一種羧基麥芽糖鐵注射液及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羧基麥芽糖鐵注射液及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的羧基麥芽糖鐵注射液中含有羧基麥芽糖鐵和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，羧基麥芽糖鐵、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時，可以提高CD4+細(xì)胞數(shù)及改善免疫功能調(diào)整免疫平衡，對艾滋病具有治療作用；羧基麥芽糖鐵和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療艾滋病的注射液，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種羧基麥芽糖鐵注射液及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種羧基麥芽糖鐵注射液及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 羧基麥芽糖鐵是一種新型的鐵絡(luò)合物，用麥芽糊精將鐵離子穩(wěn)定地絡(luò)合在其中， 控制鐵的釋出，鐵離子能與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和鐵蛋白結(jié)合以發(fā)揮作用，并防止釋放大量的游離 鐵，減少有毒氧化物形成。羧基麥芽糖鐵能有效提高輕到中度缺鐵性貧血患者Hb和血清鐵 蛋白濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種羧基麥芽糖鐵注射液及其醫(yī)藥用途。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0006]
123 -種羧基麥芽糖鐵注射液，包括羧基麥芽糖鐵、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和 藥學(xué)上可以接受的載體。 2 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將燈心草粉碎，用75~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用25 %乙醇洗脫8個柱體積，再用70 %乙醇洗脫12個柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得 到化合物(I)。 3 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用80%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0010] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0011] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0012] 上述化合物(I)在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 上述羧基麥芽糖鐵注射液在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明提供的羧基麥芽糖鐵注射液中含有羧基麥芽糖鐵和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然 產(chǎn)物，羧基麥芽糖鐵和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時，對艾滋病具有治療作用；二者聯(lián)合作用時， 對艾滋病的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療艾滋病的藥物。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0017] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0018]分離方法：（a)將燈心草(2kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（15LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1 (10個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、25:1 (10 個柱體積)和15:1 (8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個組分；（d)步驟(c)中組分 4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1 (10個柱體積）、15:1 (8個柱體積)和1:1 (6個 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0019] 結(jié)構(gòu)確證:冊431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 469.3282，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C30H44〇4，不飽和度為9。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，CDC13，600MHz): H-1 (1 · 62，dd，J = 12 · 4， 8.9Hz)，H-l(2.11，dd，J=12.4,3.6Hz)，H-2(5.82，ddd，J=10.9,8.9,3.6Hz)，H-3(5.68，d， J=10.9Hz)，Η-5(0·99，m)，H-6( 1.52，m)，H-6( 1.63，m)，H-7( 1.78，m)，H-7( 1.91，m)，H-9 (2.55，s)，H-16(2.47，d，J=13.1Hz)，H-16(2.81，d，J=13.1Hz)，H-18(2.86，d，J = 11.5Hz)，H-19(1.73，m)，H-21(1.34，m)，H-21(1.57，m)，H-22(1.66，m)，H-22(1.74，m)，H-23 (1.09，s)，H-24(1.06，s)，H-25(1.28，s)，H-26(1.26，s)，H-27(1.36，s)，H-28(0.89，s)，H-29(0.85，(1，了 = 6.3他），!1-30(1.23,8)，12-0!1(6.38,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。