Dna檢測(cè)方法和dna檢測(cè)裝置的制造方法
【專利摘要】本公開(kāi)提供即使同時(shí)檢測(cè)的DNA的堿基序列模式增加，檢測(cè)熒光的光學(xué)系統(tǒng)也不變得復(fù)雜，構(gòu)成小型、廉價(jià)的DNA檢測(cè)裝置。本公開(kāi)涉及的DNA檢測(cè)裝置是檢測(cè)從在傳感芯片的表面上的流路中流淌的樣品液滴輸出的熒光，從而檢測(cè)成為檢測(cè)對(duì)象的DNA的DNA檢測(cè)裝置，具備：檢測(cè)從在流路中流淌的樣品液滴輸出的熒光的熒光檢測(cè)部；基于檢測(cè)到的所述熒光的連續(xù)時(shí)間判定樣品液滴所含的熒光探針?biāo)芤旱姆N類，基于相對(duì)于熒光的光強(qiáng)度的閾值的大小關(guān)系來(lái)判定樣品液滴中是否包含成為檢測(cè)對(duì)象的所述DNA的DNA檢測(cè)單元。
【專利說(shuō)明】
DN A檢測(cè)方法和DN A檢測(cè)裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本公開(kāi)涉及檢測(cè)基因(DNA)的方法和裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]有使用稱為PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的技術(shù)，使基因中的所希望的DNA/RNA片段擴(kuò)增到檢測(cè)所需的量，進(jìn)行檢測(cè)的方法。另外，作為其發(fā)展形式，多使用稱為qPCR(定量PCR，quantitative PCR)的定量分析技術(shù)。這些基因的定量分析技術(shù)被導(dǎo)入到微流路芯片內(nèi)的小型反應(yīng)器等。
[0003]專利文獻(xiàn)I中關(guān)于對(duì)基因進(jìn)行定量分析的qPCR記載了基本的實(shí)現(xiàn)方法。該專利文獻(xiàn)I中記載了以下方法:使包含單鏈DNA的樣品，與具有靶標(biāo)DNA的序列鏈的第一區(qū)域的互補(bǔ)序列的寡核苷酸(長(zhǎng)度較短的DNA/RNA的序列)、以及包含相同靶標(biāo)DNA的序列鏈的第二區(qū)域的互補(bǔ)序列的標(biāo)記寡核苷酸接觸。在發(fā)生雜交的條件下形成雙鏈復(fù)合體的混合物，通過(guò)5’—3’核酸酶活性來(lái)切斷退火后的標(biāo)記寡核苷酸而使標(biāo)記片段游離。檢測(cè)該游離的標(biāo)記片段。如果作為標(biāo)記寡核苷酸的標(biāo)記片段使用熒光色素和猝滅劑，則在標(biāo)記片段游離時(shí)才發(fā)出熒光，通過(guò)重復(fù)上述工藝，熒光強(qiáng)度變強(qiáng)。通過(guò)用光檢測(cè)器檢測(cè)該熒光強(qiáng)度，來(lái)分析以怎樣的程度包含靶標(biāo)DNA的所希望的序列鏈。在對(duì)每一樣本檢測(cè)多個(gè)部位的DNA/RNA的情況下，準(zhǔn)備與各個(gè)序列鏈互補(bǔ)的標(biāo)記寡核苷酸，通過(guò)使每個(gè)標(biāo)記寡核苷酸的成為標(biāo)記的熒光色素的材料、波長(zhǎng)不同，可以在光檢測(cè)器中根據(jù)熒光波長(zhǎng)的差進(jìn)行分離分析。
[0004]另外，專利文獻(xiàn)2中對(duì)于對(duì)基因進(jìn)行定量分析的方法公開(kāi)了實(shí)現(xiàn)方法的一例。特別是公開(kāi)了使用了乳化技術(shù)的高通量檢定的改善技術(shù)。該方法使用乳化技術(shù)，制作出作為生化反應(yīng)用的獨(dú)立的反應(yīng)腔室發(fā)揮功能的液滴，使用這些液滴來(lái)對(duì)各個(gè)亞成分(細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)等)進(jìn)行處理、檢查。
