枯草芽孢桿菌k13及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制橡膠樹炭疽病菌的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13，于2015年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.10917，屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。同時(shí)公開了所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的培養(yǎng)方法和應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株經(jīng)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選所得，能夠有效抑制橡膠樹炭疽病菌的生長(zhǎng)，對(duì)人畜無害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗性，能夠進(jìn)行商業(yè)開發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。CGMCC No. 1091720150527
【專利說明】
枯草芽孢桿菌K13及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13 及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] d然橡膠是重要的戰(zhàn)略物資，屬于一種緊缺性資源。它與鐵礦石、石油、煤炭并列為 四大工業(yè)原料。在交通和國防工業(yè)上都發(fā)揮著巨大的作用，同時(shí)它又與國民經(jīng)濟(jì)狀況、經(jīng)濟(jì) 周期和金融貨幣政策及國家貿(mào)易政策有著緊密聯(lián)系；因此d然橡膠種植業(yè)具有舉足輕重的 地位。d然橡膠的生產(chǎn)過程與農(nóng)產(chǎn)品一樣受季節(jié)和d氣等因素影響，在我國熱區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展中， 在d然橡膠比較集中的產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民和農(nóng)場(chǎng)職工把d然橡膠種植作為增收的支柱產(chǎn)業(yè)，大 約有300多萬人從事d然橡膠的種植生產(chǎn)。d然橡膠產(chǎn)業(yè)為我國的經(jīng)濟(jì)建設(shè)、國防安全都提供 了強(qiáng)大的支持。為各地區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，和諧穩(wěn)定都作出了巨大的貢獻(xiàn)。
[0003] 橡膠炭疽病是橡膠樹上的一種重要病害，橡膠炭疽病病情逐年嚴(yán)重，截止目前為 止，該病在世界各植膠國均有發(fā)生。從苗圃小苗、大田幼樹直至成齡開割膠樹均可受到炭疽 病為害。該病菌感染橡膠樹的嫩葉、葉柄、嫩梢和果實(shí)，嚴(yán)重時(shí)引起嫩葉脫落，嫩梢回枯和果 實(shí)腐爛，甚至形成僵果懸掛在樹上。
[0004] 橡膠炭疽病自1906年P(guān)etch在斯里蘭卡首次發(fā)現(xiàn)，近年來，國內(nèi)橡膠產(chǎn)業(yè)形勢(shì)發(fā)生 了明顯變化，種植、栽培、管理模式等的多元化，加上生態(tài)環(huán)境的改變，橡膠重要病害檢測(cè)、 監(jiān)測(cè)和防控技術(shù)上出現(xiàn)一些新的問題。如，病害發(fā)生、災(zāi)變情況發(fā)生變化，病害疫情、發(fā)生及 流行規(guī)律研究缺乏系統(tǒng)性，基礎(chǔ)研究工作薄弱；病害監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)預(yù)警工作技術(shù)支撐不足;新 發(fā)生和災(zāi)變危險(xiǎn)性病害缺乏認(rèn)識(shí)和技術(shù)儲(chǔ)備;化學(xué)防治方法單一，存在生態(tài)和抗藥性安全 隱患；抗病橡膠種質(zhì)資源情況不清楚，抗病性基因資源的挖掘和利用在病害防治中的巨大 作用未得到充分發(fā)揮。
[0005] 綜上所述，需要針對(duì)橡膠炭疽病的特征，開發(fā)出一種專治橡膠炭疽病的防治方法， 填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種抑制橡膠樹炭疽病菌的枯 草芽抱桿菌(Bacillus subtil is )K13，所述枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is )K 13是一種 從橡膠樹內(nèi)分離篩選獲得對(duì)橡膠樹炭疽病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)橡膠樹炭疽 病的防治具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述抑制橡膠樹炭疽病菌的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的分離方法與在防治炭疽病災(zāi)害方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：
[0009] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13,其保藏編號(hào)為:CGMCC No. 10917,于2015 年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0010] 進(jìn)一步的，所述枯芽孢桿菌K13分離自橡膠樹葉。
[0011] 上述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0012] 將所述枯草芽孢桿菌接種于液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)得到；
[0013] 所述液體LB培養(yǎng)基的配方:每1000mL水中含:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g;pH為7.4。
[0014] 進(jìn)一步的，包括如下步驟：
[0015] 步驟一:將所述枯草芽孢桿菌接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂并密封，恒溫培養(yǎng)，得到單菌 落；
[0016] 步驟二:取所述單菌落轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基中，密封，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，然后 將所述液體LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至LB固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，恒溫培養(yǎng)，通過無限稀釋法獲得單 一菌株；
