一種芳香化酶基因工程菌及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因的克隆與表達(dá)領(lǐng)域，涉及一種芳香化酶基因工程菌及構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芳香化酶(Aromatase，CYP19)是細(xì)胞色素 P450酶家族中的一員，是雌激素合成過 程中最后一步的限速酶，能催化睪酮和雄烯二酮不可逆的轉(zhuǎn)化為雌激素，是雌激素生物合 成過程中的關(guān)鍵酶?，F(xiàn)有研究表明，芳香化酶的表達(dá)及其功能的調(diào)節(jié)會使雌激素的生成量 發(fā)生顯著變化，同時可干擾局部或系統(tǒng)的雌激素水平。因此，芳香化酶成為治療乳腺癌的理 想靶點(diǎn)，也是用于檢測芳香化酶抑制劑對芳香化酶的抑制活性的常用酶。
[0003] 在芳香化酶抑制劑研究中所用的芳香化酶多來源于胎盤，胎盤來源受限且芳香化 酶是膜蛋白，難以分離純化，因此芳香化酶基因的異源表達(dá)是大量獲得芳香化酶的最佳方 法。F Zhang等人曾報道在大腸桿菌中表達(dá)過芳香化酶，但大腸桿菌在蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加 工機(jī)制，其表達(dá)的重組芳香化酶在大腸桿菌中以包涵體形式存在，需變性再復(fù)性才具有活 性，收率低且步驟繁瑣。Sigle和Nelson等人在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)過芳香化酶，Pompon等人在 釀酒酵母中表達(dá)過芳香化酶，但他們所表達(dá)的芳香化酶均為胞內(nèi)酶，不僅產(chǎn)率較低，遺傳穩(wěn) 定性差，而且難以分離純化。
[0004] 畢赤酵母在蛋白質(zhì)翻譯后能對蛋白進(jìn)行加工、折疊、翻譯后修飾等，畢赤酵母表達(dá) 系統(tǒng)在試驗(yàn)操作上與大腸桿菌及釀酒酵母一樣簡單，而且它與昆蟲細(xì)胞或釀酒酵母等其它 真核表達(dá)系統(tǒng)相比表達(dá)水平更高。
[0005] 芳香化酶的N端前45個氨基酸為跨膜區(qū)，在異源胞外表達(dá)芳香化酶時常采用N端替 換或刪除前45個氨基酸的方法來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明采用PCR技術(shù)克隆了刪減了 N端前45個氨基酸 殘基的芳香化酶的主功能區(qū)并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，以實(shí)現(xiàn)芳香化酶在畢赤酵母中的胞外表 達(dá)。
[0006] 脊椎動物體內(nèi)芳香化酶含量較低，不僅較難分離純化，而且提取成本較高。原核表 達(dá)產(chǎn)物缺乏芳香化酶催化活性，其表達(dá)產(chǎn)物必須經(jīng)過變性后再復(fù)性才具有活性，收率低且 步驟繁瑣。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)芳香化酶成本高且收率低，釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)芳香 化酶容易過糖基化，且表達(dá)水平?jīng)]有畢赤酵母高。本發(fā)明提供了一種芳香化酶在畢赤酵母 中胞外活性表達(dá)的方法，為芳香化酶的表達(dá)提供一種新的途徑。通過檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)有 在畢赤酵母中表達(dá)芳香化酶的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供芳香化酶基因工程菌及構(gòu)建方 法。本發(fā)明所構(gòu)建的重組畢赤酵母基因工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，且表達(dá)的芳香化酶 具有活性，為芳香化酶的產(chǎn)業(yè)化和在乳腺癌藥物研發(fā)奠定了優(yōu)良的基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：
[0009] -種產(chǎn)芳香化酶的基因工程菌，工程菌的宿主菌為畢赤酵母，含有如序列1所述的 芳香化酶的基因序列。
[0010] 而且，所述基因的載體為質(zhì)粒pPIC9K_aromatase。
[0011] 產(chǎn)芳香化酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下
[0012] ⑴通過PCR技術(shù)克隆了人類芳香化酶基因，克隆的芳香化酶基因?yàn)閯h減了N端前45 個氨基酸殘基的芳香化酶的主功能區(qū)；
[0013] ⑵構(gòu)建該基因的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，將重組菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用 甲醇誘導(dǎo)其尚效表達(dá)；
[0014] ⑶發(fā)酵60小時后，分離菌體和發(fā)酵液，用超濾管初步濃縮發(fā)酵液；
[0015] ⑷通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測發(fā)酵液中是否有目的蛋白，最后按照相應(yīng)的酶活測 定方法檢測重組蛋白的活性。