[0005]使包含DNA/RNA等的水滴在油中懸浮，制作水進(jìn)入油中的狀態(tài)的乳劑。用表面活性劑使該乳劑穩(wěn)定化，能夠使加熱、冷卻、運(yùn)輸中的液滴的結(jié)合減少或消失，由此能夠?qū)嵤囟妊h(huán)。因此，利用了 PCR的液滴中的核酸靶標(biāo)分子的單拷貝擴(kuò)增使用乳劑來(lái)實(shí)施?；诓此山y(tǒng)計(jì)來(lái)分析這些液滴內(nèi)對(duì)某靶標(biāo)為陽(yáng)性的液滴，能夠推定樣本中的靶標(biāo)的濃度。在利用液滴的檢定中，使用I種或多種熒光體作為液滴中的標(biāo)記，從而得知是否發(fā)生了擴(kuò)增等反應(yīng)。通過(guò)生成液滴、使其反應(yīng)、接著測(cè)定從各液滴放出的光，從而能夠判斷液滴中是否存在靶標(biāo)。如果使能夠區(qū)分的不同的熒光體分別對(duì)應(yīng)于每種不同的靶標(biāo)，則能夠測(cè)定每個(gè)液滴中是否存在多種不同的靶標(biāo)。這樣在區(qū)別多種不同的靶標(biāo)的情況下，大多使用多種熒光體、即發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光的色素材料，根據(jù)其熒光波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行區(qū)別。在專利文獻(xiàn)2中，公開(kāi)了使用2種熒光色素各自區(qū)別地檢測(cè)的方法。設(shè)計(jì)分別對(duì)應(yīng)于第I色素、第2色素的檢測(cè)構(gòu)成(包含光源和檢測(cè)器)，在液滴通過(guò)流路的檢測(cè)區(qū)域時(shí)，用對(duì)應(yīng)于第I色素的檢測(cè)構(gòu)成和對(duì)應(yīng)于第2色素的檢測(cè)構(gòu)成交互地檢測(cè)液滴，從而實(shí)現(xiàn)。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)I:日本特許第2825976號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)2:日本特表2013-524169號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明所要解決的課題
[0011 ]然而在現(xiàn)有的構(gòu)成中，在同時(shí)檢測(cè)DNA/RNA的堿基序列中的作為目標(biāo)的多種堿基序列模式(pattern)時(shí)，需要改變與各個(gè)堿基序列結(jié)合的熒光探針的熒光波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行分離檢測(cè)。此時(shí)，檢測(cè)熒光的檢測(cè)器需要與各個(gè)熒光色素對(duì)應(yīng)的光源和與各個(gè)熒光色素的熒光波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)器。因此，隨著同時(shí)檢測(cè)的DNA的堿基序列模式增加，會(huì)有檢測(cè)熒光的光學(xué)系統(tǒng)變得復(fù)雜的課題。
[0012]本公開(kāi)的目的在于提供即使在同時(shí)檢測(cè)的DNA的堿基序列模式增加的情況下，檢測(cè)熒光的光學(xué)系統(tǒng)也不變得復(fù)雜的、具有小型、廉價(jià)的構(gòu)成的傳感芯片。
[0013]用于解決課題的技術(shù)方案
[0014]本公開(kāi)所涉及的DNA檢測(cè)方法包括:
[0015](a)在DNA檢測(cè)裝置中設(shè)置傳感芯片，
[0016]所述DNA檢測(cè)裝置具備PCR處理部、熒光檢測(cè)部和DNA檢測(cè)部，
[0017]所述傳感芯片具備第I流路、第2流路、第3流路、第4流路、第5流路、第6流路、第7流路、第8流路和第9流路，
[0018]所述第I流路的一端以及所述第2流路的一端，與所述第3流路的一端連接，
[0019]所述第3流路的另一端與所述第6流路的一端連接，
[0020]所述第4流路以及所述第5流路，連接于所述第3流路的一端與另一端之間，
[0021]所述第6流路的另一端以及所述第7流路的一端，與所述第8流路的一端連接，
[0022]所述第8流路的另一端與所述PCR處理部連接，
[0023]所述PCR處理部與所述第9流路連接，
