片表皮細(xì)胞內(nèi)專性活體寄生，可侵害大麥植株的地上部各器官，但以葉片和葉鞘為主， 發(fā)病重時大麥莖桿和穗部也受侵害(Jorgensen, 1994，Crit · Rev·Plant Sci ·)。大麥白粉病 多發(fā)生在潮濕和半潮濕地區(qū)，分布于世界各大麥產(chǎn)區(qū)。在歐洲各國、北美東部和南部地區(qū)、 日本等地，以及中國的貴州、四川和東南沿海等大麥種植區(qū)域均有普遍發(fā)生，一般可造成 20%-25%的產(chǎn)量損失，而在病害流行的年份里嚴(yán)重?fù)p失可達(dá)30%。近年來，由于大麥品種 單一化、高度密植和過量施用氮肥等栽培因素，使得大麥白粉病發(fā)病日趨嚴(yán)重。
[0003] 目前大麥白粉病的防治工作主要通過施用化學(xué)農(nóng)藥完成。大量使用化學(xué)殺菌劑會 對環(huán)境造成污染，并對人畜飲食安全和健康形成潛在的威脅。篩選、培育和種植抗病品種， 是防治大麥白粉病的另一重要途徑，而發(fā)現(xiàn)和鑒定大麥抗白粉病基因則是抗病育種工作中 的重要一環(huán)。大麥對白粉病的抗性包括:一，依賴小種?；剐钥共』颍ㄈ鏜LA基因）產(chǎn)生 的特異性抗性（Shen et al，2007，Science);二，依賴非小種?；剐钥共』颍ㄈ鏼lo基 因）產(chǎn)生的廣譜抗性(Acevedo-Garcia et al，2014，New Phytol·);三，依賴非小種?；?性抗病基因產(chǎn)生的部分抗性。通過傳統(tǒng)育種方式和分子標(biāo)記輔助篩選相結(jié)合，可以加速將 大麥白粉病抗病基因向栽培品種中導(dǎo)入。
[0004] 大麥白粉病菌具有許多生理小種;主栽的大麥抗病品種的白粉病抗性往往與當(dāng)?shù)?的白粉菌優(yōu)勢生理小種不同，因此不能產(chǎn)生有效的小種?；剐?。而且大麥白粉病菌變異 速度快，使得許多一時有效的小種?；剐钥共』蛟诙虝r間內(nèi)喪失抗性，成為選育和推 廣大麥抗病品種過程中育種工作者一直未能解決的難題?？乖炊鄻踊菍?shí)現(xiàn)抗病性持久的 有效途徑。為此通過生物學(xué)的方法克隆新的抗病基因，利用轉(zhuǎn)基因的方法提高大麥對白粉 病的抗性是今后防治白粉病的有效策略之一。
[0005] 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解在 調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)水平和功能上發(fā)揮著重要的作用。該系統(tǒng)通過一個多步驟的反應(yīng)過程， 利用多種不同功能的蛋白，將活化的泛素分子結(jié)合到待降解的蛋白上，形成具有多聚泛素 鏈的靶標(biāo)蛋白。而蛋白酶體系統(tǒng)則可以識別泛素化的蛋白并將其降解。泛素-蛋白酶體系統(tǒng) 包括泛素、泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體。蛋白泛素化通過三 步反應(yīng)完成。第一步，泛素在ATP的作用下被泛素活化酶E1激活，泛素 C末端的甘氨酸結(jié)合到 E1的半管氨酸巰基上;第二步，泛素被轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2的半胱氨酸巰基上；第三部，泛 素在泛素連接酶E3的作用下通過共價結(jié)合的方式連接到底物蛋白的賴氨酸殘基上，形成單 泛素化或者多泛素化的底物。E3泛素連接酶決定著底物的特異性，在這個過程中發(fā)揮著重 要的作用。而目前還沒有在大麥中通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控大麥抵御白粉菌侵染的報(bào) 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種與大麥抗白粉病相關(guān)的E3泛素連接酶及其編碼基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供該E3泛素連接酶在大麥對白粉菌抗性中的用途。
[0008] 本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)一種E3泛素連接酶在白粉菌侵染大麥過程中的表達(dá)量發(fā)生明顯 變化，該E3泛素連接酶命名為HvMIRl，其氨基酸序列是如下(a)或(b):
[0009] (a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] (b)SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與抗病相關(guān)或具有轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白質(zhì)。