（卯111，〇)(：1 3， 125MHz):39.6(CH2，l-C)，124.3(CH，2-C)，139.2(CH，3-C)，35.4(C，4-C)，57.2(CH，5-C)， 19.7(CH2,6-C)，36.4(CH2,7-C)，46.5(C，8-C)，58.7(CH，9-C)，46.4(C，10-C)，196.2(C，11-C)，144.8(C，12-C)，143.2(C，13-C)，58.6(C，14-C)，209.4(C，15-C)，54.3(CH2，16-C)，53.4 (C，17-C)，42.3(CH，18-C)，41.7(CH，19-C)，70.5(C，20-C)，35.8(CH2,21-C)，35.8(CH2,22- C)，26.6(CH3,23-C)，21.7(CH3,24-C)，15.7(CH3,25-C)，19.7(CH3,26-C)，14.8(CH 3,27-C)， 19 · 3(CH3，28-C)，11 · 2(CH3，29-C)，29 · 4(CH3，30-C)。紅外波譜表明該化合物含有α，β-不飽 和羰基（1705cm-4，羥基（3425cm-4，羰基（1760cm-3，雙鍵（1663cm-4和偕二甲基（1380cm 一 4基團(tuán)。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有30個碳信號，包括八個甲基，六個亞甲基，六個次 甲基(兩個烯烴碳），以及十個季碳(一個連氧碳，兩個羰基，一對四取代烯烴碳），以上功能 結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示的七個單峰 甲基質(zhì)子信號 δΗ 1.09(3H，s)，1.06(3H，s)，1.28(3H，s)，1.26(3H，s)，1.36(3H，s)，0.89 (3H，s)和1.23(3H，s)，一個雙峰甲基質(zhì)子信號δ Η 〇.85(3!1，(1，1 = 6.3抱）以及1!1-匪1?數(shù)據(jù)表 明該化合物為烏蘇烷型三萜類化合物。在該烏蘇烷型化合物中，C-l 1和C-15位形成酮基，C-2與C-3、C-12與C-13形成雙鍵結(jié)構(gòu)。HMBC譜中Η2-16和Η3-27與C-15的相關(guān)性以及它們的碳化 學(xué)位移也進(jìn)一步確證C-15形成酮基。另HMBC譜中Η-9和Η-18與C-12，H-18和Η 3-27與C-13， 12-OH與C-12相關(guān)信號以及它們的碳化學(xué)位移表明該化合物存在烯醇式結(jié)構(gòu)，羥基連接在 C-12位與C-12和C-13形成的雙鍵構(gòu)成烯醇式結(jié)構(gòu)。HMBC譜中12-OH和H-9與C-11的相關(guān)信號 以及碳化學(xué)位移確認(rèn)C-11位為羰基。此外，HMBC譜中H-18、H-19、H 3-29和H3-30與C-20的相關(guān) 信號以及C-20碳化學(xué)位移可以確定C-20位連有一個羥基。NOESY譜中H 3-28和H3-29與H-18存 在相關(guān)信號，但H3-30與H-18沒有相關(guān)信號，表明C-20位的羥基為β構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、 HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體 構(gòu)型進(jìn)一步通過E⑶試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0020] 該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0021]
[0022] 實施例2:藥理作用
[0023] 1、材料與方法
[0024] 1.1動物
[0025] 恒河猴5~7kg，雄性健康，感染前經(jīng)PCR檢測無 SIV陽性，血常規(guī)正常，由中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院實驗動物研究所提供。
[0026] 1.2試劑與樣品
[0027] 羧基麥芽糖鐵購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例 1。單克隆抗體，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物制劑發(fā)展中心。AZT(疊氮胸苷)購自Burroughs。
[0028] 1.3儀器
[0029] FACS420型流式細(xì)胞儀測定(美國B. D公司）。TMRMC型酶標(biāo)儀。
[0030] 1.4猴分組及模型制備
[0031] SIVmac感染成功動物隨機(jī)分組，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組(AZT 組50mg · kg'、羧基麥芽糖鐵組(80mg · kg'、化合物（I)組(80mg · kg'、羧基麥芽糖鐵與 化合物（I)組合物組【40mg · kg<羧基麥芽糖鐵+40mg · kg<化合物（I)】。感染后2周給藥，藥 物組每日按照上述劑量給藥;正常對照組，每日給生理鹽水等量。每組每日給藥一次，靜脈 注射。給藥時間為18周，然后解剖進(jìn)行病理觀察。
[0032] 1.5T淋巴細(xì)胞亞群測定實驗
[0033]以單克隆抗體直接標(biāo)記動物外周血CD4+，CD8 +細(xì)胞，按產(chǎn)品說明書操作，采用 FACS420型流式細(xì)胞儀測定。微機(jī)處理分析陽性率，并計算⑶4+/⑶8細(xì)胞比值。
[0034] 1.6MTT法觀察T、B淋巴細(xì)胞增殖實驗
[0035]①無菌取猴靜脈血2ml，肝素抗凝，分離單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)IX 105/ml。②將 調(diào)整細(xì)胞懸液種植在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，200μ1/孔，并分別加入不同有絲分裂原誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞 分化，ConA5μg/ml，LPS30μg/ml濃度，培養(yǎng)48h后加入MTT(5mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入酸化異 丙醇(0.04mol/L)，利用TMRMC型酶標(biāo)儀檢測，波長570~630nm。
[0036] 1.7統(tǒng)計學(xué)方法