[0024](b)在所述第I流路和第2流路中分別導(dǎo)入DNA水溶液和DNA合成酶水溶液，從而使所述DNA水溶液和所述DNA合成酶水溶液的第I混合水溶液在所述第3流路中通過(guò)，所述DNA水溶液包含作為對(duì)象的單鏈DNA，
[0025](c)當(dāng)所述第I混合水溶液在所述第3流路中流淌時(shí)，對(duì)所述第4流路以第I流量導(dǎo)入第I熒光探針劑與第I引物混合而成的第I熒光探針?biāo)芤?，從而使所述第I混合水溶液和所述第I熒光探針?biāo)芤旱牡?混合水溶液在所述第6流路中通過(guò)，所述第I熒光探針劑與第
I單鏈DNA互補(bǔ)地結(jié)合，
[0026](d)對(duì)所述第7流路以第2流量導(dǎo)入油材料，從而使多個(gè)第2混合水溶液部和多個(gè)油材料部在所述第8流路中通過(guò)，所述多個(gè)第2混合水溶液部與所述多個(gè)油材料部沿著所述第8流路交互地排列，
[0027](e)當(dāng)所述第I混合水溶液在所述第3流路中流淌時(shí)，對(duì)所述第5流路以第3流量導(dǎo)入第2熒光探針劑與第2引物混合而成的第2熒光探針?biāo)芤海瑥亩顾龅贗混合水溶液和所述第2熒光探針?biāo)芤旱牡?混合水溶液在所述第6流路中流淌，所述第2熒光探針劑與所述第I熒光探針劑不同，并且與第2單鏈DNA互補(bǔ)地結(jié)合，
[0028](f)對(duì)所述第7流路以第4流量導(dǎo)入所述油材料，從而使多個(gè)第3混合水溶液部和多個(gè)油材料部在所述第8流路中通過(guò)，所述多個(gè)第3混合水溶液部與所述多個(gè)油材料部沿著所述第8流路交互地排列，
[0029](g)通過(guò)所述PCR處理部，對(duì)所述多個(gè)第2混合水溶液部和所述多個(gè)第3混合水溶液部進(jìn)行PCR處理，使其在所述第9流路中通過(guò)，
[0030](h)通過(guò)所述熒光檢測(cè)部，對(duì)透過(guò)了在所述第9流路中流淌的所述多個(gè)第2混合水溶液部和所述多個(gè)第3混合水溶液部的透射光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，
[0031](i)通過(guò)所述DNA檢測(cè)部，基于所述透射光的強(qiáng)度、所述第I流量、所述第2流量、所述第3流量和所述第4流量，檢測(cè)所述作為對(duì)象的單鏈DNA是否包含選自所述第I單鏈DNA和所述第2單鏈DNA中的至少I種。
[0032]發(fā)明的效果
[0033]根據(jù)本公開(kāi)所涉及的使用了傳感芯片的DNA檢測(cè)方法，即使在同時(shí)檢測(cè)的DNA的堿基序列模式增加的情況下，也可以使用同一波長(zhǎng)的用于熒光探針的熒光色素，能夠不使檢測(cè)熒光的光學(xué)系統(tǒng)變得復(fù)雜，使用構(gòu)成小型、廉價(jià)的傳感芯片實(shí)施DNA檢測(cè)方法。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1是顯示在光波導(dǎo)單元的流路中流過(guò)的液滴的樣子的概略圖，以及顯示對(duì)于在光波導(dǎo)單元的流路中流過(guò)的液滴用PMT檢測(cè)的光信號(hào)的樣子的圖。
[0035]圖2是顯示實(shí)施方式I所涉及的傳感芯片和DNA檢測(cè)裝置的構(gòu)成的方框圖。
[0036]圖3是顯示混合溶液生成單元的構(gòu)成的一例的概略圖。
[0037]圖4是顯示生成樣品液滴的一支流路的構(gòu)成的一例的概略圖。
[0038]圖5是顯示DNA擴(kuò)增單元的構(gòu)成的一例的概略圖。
[0039]圖6是顯示包含傳感芯片的光波導(dǎo)單元的部位和DNA檢測(cè)裝置210的檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成的一例的概略圖。
[0040]圖7是顯示使實(shí)施方式I中的油流量變化時(shí)的混合溶液與油材料的流量比、和液滴體積的關(guān)系的曲線圖。
[0041 ]圖8是顯示使實(shí)施方式I中的油材料流量/混合溶液流量的流量比變化時(shí)生成的樣品液滴的體積的分布圖。