[0011] 編碼HvMIRl蛋白的基因?qū)儆诒景l(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 進(jìn)一步，編碼HvMIRl蛋白的基因的核苷酸序列為如下1)-3)中任意一種的核苷酸 序列：
[0013] (l)SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列；
[0014] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；
[0015] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
[0016] 下述1)-4)中任一種生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0017] 1)含有上述基因的表達(dá)盒；
[0018] 2)含有上述基因的重組載體；
[0019] 3)含有上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；
[0020] 4)含有上述基因的重組微生物。
[0021]本發(fā)明提供了克隆HvMIRl基因的引物對，其上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0022]本發(fā)明在接種白粉菌的大麥葉片樣品中利用Real-time qPCR的方法檢測了 HvMIRl的表達(dá)豐度，發(fā)現(xiàn)HvMIRl的表達(dá)量在大麥-白粉菌親和和非親和相互作用中均顯著 變化。
[0023] 本發(fā)明提供了特異地檢測HvMIRl表達(dá)量的引物對，其序列如SEQ ID N0.7和SEQ ID NO .8所示。
[0024]本發(fā)明通過基因槍介導(dǎo)的方法在大麥表皮細(xì)胞中表達(dá)HvMIRl-mYFP，發(fā)現(xiàn)其在細(xì) 胞質(zhì)有定位。
[0025]本發(fā)明利用基因槍的方法在大麥表皮細(xì)胞中瞬時過表達(dá)HvMIRl，發(fā)現(xiàn)在非親和互 作中大麥對白粉菌的抗性降低，表現(xiàn)為白粉菌的吸器指數(shù)顯著升高，說明HvMIR1負(fù)調(diào)大麥 對白粉菌的小種?；剐浴?br>[0026]本發(fā)明提供了上述HvMIRl蛋白或編碼該蛋白的基因或上述生物材料在調(diào)控植物 抗真菌病中的應(yīng)用。
[0027]優(yōu)選地，所述植物為大麥。
[0028]本發(fā)明提供了上述HvMIRl蛋白或編碼該蛋白的基因或上述生物材料在植物種質(zhì) 資源改良中的應(yīng)用。
[0029]優(yōu)選地，所述植物為大麥。
[0030]本發(fā)明提供了上述HvMIRl蛋白和編碼該蛋白的基因在制備抗病轉(zhuǎn)基因植物中的 應(yīng)用。
[0031]具體地，是將HvMIRl基因功能失活以提高植物的抗病能力。
[0032]所述抗病為抗大麥白粉病，所述植物為大麥。
[0033]進(jìn)一步地，所述大麥白粉病的病原菌為大麥白粉菌生理小種K1、A6。
[0034]本發(fā)明通過對HvMIRl的表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)HvMIRl在白粉菌侵染大麥過程中表達(dá)量 顯著上升，說明HvMIRl參與大麥防御白粉菌侵染的過程并發(fā)揮其生物學(xué)功能;本發(fā)明通過 大麥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)HvMIRl發(fā)現(xiàn)HvMIRl在細(xì)胞質(zhì)定位。通過大麥表皮細(xì)胞瞬時過表達(dá) HvMIRl并接種非親和白粉菌，發(fā)現(xiàn)大麥對白粉菌的抗性顯著減弱，說明HvMIRl負(fù)向調(diào)控大 麥對白粉菌的抗性。本發(fā)明提供的HvMIRl可廣泛應(yīng)用于大麥遺傳育種、種質(zhì)資源改良和培 育抗白粉病的轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，對改進(jìn)和改良大麥等作物的種質(zhì)資源具有重要作用。
【附圖說明】
[0035]圖1為大麥表皮細(xì)胞中過表達(dá)HvMIRl對大麥白粉病菌抗性的影響。，大麥HvMIRl基 因負(fù)向調(diào)控MLA抗病蛋白介導(dǎo)的大麥白粉菌小種專化抗性。在抗病蛋白MLA1的遺傳背景下， 圖1的A圖顯示過表達(dá)HvMIRl增強(qiáng)了大麥白粉菌無毒生理小種K1的侵染能力。而在抗病蛋白 MLA10的遺傳背景下，圖1的B圖顯示過表達(dá)HvMIRl增強(qiáng)了大麥白粉菌無毒生理小種A6的侵 染能力。