[0016] 本申請所述產(chǎn)芳香化酶的基因工程菌發(fā)酵獲得的芳香化酶。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0018] 1、本發(fā)明提供了一種胞外表達(dá)芳香化酶的方法，該方法簡單有效，構(gòu)建的畢赤酵 母基因工程菌成功的胞外表達(dá)了具有功能活性的芳香化酶，能為后期研究芳香化酶抑制劑 提供所需蛋白。
[0019] 2、本發(fā)明所構(gòu)建的重組畢赤酵母基因工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，且表達(dá)的芳 香化酶具有活性，為芳香化酶的產(chǎn)業(yè)化和為抗乳腺癌藥物的研發(fā)奠定了優(yōu)良的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為重組質(zhì)粒pPIC9K_aromatase的構(gòu)建；
[0021 ]圖2為pMD19-T_aromatase重組質(zhì)粒的單酶切驗(yàn)證；M:maker(10kb)，1:pMD19_T_ aromatase單酶切結(jié)果；
[0022] 圖3為pPIC9K_aromatase重組質(zhì)粒的單酶切驗(yàn)證；M:maker(10kb)，1:pPIC9K_ aromatase單酶切結(jié)果；
[0023] 圖4為重組工程菌基因組PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測圖;M:maker(10kb)，1:工程菌基 因組PCR電泳結(jié)果；
[0024] 圖5為重組菌發(fā)酵液和Pichia pastoris GS115發(fā)酵液的SDS-PAGE檢測圖；M: maker(245KD)，1:重組菌P.pastoris GS115/pPIC9K_aromatase的發(fā)酵液，GS115 : P.pastoris 65115^^比91(發(fā)酵液。
[0025] 圖6為重組芳香化酶對MFC轉(zhuǎn)化的測定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù) 手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā) 明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。
[0027] 本發(fā)明根據(jù)Bulun SE等報道的基因序列，通過PCR技術(shù)克隆了人類芳香化酶基因， 芳香化酶的N端前45個氨基酸殘基為膜結(jié)合多肽，本發(fā)明所克隆的芳香化酶基因?yàn)閯h除N端 前45個氨基酸殘基的芳香化酶的主功能區(qū)。構(gòu)建該基因的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，將 重組菌轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用甲醇誘導(dǎo)其高效表達(dá)，發(fā)酵60小時后，分離菌體和發(fā)酵液， 用超濾管初步濃縮發(fā)酵液，通過SDS-PAGE蛋白電泳檢測發(fā)酵液中是否有目的蛋白，最后按 照相應(yīng)的酶活測定方法檢測重組蛋白的活性。
[0028]具體操作方式及步驟如下：
[0029] 實(shí)施例1:
[0030]人類芳香化酶基因的克隆
[0031]根據(jù)Bulun SE等報道的基因序列，通過PCR技術(shù)克隆了刪除N端前45個氨基酸殘基 的芳香化酶基因的主功能區(qū)，并分別設(shè)計了上下游引物9KD45F-SnaBI和9KD45R-N〇tI。并在 該引物的末端添加了 SnaBI和Notl限制性酶切位點(diǎn)。
[0032] 9KD45F-SnaBI:5，-TACGTAAGCATCCCGGGTCCGGGCTAC-3，
[0033] 9KD45R-NotI：5;-GCGGCCGCTTAATGTTCCAGACAACGATCACTGTTG-3 ;
[0034]以人類芳香化酶基因?yàn)槟０?，通過PCR技術(shù)克隆了刪減了 N端前45個氨基酸的芳香 化酶的主功能區(qū)。PCR擴(kuò)增條件為:94°C5分鐘，94°C30秒，64°C40秒，72°C90秒，30個循環(huán)，72 °C延伸10分鐘。
[0035] 實(shí)施例2:
[0036]畢赤酵母胞外表達(dá)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0037] 將PCR產(chǎn)物與載體質(zhì)粒PMD19-T進(jìn)行連接反應(yīng)，再將載體轉(zhuǎn)化至菌株E.coli BL21 (DE3)中，并接種到含Amp的LB平板上，因?yàn)橹亟M質(zhì)粒pMD19-T_aromatase含Amp抗性基因，所 以導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌也具有Amp抗性，本發(fā)明根據(jù)是否帶有Amp抗性來篩選重組 子，在Amp抗性平板上可以生長的就是構(gòu)建成功的重組子。從LB固體平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接 到LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