[0042]圖9是顯示生成樣品液滴的一支流路的構(gòu)成的變形例的概略圖。
[0043]圖1OA是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過(guò)程的概略圖。
[0044]圖1OB是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過(guò)程的概略圖。
[0045]圖1OC是顯示使用了TaqMan探針的PCR的各過(guò)程的概略圖。
[0046]圖11是顯示使實(shí)施方式I中的混合溶液的流量變化時(shí)的混合溶液與油材料的流量比、和液滴體積的關(guān)系的曲線圖。
[0047]符號(hào)的說(shuō)明
[0048]101 流路
[0049]102不包含靶標(biāo)DNA的樣品液滴
[0050]103包含靶標(biāo)DNA的樣品液滴[0051 ] 104熒光檢測(cè)信號(hào)
[0052] 105信號(hào)檢測(cè)閾值
[0053]106 第二閾值
[0054]201傳感芯片
[0055]202混合溶液生成單元
[0056]203 一支流路
[0057]204 DNA擴(kuò)增單元
[0058]205光波導(dǎo)單元
[0059]206 光源
[0060]207光檢測(cè)單元[0061 ]301 DNA 合成酶
[0062]302 DNA樣品
[0063]303包含第I熒光探針和第I引物的溶液
[0064]304包含第2熒光探針和第2引物的溶液
[0065]305混合溶液
[0066]306 閥
[0067]307 閥
[0068]401混合溶液輸入流路
[0069]402油材料輸入流路
[0070]403混合溶液[0071 ]404油材料
[0072]405樣品液滴
[0073]501 DNA擴(kuò)增腔室
[0074]502樣品液滴
[0075]503輸入流路
[0076]504 閥
[0077]505 閥
[0078]506輸出流路
[0079]507分開(kāi)DNA擴(kuò)增腔室與周圍部件的缺口
[0080]601 Si 基板[0081 ]602 玻璃
[0082]603 流路
[0083]604 液滴
[0084]605激光器
[0085]606準(zhǔn)直透鏡
[0086]607 二向色鏡
[0087]608 物鏡
[0088]609濾光器
[0089]610 鏡頭
[0090]611 針孔
[0091]612 PMT(光電倍增管)
[0092]901混合溶液
[0093]902油材料
[0094]903 閥
[0095]904油材料
[0096]905 閥
[0097]906油材料
[0098]907 閥
[0099]908樣品液滴
[0100]1001 單鏈 DNA
[0101]1002 單鏈DNA
[0102]1003正向引物
[0103]1004反向引物
[0104]1005 探針
[0105]1006熒光色素
[0106]1007 消光劑
【具體實(shí)施方式】
[0107]首先，關(guān)于基因的檢查方法進(jìn)行說(shuō)明?；蚴浅袚?dān)生物的遺傳信息的主要因子，在所有生物中以DNA/RNA(核酸)作為媒介，由其堿基序列編碼。近年，由于診斷基因的技術(shù)進(jìn)步，基因的多樣性分析、表達(dá)分析的進(jìn)展驚人。特別是在醫(yī)療領(lǐng)域，基因信息與疾患的關(guān)系受到關(guān)注。例如，已經(jīng)可以通過(guò)分析與疾患相關(guān)的各個(gè)基因信息(特定部位的DNA/RNA的堿基序列)，來(lái)進(jìn)行適合每個(gè)患者的治療、給藥(訂制醫(yī)療)。在訂制醫(yī)療中，最期望當(dāng)場(chǎng)診斷，要求POCT(床旁檢測(cè)，現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，Point of Care Testing)性高、迅速、簡(jiǎn)便的方法。因此，強(qiáng)烈要求實(shí)現(xiàn)能夠從血液等采集樣本中提取、擴(kuò)增分析對(duì)象基因的DNA、RNA，迅速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)其堿基序列信息或者其量的器件。