[0036]圖2為白粉菌侵染對大麥HvMIRl表達(dá)水平的影響圖。HvMIRl基因的表達(dá)被白粉菌 菌株K1和A6所誘導(dǎo)。以含有Mlal的近等基因系P01作為檢測材料，分別接種親和菌株A6和非 親和菌株K1，檢測HvMIRl在白粉菌侵染后的表達(dá)譜變化，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HvMIRl不管是在親 和背景還是非親和背景下，其表達(dá)均能夠被白粉菌誘導(dǎo)。其表達(dá)趨勢為前期下降，后期上 升。
[0037] 圖3為HvMIRl定位于細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果圖。HvMIRl定位于細(xì)胞質(zhì)中。將HvMIRl與mYFP蛋 白融合后通過基因槍瞬時表達(dá)，將HvMIRl在大麥葉表皮細(xì)胞中表達(dá)，通過熒光顯微鏡觀察 HvMIRl的蛋白定位情況，檢測發(fā)現(xiàn)HvMIRl主要定位于細(xì)胞之中，其中GFP作為陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。 [0039]若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例中使用的大麥品種為P01和P09,記載 在Shen et al，2007, Science中，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所（以下簡稱 為"中科院遺傳所"）獲得；大麥白粉菌（Blumeria graminis f · sp.hordei)生理小種K1和A6 記載在Shen et al，2003，Plant Cell中，公眾可從中科院遺傳所獲得;CTAP載體記載在Bai et al，2012，PLoS Pathog.中，公眾可從中科院遺傳所獲得;pUbi載體記載在Shen et al, 2003，Plant Ce 11中，公眾可從中科院遺傳所獲得。
[0040] 實(shí)施例lHvMIRl基因的獲得
[0041] 1、植物材料的準(zhǔn)備。大麥品種P01種子播種后，待長至1周左右，剪下旗葉，保存于 液氮中。
[0042] 2、植物總RNA的提取。在液氮中迅速研磨300mg大麥葉片至粉末狀，加入lml TRizol，充分震蕩混勻后于4°C12,000rpm離心10min;上清轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入1/ 5TRizol體積的氯仿，混勾后室溫靜置3min等待其分層，之后于4°C12,000g離心15min。上清 轉(zhuǎn)移到新離心管中，先加入上清體積10%的3M醋酸鈉 (pH 5.2)，混勻后再加入上清體積1倍 的異丙醇，混勻后于_20°C中靜置10，000g離心15min，棄上清，用75 %乙醇洗滌沉 淀兩次，每次室溫靜置l〇min，之后4°C7500rpm離心5min，沉淀在室溫下瞭置10min。用60μ1 DEPC水溶解沉淀，獲得的植物總RNA。
[0043] 3、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
[0044] (1)反轉(zhuǎn)錄體系及過程：
[0045] RNA 2·5μ1
[0046] 01ig〇-dT ΙμL
[0047] DEPC-H2O 6.5μ1
[0048] 離心管混合上述溶液，70 °C 5min，冰上再放置5min。
[0050] 離心管繼續(xù)加入上述溶液，48°C溫浴lh，70°C15min，4°C10min。
[0051 ] 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入25μ1 ddH20,取ΙμL進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)，得到cDNA。
[0052] (2)克隆 HvMIRl
[0053] PCR擴(kuò)增所需引物如下：
[0056] PCR 體系
[0060] 得到113 lbp的PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物送去測序，結(jié)果為該P(yáng)CR產(chǎn)物具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸，該序列所示的基因命名為HvMIRl，編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第 1-1131位核苷酸;該基因編碼的蛋白命名為HvMIRl，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所 不。
[0061] 實(shí)施例2HvMIRl基因在抗白粉病中的作用