[0017] 步驟三:對(duì)所述單一菌株分別進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng):取炭疽菌RC178的菌餅，置于LB平板 培養(yǎng)基中間，在所述菌餅周圍接種所述單一菌株，密封，恒溫培養(yǎng)，根據(jù)所述單一菌株對(duì)炭 疽菌RC178的抑菌作用，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13;
[0018] 步驟四：取所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培 養(yǎng)，得到枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is )K13菌種。
[0019] 進(jìn)一步的，包括如下步驟:所述步驟一中：所述恒溫培養(yǎng)條件為:將接種后的培養(yǎng) 基倒置放入丨旦溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為28 °C，培養(yǎng)時(shí)間為48h。
[0020] 進(jìn)一步的，包括如下步驟:所述步驟二中：所述恒溫培養(yǎng)條件為:將LB固體培養(yǎng)基 倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h，置于搖床上震蕩培養(yǎng)的溫度為 28°(：，培養(yǎng)時(shí)間為1211。
[0021] 進(jìn)一步的，包括如下步驟:所述步驟三中：將接種后的LB平板培養(yǎng)基倒置放入恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為4~7d;所述菌餅的直徑為6mm;所述對(duì)峙培養(yǎng)設(shè)置 3個(gè)重復(fù)，以只接種所述炭疽菌RC178，不接種所述單一菌株為對(duì)照；
[0022] 所述篩選方法為:采用兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng);挑取28 °C恒溫培養(yǎng)7d的拮抗菌和病原菌的 同質(zhì)等量菌絲，接種于距離PDA平皿中心1.5cm的2個(gè)點(diǎn)上，再置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)，逐日 觀察抑菌作用;上述對(duì)峙培養(yǎng)方式設(shè)3個(gè)重復(fù)，以僅接種病原真菌的平皿作為對(duì)照。
[0023] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)K13的基因序列如SEQ ID NO 1所不。
[0024] 上述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)K13的應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtil is)K13用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌有詰抗作用的生化試劑;用于制備對(duì) 橡膠樹炭疽病菌菌絲有抑制、致畸作用的生化試劑；用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌菌絲分生 孢子萌發(fā)有抑制作用的生化試劑。
[0025]本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13為植物內(nèi)生菌，對(duì)橡膠樹炭疽病菌抑制 作用強(qiáng)，對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中起到非常重 要的作用，例如:種類和數(shù)量眾多，在植物葉際，葉內(nèi)大量存在;對(duì)病原菌的作用方式多種多 樣，例如:對(duì)橡膠樹炭疽病菌有拮抗作用，對(duì)橡膠樹炭疽病菌菌絲有抑制、致畸作用;對(duì)橡膠 樹炭疽病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用。繁殖速度快，對(duì)橡膠樹炭疽病的防治具有重要 意義。
[0027] 2、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)橡膠樹炭疽病菌抑制作用強(qiáng)，有利于 維持有益微生物的生態(tài)平衡，由于生防細(xì)菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)通常直接針對(duì)相應(yīng)的病原菌 起作用，特異性強(qiáng)，故此不會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中其它有益微生物產(chǎn)生不利影響，有助于維持 有益微生物的生態(tài)平衡。
[0028] 3、菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0029] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)K13:
[0030] 保藏編號(hào)為:CGMCC No .10917;
[0031] 保藏日期:2015年5月27日；
[0032]保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；
[0033] 保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
【附圖說明】
[0034] 圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)橡膠樹炭疽病菌的平板對(duì)峙拮抗 作用圖；（a)為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果l，（b)為 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果2，（c)為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果3，（d)為對(duì)照組--炭疽菌RC178的培 養(yǎng)結(jié)果；
[0035] 圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株的生長(zhǎng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下文將結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的 技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好 的技術(shù)效果。