[0108]作為適應(yīng)這些需求的單元之一，近年來(lái)，稱為yTAS(微型全分析系統(tǒng)，yTotalAnalysis Systems)或LoC(芯片實(shí)驗(yàn)室，Lab on Chip)的器件受到關(guān)注。yTAS或LoC是在基板內(nèi)設(shè)有由微米極的微細(xì)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的微流路、端口，在其結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)的混合、提取、純化、化學(xué)反應(yīng)和分析等各種操作的器件，一部分已經(jīng)實(shí)用化。這樣的器件由于各種操作在微細(xì)結(jié)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行，與所謂專門(mén)的研究所、分析機(jī)關(guān)等中使用的常用尺寸的同種裝置相比，具有樣品、試劑的使用量顯著少，分析時(shí)間也短，靈敏度也高等特長(zhǎng)。另外還能夠?qū)崿F(xiàn)小型的器件構(gòu)成，不僅能在專門(mén)的研究所使用，還能夠攜帶到現(xiàn)場(chǎng)實(shí)現(xiàn)當(dāng)場(chǎng)分析。為了這樣的目的而制作的、基板內(nèi)具有微流路和端口等微細(xì)結(jié)構(gòu)、安裝了各種功能的結(jié)構(gòu)物，總稱為微流路芯片(傳感芯片)或微流體器件。
[0109]為了使用微流路芯片在短時(shí)間內(nèi)分析樣本中的基因，期望在芯片內(nèi)整合基因的DNA/RNA的提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的功能。特別是為了在短時(shí)間內(nèi)獲得更多的?目息，要求在同一芯片內(nèi)一次檢測(cè)多個(gè)樣本，或者擴(kuò)增、檢測(cè)每一樣本的多個(gè)部位的DNA/RNA(多元擴(kuò)增和檢測(cè))。另外，根據(jù)用途不同，還要求分析(定量分析)所希望的基因的量。
[0110]以下，對(duì)于本公開(kāi)的實(shí)施方式所涉及的傳感芯片和DNA檢測(cè)裝置，參照附圖進(jìn)行說(shuō)明。
[0111](實(shí)施方式I)
[0112]對(duì)于實(shí)施方式I所涉及的傳感芯片201和DNA檢測(cè)裝置210，參照?qǐng)D進(jìn)行說(shuō)明。圖2是顯示實(shí)施方式I所涉及的傳感芯片201和DNA檢測(cè)裝置210的構(gòu)成的方框圖。
[0113]<傳感芯片>
[0114]對(duì)于傳感芯片201進(jìn)行說(shuō)明。傳感芯片201是具有形成了凹部的表面的基板?；宓牟牧侠缈梢允枪璧?。凹部相當(dāng)于流路(溝)。例如，流路具有數(shù)百微米極的寬度和深度。通過(guò)該流路，連接混合溶液生成單元202、生成樣品液滴的一支流路203、DNA擴(kuò)增單元204和光波導(dǎo)單元205。以下，對(duì)于構(gòu)成傳感芯片201的各構(gòu)成要素進(jìn)行說(shuō)明。
[0115]<混合溶液生成單元>
[0116]圖3是顯示混合溶液生成單元202的構(gòu)成的一例的概略圖。圖3所示的混合溶液生成單元202由多個(gè)流路構(gòu)成。傳感芯片201的流路與流路的結(jié)合部設(shè)有閥306、307。
[0117]圖3所示的混合溶液生成單元202具有第I流路311、第2流路312、第3流路313、第4流路314、第5流路315和第6流路316。第I流路311流淌DNA合成酶301。第2流路312流淌包含DNA的樣品302。第3流路313流淌DNA合成酶301與包含DNA的樣品302混合而成的DNA混合液。第4流路314流淌第I熒光探針303和第I引物303。第5流路315流淌第2熒光探針304和第2引物304。第6流路316流淌DNA混合液與第I熒光探針303以及第I引物303混合而成的混合液、或DNA混合液與第2熒光探針304以及第2引物304混合而成的混合液。第I流路311、第2流路312、第4流路314和第5流路315分別可以具有用于導(dǎo)入DNA合成酶301、包含DNA的樣品302、第I熒光探針303以及第I引物303、第2熒光探針304以及第2引物304的栗。在如圖3所示包含