[0062] 1、載體構(gòu)建
[0063] 1)以實(shí)施例1得到的PCR產(chǎn)物(或者人工合成序列1)為模板，用下述引物F和R進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到約113 lbp的PCR產(chǎn)物。
[0068] 上述PCR體系如下：
[0072] 2)用上述PCR產(chǎn)物與pDN0R201載體(購自Invitrogen公司）進(jìn)行BP反應(yīng)，得到ENTRY 載體。
[0073] 上述 BP 反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物 75ng，pDN0R201 75ng，BP 酶 0.5以1。25。(：過夜。
[0074] 3)將上述ENTRY載體與pUbi-Adaptor-NOS載體進(jìn)行LR反應(yīng)，生成pUbi-HvMIRl載 體。
[0075] LR反應(yīng)體系：ENTRY載體 75ng，pUbi-gate 載體 75ng，LR酶 0 · 5μ1。25 Γ 過夜。
[0076] pUbi-HvMIRl載體通過測序鑒定，該載體為將序列表中的序列1插入pUbi-Adap tor-NOS載體中得到的載體。
[0077] 2、基因槍瞬時超表達(dá)試驗(yàn)
[0078] 1)金粉的制備
[0079] (1)稱取9mg (w)金粉放在離心管中，65 °C放置4h以上。
[0080] (2)加入70%乙醇，漩渦振蕩8min，靜止15min。
[0081] (3)2000r/min 離心 2s，去掉上清液。
[0082] (4)加 lml消毒蒸餾水，旋禍振蕩2min，靜止1分鐘，2000rpm/min離心2s，棄掉上清 液。
[0083] (5)重復(fù)（4)三次。
[0084] (6)在沉淀的金粉中加入50 %甘油，漩渦振蕩。
[0085] 2)DNA子彈的制作
[0086] (1)振蕩50 %甘油中的金粉5分鐘，使之成為懸浮液。
[0087] (2)取50μ1的懸浮液于離心管中。
[0088] (3)加入5μ1的質(zhì)粒DNA(2yg)，邊振蕩便加入50μ1 CaCl2水溶液(2 · 5Μ)，振蕩中再 在小管加入20μ1亞精胺(0.1M)，振蕩3分鐘，之后靜置lmin，2000rpm/min離心2s，去掉上清 液。
[0089] (4)加入140μ1 70 %的乙醇，漩渦振蕩，使沉淀均勻散開，則離心（2000rpm/min 2s)，棄掉上清液。
[0090] (5)加入140μ1 100 %的乙醇，漩渦振蕩，使沉淀均勻散開，則離心（2000rpm/min 2s)，棄掉上清液。
[0091] (6)加入12μ1 100%的乙醇，漩渦振蕩，使沉淀均勻散開。
[0092] 3)基因槍轟擊轉(zhuǎn)化方法
[0093] 基因槍介導(dǎo)的方法:分別將大麥Ρ01、Ρ09種子土播種植后，待長至一周左右，剪下 旗葉，葉面朝上，放置于含有培養(yǎng)基（1 %的瓊脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培養(yǎng)皿上，恢復(fù)4h，得 到大麥P〇 1靶材料、P09靶材料，備用基因槍轟擊；
[0094] 將目的質(zhì)粒pUbi-HvMIRl和質(zhì)粒pUbi-GUS按1:1摩爾比充分混合，包裹在直徑為1μ m金粉微粒上，采用PDS-1000/He (美國Bio-Rad)分別轟擊大麥Ρ01靶材料、Ρ09靶材料，得到 轟擊后大麥P01葉片、轟擊后大麥P09葉片;基因槍轟擊參數(shù)為:阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距 離為5 · 5cm，可裂膜壓力為900Pa 〇
[0095]基因槍轟擊完畢后，將轟擊后大麥P01葉片、轟擊后大麥P09葉片放入培養(yǎng)箱中恢 復(fù)培養(yǎng)4h(培養(yǎng)條件22°C、16h光照/18°C8h黑暗），得到轉(zhuǎn)入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麥 P01葉片（HvMIRl)和轉(zhuǎn)入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麥P09葉片（HvMIRl)，4h后分別進(jìn)行 接大麥白粉菌K1和A6。
[0096]上述接種方法如下:接種方法為:將孢子抖落在大麥葉片上，保證2個孢子/mm2。
[0097] 將上述接種K1的各種大麥葉片和接種A6的各種大麥葉片均培養(yǎng)48h(培養(yǎng)條件22 °C、16h光照/18°C8h黑暗），進(jìn)行⑶S染色，37°C過夜，染色完畢后進(jìn)行脫色，兩天后利用顯微 鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察。