[0037]實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0038] 2、實驗結(jié)果
[0039] 2 · 1對SIV感染動物⑶4+細(xì)胞的影響
[0040]應(yīng)用單克隆抗體直接熒光標(biāo)記⑶4+，CD8+細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明SIVmac 感染4周時模型對照組⑶4+及⑶4+/CD8+比值下降(P<0.01);與模型對照組比，羧基麥芽糖鐵 與化合物（I)組合物組和陽性對照組⑶ 4+及⑶4+/⑶8+比值顯著上升(P<〇.01);與模型組比， 羧基麥芽糖鐵組、化合物（I)組⑶ 4+及⑶47⑶8+比值上升(P<〇.〇5)。見下表。
[0041 ] 2.2對SIV模型動物T淋巴細(xì)胞分化增殖的影響
[0042]與正常對照組比，模型組在感染4周時，T細(xì)胞對ConA誘導(dǎo)分化增殖反應(yīng)明顯下降， 與感染前相比有明顯差異(p〈0.01)。與模型組比較，羧基麥芽糖鐵與化合物（I)組合物組和 陽性對照組T細(xì)胞對有絲分裂原刺激的反應(yīng)能力顯著提高，T細(xì)胞明顯回升(P<0.01);與模 型組比，羧基麥芽糖鐵組、化合物（I)組T細(xì)胞回升(P<0.05)。結(jié)果見下表。
[0043] 2.3對SIV模型動物B淋巴細(xì)胞分化增殖的影響
[0044] 與正常對照組比較，模型對照組在感染4周時，與感染前相比B細(xì)胞功能受損，增殖 反應(yīng)低于感染前(P〈〇.01)。與模型對照組比較，羧基麥芽糖鐵與化合物（I)組合物組和陽性 對照組B細(xì)胞增殖顯著上升(P<0.01);與模型對照組比較，羧基麥芽糖鐵組、化合物（I)組B 細(xì)胞增殖上升(P<〇. 05)。結(jié)果見下表。
[0045]
[0046] 艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合癥，由艾滋病毒感染所致，目前國際上采用哈特 療法(HAART)，即幾種優(yōu)勢互補(bǔ)西藥聯(lián)合應(yīng)用，是公認(rèn)的高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療藥物，但還 是不能使病毒徹底殺滅，而且副作用多，使患者生活質(zhì)量下降。猴免疫缺陷病毒(SIV)誘發(fā) 猴艾滋病（SAIDS)感染實驗動物模型，是1989年經(jīng)WHO專家推薦抗艾滋病藥物治療動物模 型，它在病原學(xué)，臨床、病理、免疫學(xué)及發(fā)病機(jī)理等方面與人感染艾滋病極為相似，國外已較 多用于評價抗艾滋病藥物的效果。
[0047] ⑶4+細(xì)胞是維護(hù)機(jī)體免疫功能的重要細(xì)胞，也是SIV破壞的主要細(xì)胞，因此⑶4+陽 性細(xì)胞數(shù)降低對免疫缺陷進(jìn)展有直接關(guān)系。它的數(shù)量及功能變化是評價疾病發(fā)展和藥物療 效的重要指標(biāo)。正常人體CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞相對制約維持機(jī)體的免疫平衡，由于HIVAIDS 患者⑶4+細(xì)胞數(shù)量不斷減少及功能受損至使⑶4+⑶8+細(xì)胞比例倒置，CD8+細(xì)胞較⑶4+細(xì)胞相 對占優(yōu)勢，增強(qiáng)免疫抑制作用，造成免疫功能失調(diào)，如HIV進(jìn)一步侵犯機(jī)體其它免疫細(xì)胞，即 會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷。由于病毒在體內(nèi)持續(xù)不斷的復(fù)制，破壞機(jī)體免疫細(xì)胞，致使SIV 模型動物外周血CD4+細(xì)胞數(shù)量明顯降低。CD4+細(xì)胞被破壞，數(shù)量減少，淋巴細(xì)胞正常功能受 到抑制，致使T淋細(xì)胞對有絲分裂原誘導(dǎo)反應(yīng)能力降低，感染SIV動物B細(xì)胞對細(xì)菌脂多糖 LPS反應(yīng)能力也下降，但不及T細(xì)胞明顯，呈遲緩下降趨勢。
[0048]上述結(jié)果表明，羧基麥芽糖鐵、化合物（I)單獨(dú)作用時，可以提高CD4+細(xì)胞數(shù)及改 善免疫功能調(diào)整免疫平衡，對艾滋病具有治療作用；羧基麥芽糖鐵和化合物（I)聯(lián)合作用 時，治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療艾滋病的注射液。
[0049]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種簇基麥芽糖鐵注射液，其特征在于:包括簇基麥芽糖鐵、如權(quán)利要求1所述的化 合物(I)和藥學(xué)上可W接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將燈 屯、草粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇取物用大孔樹脂除雜，先用25%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 12個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲燒-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、15:1 和1:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集10~16個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用80%乙醇熱回 流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為DlOl型 大孔吸附樹脂。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲燒代 替乙酸乙醋進(jìn)行萃取，得到二氯甲燒萃取物。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2所述的簇基麥芽糖鐵注射液在制備治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/7135GK105906683SQ201610335324
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】秦勇, 趙維, 于學(xué)珍, 李 瑞, 徐成, 周自桂, 陳建芳
【申請人】江蘇神龍藥業(yè)有限公司