2種材料的情況下，以各個(gè)液體不混合的方式依次供給至流路。在圖3中，將第I熒光探針303和第I引物303供給至流路時(shí)，通過(guò)關(guān)閉供給第2熒光探針304和第2引物304的流路的閥307，從而使第2熒光探針304和第2引物304不混合。
[0118]另外，將第2熒光探針304和第2引物304供給流路時(shí)，通過(guò)關(guān)閉閥306、打開(kāi)閥307，第I熒光探針和第I引物不被供給到流路內(nèi)。這樣，在使用多個(gè)種類的熒光探針和引物的情況下，根據(jù)各種類形成流路，各流路與第3流路隔著閥連接。通過(guò)控制使得各流路與第3流路之間的各閥中的僅任意I個(gè)閥打開(kāi)，從而使得不同的種類的多種熒光探針與引物不混合。此夕卜，雖然顯示了圖3那樣的構(gòu)成，但只要能夠使各液體與每種熒光探針、引物分別混合，則即使是其他流路構(gòu)成，也對(duì)本公開(kāi)的效果也沒(méi)有任何影響。例如，也可以使供給第I熒光探針和第I引物303的流路、以及供給第2熒光探針和第2引物304的流路，與流淌包含DNA的樣品302的流路彼此相對(duì)地設(shè)置。
[0119]<生成樣品液滴的一支流路>
[0120]圖4是顯示生成樣品液滴的一支流路的構(gòu)成的一例的概略圖。作為一例，如圖4所示，用于由混合溶液生成單元203生成的混合溶液403流淌的第6流路401、與用于油材料404流淌的第7流路402結(jié)合成T型，合流成一支第8流路?；旌先芤?03與油材料404在T型部分合流，由于它們彼此不混合，因而在一支流路(第8流路)內(nèi)形成被油材料404撕碎的混合溶液的小液滴405。如果混合溶液的每單位時(shí)間的流量和油材料的每單位時(shí)間的流量穩(wěn)定，則大致相同的大小的液滴連續(xù)地形成。第7流路402中能夠配置導(dǎo)入油材料的栗。
[0121]例如，利用位于第I流路311、第2流路312、第4流路314、第5流路315和第7流路402的栗，對(duì)各流路導(dǎo)入每單位時(shí)間的規(guī)定流量，從而形成規(guī)定的大小的液滴。
[0122]這里說(shuō)明了如圖4那樣結(jié)合成T型的流路，但形狀不限于此，油材料從混合溶液的供給用流路的兩側(cè)合流的構(gòu)成等也可以是別的構(gòu)成。即，只要是通過(guò)混合溶液與油材料碰撞而能形成混合溶液的液滴，則即使是別的流路構(gòu)成，也不影響效果。
[0123]<DNA擴(kuò)增單元>
[0124]圖5是顯示DNA擴(kuò)增單元204的構(gòu)成的一例的概略圖。DNA擴(kuò)增單元204包含收容液滴的腔室501。腔室501的入口 503通過(guò)閥504開(kāi)閉，腔室501的出口 506通過(guò)閥505開(kāi)閉。導(dǎo)入液滴時(shí)，將入口 503和出口 506均打開(kāi)，腔室501的內(nèi)部被液滴充滿后，通過(guò)閥504和閥505關(guān)閉入口 503和出口 506。在腔室501內(nèi)，進(jìn)行稱為PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的DNA擴(kuò)增處理。也將該處理表述為PCR處理。DNA擴(kuò)增單元204的一例是腔室和加熱器。腔室501位于第8流路和第9流路之間。DNA擴(kuò)增單元204也表述為PCR處理部。
[0125]圖1OA?C是顯示使用了稱為T(mén)aqMan探針的熒光探針的PCR的各過(guò)程的概略圖。
[0126]如圖1OA所示，DNA具有互補(bǔ)地排列的堿基序列的雙鏈結(jié)構(gòu)(1001、1002結(jié)合的狀態(tài))。該DNA如果加熱到某溫度，則該雙鏈解離，變成單鏈DNA( 10U1002)。對(duì)于包含該單鏈DNA的樣品，例如在單鏈DNA1001是成為靶標(biāo)的DNA的情況下，使其與具有靶標(biāo)DNA1001的序列鏈的第一區(qū)域的互補(bǔ)序列的引物(1003)、和包含相同的靶標(biāo)DNA的序列鏈的第二區(qū)域的互補(bǔ)序列的熒光探針(用熒光色素標(biāo)記的寡核苷酸、1005)接觸，調(diào)整到生成雜交的條件，則引物1003、熒光探針1005與靶標(biāo)DNA1001形成雙鏈復(fù)合體。另外，不是靶標(biāo)DNA的單鏈DNA1002也與對(duì)應(yīng)的引物1004結(jié)合。但是由于不是靶標(biāo)DNA，所以不結(jié)合熒光探針。