[0098] 統(tǒng)計(jì)表達(dá)GUS的細(xì)胞中感病細(xì)胞的比例來計(jì)算吸器指數(shù)，根據(jù)吸器指數(shù)來判斷基 因 HvMIRl的功能。吸器指數(shù)越低，說明抗性越高。
[0099]抗病細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GUS，且細(xì)胞內(nèi)不含有吸器，而細(xì)胞表面附著有 分生孢子的細(xì)胞為抗病細(xì)胞
[0100] 感病細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GUS，且細(xì)胞內(nèi)含有吸器的細(xì)胞為感病細(xì)胞。
[0101] 吸器指數(shù)的計(jì)算公式:吸器指數(shù)=感病細(xì)胞的個數(shù)/(抗病細(xì)胞的個數(shù)+感病細(xì)胞 的個數(shù)）X100 %。由此可見植物細(xì)胞越抗病，吸器指數(shù)越低;越感病，吸器指數(shù)越高。
[0102] 以轉(zhuǎn)入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麥葉片作為空對照(EV)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重 復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0103] 結(jié)果如圖1所示，
[0104] 轉(zhuǎn)入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麥P01葉片的吸器指數(shù)為19.18% ;
[0105] 轉(zhuǎn)入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麥P01葉片的吸器指數(shù)為41.60% ;
[0106] 轉(zhuǎn)入pUbi-Adaptor-NOS和pUbi-GUS的大麥P09葉片的吸器指數(shù)為15.86%;
[0107] 轉(zhuǎn)入pUbi-HvMIRl和pUbi-GUS的大麥P09葉片的吸器指數(shù)為46.56% ;
[0108] 結(jié)果顯示，在大麥葉片中過表達(dá)HvMIRl后，吸器指數(shù)明顯上升，說明過表達(dá)HvMIRl 會減弱大麥白粉病菌的抗性，也就是HvMIRl在大麥的白粉病抗性中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
[0109]實(shí)施例3HVMIR1的亞細(xì)胞定位和受白粉菌誘導(dǎo)的表達(dá)模式分析 [0110] 一、HvMIRl的亞細(xì)胞定位
[0111] 1、載體構(gòu)建
[0112] 1)以實(shí)施例1得到的PCR產(chǎn)物(或者人工合成SEQ ID勵.2)為模板，用下述引物卩和 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.2Kb的PCR產(chǎn)物。
[0117] 2)用上述PCR產(chǎn)物與pDN0R201載體（購自Invitrogen公司）進(jìn)行BP反應(yīng)，得到 ENTRY-1 載體。上述 BP反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物 75ng，pDN0R201 75ng，BP酶 0.5μ1。25 °C 過夜。
[0118] 3)將上述 ENTRY-1 載體與 pUbi-GW-mYFP 載體 LR 反應(yīng)，生成 pUbi-HvMIRl-mYFP 載體。
[0119] LR 反應(yīng)體系：中間載體 7 5ng，pUbi-GW-mYFP 載體 7 5ng，LR 酶0 · 5μ1。25 °C過夜。
[0120] pUbi-HvMIRl-mYFP載體通過測序鑒定，該載體為將序列表中的序列1插入pUbi-GW-mYFP載體中得到的載體。
[0121] 2、基因槍介導(dǎo)的單細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定HvMIRl的亞細(xì)胞定位情況
[0122] 大麥P01種子土播種植后，待長至一周左右，剪下旗葉，葉面朝上，放置于含有培養(yǎng) 基（1 %的瓊脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培養(yǎng)皿上，恢復(fù)4小時后進(jìn)行基因槍轟擊;將目的質(zhì)粒 pUbi-HvMIRl-mYFP包裹在直徑為Ιμπι金粉微粒上，采用PDS-1000/He (美國Bio-Rad)轟擊靶 材料，基因槍轟擊參數(shù)為:阻擋網(wǎng)與轟擊材料之間的距離為5.5cm，可裂膜壓力為900Pa。