[0037] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13,其保藏編號(hào)為:CGMCC No. 10917,于2015 年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。所述枯芽孢桿菌K13分離自橡膠樹葉。
[0038] 上述的枯草芽孢桿菌（Baci 1 lus subt i 1 i s )K13的應(yīng)用：所述枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtil is)K13用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌有詰抗作用的生化試劑;用于制備對(duì) 橡膠樹炭疽病菌菌絲有抑制、致畸作用的生化試劑；用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌菌絲分生 孢子萌發(fā)有抑制作用的生化試劑。
[0039] 實(shí)施例1 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)K13
[0040] 1、采樣：從橡膠樹上摘取有炭疽病斑的葉片，用清水洗去葉片上的灰塵砂礫，晾 干，用剪刀在病健交界處剪取小病葉備用;剪取小病葉的大小為5_X5mm。
[0041 ] 2、樣品消毒:將所述小病葉放入燒杯，用升汞浸泡30s，期間不斷地輕輕攪動(dòng)，然后 用無菌水沖洗三次，晾干，得到消毒后的小病葉。
[0042] 3、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13分離培養(yǎng):用已滅菌的鑷子將消毒后的 小病葉貼放到馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體(PDA)培養(yǎng)基上，每皿均勾擺放4±夬，再將培養(yǎng)皿用保 鮮膜密封，倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)，每隔12h進(jìn)行觀察，48h后將長(zhǎng)出的菌體轉(zhuǎn)接 至另一馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基上，倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)48h后進(jìn)行純 化，得到純化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )K13。
[0043] 采用梯度稀釋法，將所述純化后的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13分別涂 布在不同的LB平板培養(yǎng)基中，倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)48h，分別取出上述LB平板 培養(yǎng)基，分別挑取單菌落接種至不同試管中的斜面培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中保存，溫度為8 ~nrc〇
[0044] 4、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)K13的純化
[0045] 在無菌操作臺(tái)中，將液體LB培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，取出所述培養(yǎng)箱中保存的試 管，用接種針挑取少量枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13分別接種于所述錐形瓶中， 封口，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，溫度為28 °C，培養(yǎng)12h后，取出所述搖床上震蕩培養(yǎng)的錐形瓶， 用移液器吸取200微升于LB培養(yǎng)基上，用涂抹棒涂抹均勻，倒置放入28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 培養(yǎng)時(shí)間為48h，再通過無限稀釋法處理獲得29株單一菌株；
[0046] 5、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的篩選與培養(yǎng) [0047]對(duì)所述29株單一菌株分別進(jìn)行如下對(duì)峙培養(yǎng)：
[0048]用無菌打孔器打取炭疽菌RC178的菌餅，菌餅的直徑為6mm，置于LB平板培養(yǎng)基中 間，LB平板培養(yǎng)皿的直徑為90mm，在所述菌餅周圍十字交叉的4個(gè)角落接種所述單一菌株， 設(shè)置3個(gè)重復(fù)，用保鮮膜封上培養(yǎng)皿防止污染。
[0049]采用點(diǎn)線處理法和其他對(duì)峙形式，進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)；以只接種所述炭疽菌RC178,不 接種所述單一菌株為對(duì)照組。置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為4~7d。
[0050]根據(jù)所述單一菌株對(duì)炭疽菌RC178的抑菌作用，篩選得到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13;篩選方法為:采用兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng);挑取28°C恒溫培養(yǎng)7d的拮抗菌和病原菌的 同質(zhì)等量菌絲，接種于距離PDA平皿中心1.5cm的2個(gè)點(diǎn)上，再置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)，逐日 觀察抑菌作用;上述對(duì)峙培養(yǎng)方式設(shè)3個(gè)重復(fù)，以僅接種病原真菌的平皿作為對(duì)照。
[0051 ] 6、在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13,得到枯草 芽抱桿菌(Bacillus subtilis)K13菌種。
[0052]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)橡膠樹炭疽病菌的平板對(duì)峙拮抗 作用圖，其中圖1(a)為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果 1，圖1(b)為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果2,圖1(c)為 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13與炭疽菌RC178對(duì)峙的結(jié)果3,圖1(d)為對(duì)照組-- 炭疽菌RC178的培養(yǎng)結(jié)果。
[0053] 實(shí)施例2枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的生理生化鑒定
[0054] 1、V-P 試驗(yàn)
[0055] 1)原理
[0056]某些細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲 醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被空氣里的氧氧化為二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精 氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，則為V-P試驗(yàn)陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量較少，則 可加入少量含胍基化合物，如肌酸或肌酐等。試驗(yàn)時(shí)加入α-萘酚可加速此反應(yīng)。
[0057] 2)培養(yǎng)基
[0058] 蛋白胨5.0克，葡萄糖5.0克，Κ2ΗΡ〇4(或NaCl) 5.0克，蒸餾水1000毫升，pH為7.0~ 7.2,分裝于試管中，每支試管5毫升，121°C滅菌20分鐘。
[0059] 3)試劑
[0060] 6 % α-奈酚酒精溶液為甲液，40 %氫氧化鉀為乙液。
[0061] 4)方法
[0062]用瓊脂培養(yǎng)物將被檢細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)后，于28°C培養(yǎng)48-96h;于2 毫升培養(yǎng)液內(nèi)加入1毫升甲液和〇. 4毫升乙液，搖振混合。試驗(yàn)時(shí)強(qiáng)陽性者5分鐘后，可產(chǎn)生 粉紅色反應(yīng)，如無反應(yīng)，應(yīng)放在36±1°C下培養(yǎng)4h再進(jìn)行觀察。（長(zhǎng)時(shí)間無反應(yīng)，可置于室溫 過夜），次日不變者為陰性。
[0063] 5)試驗(yàn)結(jié)果
[0064] 表1為V-P試驗(yàn)結(jié)果。
[0065] 表1為V-P試驗(yàn)結(jié)果
[0066]
[0067] 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13為V-P試驗(yàn)陽性，可知枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13含有丙酮酸脫羧酶，可以將細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生的丙酮 酸脫羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性環(huán)境下可被氧化生成二乙酰，二乙酰再與含 有胍基的化合物反應(yīng)，生成紅色的化合物，即為V-P實(shí)驗(yàn)陽性。
[0068] 2、甲基紅試驗(yàn)
[0069] 1)原理：
[0070] 甲基紅試驗(yàn)是根據(jù)腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙 酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性 產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基的pH值降至4.5以下，使甲基紅指示劑變紅這個(gè)原理進(jìn)行的測(cè)驗(yàn)。
[0071] 2)培養(yǎng)基
[0072]蛋白胨5.0克，葡萄糖5.0克，氯化鈉 5.0克，蒸餾水1000毫升，pH為7.0~7.2，分裝 于試管中，121°C滅菌20分鐘。
[0073] 3)試劑
[0074] 甲基紅0.1克、95 %乙醇300毫升、蒸餾水200毫升。
[0075] 4)方法
[0076] 取10微升K13新鮮種子液接種于試管中，置于28°C恒溫培養(yǎng)2、4、6d取出，然后在培 養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑，紅色表示甲基紅試驗(yàn)為陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)。
[0077] 5)試驗(yàn)結(jié)果
[0078] 表2為甲基紅試驗(yàn)結(jié)果
[0079] 表2甲基紅試驗(yàn)結(jié)果
[0080]
[0081]由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13為甲基紅試驗(yàn)陽性，可知枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )K13可產(chǎn)生大量酸性產(chǎn)物。
[0082] 3、接觸酶試驗(yàn)
[0083] 1)原理
[0084] 具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出 現(xiàn)氣泡，一般用來鑒別細(xì)菌的類型。革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫 酶，而鏈球菌屬為陰性，故此試驗(yàn)常用于革蘭陽性球菌的初步分群。
[0085] 2)方法
[0086] 取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，加數(shù)滴3 %過氧化氫溶液;或直接滴加3 %過氧 化氫溶液于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣 泡者為陰性。
[0087] 3)試劑
[0088] 3 %過氧化氫溶液。
[0089] 4)試驗(yàn)結(jié)果
[0090]表3為接觸酶試驗(yàn)結(jié)果。
[0091]表3接觸酶試驗(yàn)結(jié)果 [0092]
[0093]由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13為革蘭氏陽性菌，是具有過 氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫產(chǎn)生水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。
[0094] 實(shí)施例5
[0095] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株生長(zhǎng)曲線的繪制
[0096] 1)方法
[0097]采用比色法測(cè)定:將液體LB培養(yǎng)基裝入2000毫升三角瓶中，滅菌冷卻后，接入活化 的枯草芽孢桿菌(Baci 1 lus subti 1 is)K13菌株，置于28°C、180轉(zhuǎn)每分鐘的搖床上培養(yǎng)。每 隔兩個(gè)h取樣，測(cè)定600納米處菌液的吸光度(0D600)。
[0098] 2)結(jié)果：
[0099] 圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株的生長(zhǎng)曲線圖，其中0D600為縱 坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)。因?yàn)槲舛扔删好芏葲Q定，故由吸光度的變化趨勢(shì)可以推測(cè)細(xì) 菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)。