[0123] 基因槍轟擊后葉片放置于植物培養(yǎng)室正常生長36h后在共聚焦顯微鏡不同熒光通 道觀察HvMIRl的亞細(xì)胞定位情況。
[0124] 結(jié)果如圖3所示，HvMIRl主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，其中GFP作為對照。
[0125] 二、HvMIRl受白粉菌誘導(dǎo)的表達(dá)模式分析
[0126] 大麥P01種子播種后，待長至一周左右，剪下旗葉，葉面朝上，放置于含有培養(yǎng)基 (1 %的瓊脂，l〇〇mg/L苯丙咪唑）的培養(yǎng)皿上，恢復(fù)24小時，分別接種大麥白粉病菌生理小種 K1或A6;分別在接種后不同時間點(diǎn)取材，提RNA，反轉(zhuǎn)錄(體系與方法同上），反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋 10倍，取2μ1進(jìn)行Real time PdReal time PCR體系及程序參照promega公司試劑盒 GoTaq-qPCR Master Mix(目錄號A6001)操作說明。以未接種的大麥P01為對照。
[0127] Real time PCR的引物如下：
[0130] Real time PCR體系如下：
[0132] Real time PCR程序如下：95°(：1〇111丨11，95°(：1586(3,60°(：1111丨11，40個循環(huán)。設(shè)置溶解 曲線:95 °C lOsec，65 °C lmin，0.3 °C階梯升溫，讀熒光值，升溫至95 °C結(jié)束。
[0133] 結(jié)果如圖2所示，大麥白粉病菌生理小種K1和A6接菌處理均能夠影響HvMIRl的表 達(dá)，接菌4-12h后表達(dá)量降低，達(dá)到未接菌時的一半，24h后開始上升，到48h最高，達(dá)到未接 菌時的2倍，達(dá)到4-12h時的4倍。
[0134] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白HvMIRl，是如下(a)或(b): (a) 由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與抗病相關(guān)或具有轉(zhuǎn)錄激活活性的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列為如下1)_3)中任意一種的 核苷酸序列： (1) SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； (3) 與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。3. 下述1)-4)中任一種生物材料： 1) 含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)盒； 2) 含有權(quán)利要求2所述基因的重組載體； 3) 含有權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系； 4) 含有權(quán)利要求2所述基因的重組微生物。4. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2所述的基因或權(quán)利要求3所述的生物材料在調(diào)控 植物抗真菌病中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2所述的基因或權(quán)利要求3所述的生物材料在植物 種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2所述的基因在制備抗病轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的基因功能失活以提高植 物的抗病能力。8. 如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗病為抗大麥白粉病，所述植物為大 麥。9. 克隆權(quán)利要求2所述基因的引物對，其特征在于，含有SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸 序列。10. 特異性檢測權(quán)利要求2所述基因的引物對，其特征在于，含有SEQ ID NO.7-8所示的 核苷酸序列。
【文檔編號】C12N9/00GK105886479SQ201610286959
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】王濤, 沈前華, 常誠, 谷成
【申請人】中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所