[0100]由圖2可知:0~7h，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株生長(zhǎng)緩慢，處于停 滯生長(zhǎng)期；7~16h，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )K13菌株生長(zhǎng)迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期；16~56h，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)Κ13菌株生長(zhǎng)相對(duì)平緩，處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期； 而在培養(yǎng)56h之后，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株生長(zhǎng)開始出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，處于 生長(zhǎng)的衰亡期。
[0101] 實(shí)施例6
[0102] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究
[0103] 1)材料
[0104] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，去離子水添加至 1000毫升，高壓下蒸汽滅菌20分鐘。
[0105] 2)方法
[0106] A、首次篩選:采用四點(diǎn)法。在事先備好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基中央，接種 直徑為6mm的炭疽菌RC178菌餅，同時(shí)在距馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基中央25mm的對(duì)稱四 點(diǎn)處接種單一菌株，每株菌重復(fù)3次，28 °C下倒置培養(yǎng)，3d后觀察有無抑菌帶形成。
[0107] B、復(fù)篩:采用劃線法。在事先備好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基中央，接種直徑 為6mm的炭疽菌RC178菌餅，同時(shí)在距馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基中央25mm處的兩側(cè)，用 接種針蘸取待測(cè)菌分別劃一條長(zhǎng)30mm的直線，每個(gè)菌株重復(fù)3次，28°C下倒置培養(yǎng)4d后測(cè)量 各菌株抑菌帶的寬度。（放線菌生長(zhǎng)較慢，需比病原菌提前3d劃線，以確保其定殖）。
[0108] 3)結(jié)果
[0109] 表4為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究的結(jié)果。
[0110] 表4枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果研究結(jié)果
[0112] 可知。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13的抑菌效果非常好。
[0113] 實(shí)施例7
[0114] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)抗生素的敏感性研究
[0115] 1)培養(yǎng)基
[0116] LB固體培養(yǎng)基。
[0117] 2)試劑
[0118] 氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、利福平、頭孢霉素。
[0119] 3)方法
[0120] 用濾紙片法測(cè)定枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )K13對(duì)不用抗生素的敏感性， 用打孔器制備直徑7mm的濾紙片，高溫滅菌;在溶化后冷卻至50-55°C的LB固體培養(yǎng)基中加 入1毫升枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13種子液，搖勻后倒平板，將滅菌后的濾紙片 置于平板中，然后在濾紙上添加抗生素溶液，添加量相當(dāng)于氨芐青霉素 Amp 50微克每毫升、 卡那霉素 Kana 50微克每毫升、氯霉素 Chi 50微克每毫升、鏈霉素 Str 50微克每毫升、四環(huán) 素 Tet 50微克每毫升、紅霉素 Ery 50微克每毫升、利福平Rif 50微克每毫升、頭孢霉素 Cef 50微克每毫升，放置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于24h、48h觀察結(jié)果。
[0121] 4)結(jié)果
[0122] 表5為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)抗生素的敏感性研究的結(jié)果。
[0123] 表5枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)抗生素的敏感性研究結(jié)果表

[0125] 本實(shí)驗(yàn)主要為了測(cè)試枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13對(duì)各種抗生素的敏 感性，結(jié)果表明：氨節(jié)青霉素、氯霉素對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13均無抑制。
[0126] 本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)K13菌株能夠有效抑制橡膠樹炭疽 病菌的生長(zhǎng)，對(duì)人畜無害、綠色安全、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗性，能夠進(jìn)行商業(yè)開發(fā)，應(yīng) 用前景廣闊。
[0127] 本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在 不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本文的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是示例性的，不 應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 枯草芽孢桿菌(feciDus su/7ii2is)K13,其保藏編號(hào)為:CGMCC No. 10917,于2015 年5月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為:北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(ifeciDus su/?ii7is)K13,其特征在于，所述枯芽 孢桿菌K13分離自橡膠樹葉。3. 權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌(feciDus su/?ii7is)K13的培養(yǎng)方 法，其特征在于，包括如下步驟： 將所述枯草芽孢桿菌接種于液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)得到； 所述液體LB培養(yǎng)基的配方:每1000mL水中含:胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g; pH為7.4。4. 權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌(feciDus K13的培養(yǎng)方法，其特征在于， 包括如下步驟： 步驟一:枯草芽孢桿菌(ifeciDus 分離培養(yǎng)： 將已消毒的炭疽病斑葉片接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，密封，進(jìn)行第一次恒溫培 養(yǎng)，后轉(zhuǎn)接至另一馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次恒溫培養(yǎng)，純化，得到純化 后的枯草芽孢桿菌(iihdKl3，置于8~10°C培養(yǎng)箱中的斜面試管中保存； 步驟二:枯草芽孢桿菌(ifeciDus 的純化： 取所述純化后的枯草芽孢桿菌(feciDt/s 轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基中，密 封，置于搖床上震蕩培養(yǎng)，然后將所述枯草芽孢桿菌(feciDt/s 從液體LB培 養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至LB固體培養(yǎng)基上，涂抹均勻，恒溫培養(yǎng)，通過無限稀釋法獲得單一菌株； 步驟三:枯草芽孢桿菌(feciDus Su/7iih\s)K13的篩選與培養(yǎng) 將所述單一菌株轉(zhuǎn)接到LB平板，然后用涂布平板法得到單菌落;取炭疽菌RC178的菌 餅，置于LB平板培養(yǎng)基中間，在所述菌餅周圍接種所述單菌落，密封，恒溫培養(yǎng)，根據(jù)所述單 一菌株對(duì)炭疽菌RC178的抑菌作用，篩選得到枯草芽孢桿菌 St//7iih\s)K13; 步驟四：培養(yǎng)枯草芽孢桿菌(ifeciDus su/7ii2is)K13菌種： 取所述枯草芽孢桿菌在液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，得到枯草 芽抱桿菌5必?^_/〗5)1(13菌種。5. 權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌(feciDus K13的培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟一中： 第一次恒溫培養(yǎng)的條件為:將接種后的培養(yǎng)基倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為28 °C，培養(yǎng)時(shí)間為48h;第二次恒溫培養(yǎng)的條件為:倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28°C培養(yǎng)48h; 將純化后的枯草芽孢桿菌(feciDt/s 采用梯度稀釋涂布LB平板培養(yǎng)基 中，28 °C培養(yǎng)48 h，后挑取單菌落接至培養(yǎng)基斜面上，置于培養(yǎng)箱中保存，溫度為8~10°C。6. 權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌(feciDus K13的培養(yǎng)方法，其特征在于， 包括如下步驟:所述步驟二中：所述恒溫培養(yǎng)條件為:將LB固體培養(yǎng)基倒置放入恒溫培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)的溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h，置于搖床上震蕩培養(yǎng)的溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為 12h〇7. 權(quán)利要求5所述的枯草芽孢桿菌(feciDus K13的培養(yǎng)方法，其特征在于， 包括如下步驟:所述步驟三中：將接種后的LB平板培養(yǎng)基倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的溫 度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間為4~7d;所述菌餅的直徑為6mm;所述對(duì)峙培養(yǎng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以只接種 所述炭疽菌RC178，不接種所述單一菌株為對(duì)照； 所述篩選的方法為:采用兩點(diǎn)對(duì)峙培養(yǎng);挑取28°C恒溫培養(yǎng)7d的拮抗菌和病原菌的同 質(zhì)等量菌絲，接種于距離PDA平皿中心1.5cm的2個(gè)點(diǎn)上，再置于28°C恒溫箱中培養(yǎng)，逐日觀 察抑菌作用;上述對(duì)峙培養(yǎng)方式設(shè)3個(gè)重復(fù)，以僅接種病原真菌的平皿作為對(duì)照。8. 權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌(ifeciDus 的應(yīng)用，其特 征在于，所述枯草芽孢桿菌(BaciDus 用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌有詰抗作 用的生化試劑。9. 權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌(ifeciDus 的應(yīng)用，其特 征在于，用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌菌絲有抑制、致畸作用的生化試劑。10. 權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的枯草芽孢桿菌(feciDus suMi2is)K13的應(yīng)用，其 特征在于，用于制備對(duì)橡膠樹炭疽病菌菌絲分生孢子萌發(fā)有抑制作用的生化試劑。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK105936879SQ201510815701
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日
【發(fā)明人】鄭肖蘭, 鄭金龍, 賀春萍, 易克賢, 習(xí)金根, 吳偉懷, 梁艷瓊, 李銳
【申請(qǐng)人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所