[0127]如圖1OB所示，然后，調(diào)整到形成5，—3，核酸酶活性的條件，則DNA合成酶開(kāi)始工作，以與單鏈DNA1001和1002結(jié)合的引物1003和1004作為基準(zhǔn)開(kāi)始DNA延伸。
[0128]如圖1OC所示，如果DNA延伸進(jìn)行，則結(jié)合于靶標(biāo)DNA1001的熒光探針1005游離。熒光探針1005所含的熒光色素1006與消光劑1007在游離前存在于接近的區(qū)域，因而熒光色素不發(fā)光，但是因?yàn)镈NA延伸而熒光探針游離，熒光色素1006與消光劑1007分離，所以熒光顯色。
[0129]通過(guò)這一系列循環(huán)，針對(duì)一條靶標(biāo)DNA，一個(gè)熒光色素發(fā)光。另外，通過(guò)DNA延伸，單鏈DNA分別變成雙鏈DNA，因而DNA被擴(kuò)增至2倍。即，通過(guò)重復(fù)該過(guò)程，根據(jù)重復(fù)次數(shù)，DNA的數(shù)被擴(kuò)增2的乘方倍，另外同樣地?zé)晒馍氐挠坞x也發(fā)生2的乘方倍。通過(guò)重復(fù)該過(guò)程，熒光強(qiáng)度不斷變強(qiáng)。
[0130]雖然根據(jù)引物、熒光探針的種類不同而條件不同，但為了使雙鏈DNA分離成單鏈DNA，多設(shè)定為90度前后的溫度，為了使引物、熒光探針雜交，多設(shè)定為60度前后的溫度，為了形成核酸酶活性使DNA合成酶工作、使DNA延伸，多設(shè)定為70度前后的溫度。即，利用PCR的DNA的擴(kuò)增處理通過(guò)這樣重復(fù)加熱和冷卻的溫度循環(huán)來(lái)進(jìn)行。作為DNA擴(kuò)增單元204，由于需要高速地重復(fù)該溫度循環(huán)，因而在使用像Si基板的那樣導(dǎo)熱率良好的材料作為基板的情況下，需要進(jìn)行例如將腔室區(qū)域與周圍的Si部件分離等的放熱抑制。在實(shí)施方式(I)中，也在形成于圖5的Si基板的DNA擴(kuò)增單元204的腔室501的周圍通過(guò)蝕刻等方法設(shè)有間隙(缺口)507。通過(guò)該構(gòu)成，使加熱腔室的熱不擴(kuò)散到周圍，能實(shí)現(xiàn)非常高速的溫度循環(huán)。
[0131]<DNA檢測(cè)裝置>
[0132]接下來(lái)，對(duì)于DNA檢測(cè)裝置210進(jìn)行說(shuō)明。DNA檢測(cè)裝置210具備檢測(cè)來(lái)自樣品液滴的熒光的熒光檢測(cè)單元207，和基于檢測(cè)到的熒光的連續(xù)時(shí)間判定樣品液滴所含的熒光探針?biāo)芤旱姆N類、基于相對(duì)于焚光的閾值的大小關(guān)系判定成為檢測(cè)對(duì)象的DNA的有無(wú)的DNA檢測(cè)單元208。此外，還可以進(jìn)一步具備用于熒光檢測(cè)的激發(fā)用光源206。圖6是顯示包含傳感芯片的光波導(dǎo)單元的部位和DNA檢測(cè)裝置210的檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成的一例的概略圖。以下，對(duì)于包含傳感芯片的光波導(dǎo)單元的部位和DNA檢測(cè)裝置210的檢測(cè)光學(xué)系統(tǒng)的各構(gòu)成要素進(jìn)行說(shuō)明。
[0133]<傳感芯片的光波導(dǎo)單元>
[0134]傳感芯片是通過(guò)在Si基板601上形成數(shù)百μπι的長(zhǎng)度的溝、在其上通過(guò)陽(yáng)極接合等方法貼合玻璃板602而構(gòu)成的。通過(guò)貼合玻璃板602，溝形成液滴流淌的流路603。在流路603內(nèi)，DNA擴(kuò)增處理后的液滴604排成一列連續(xù)且以規(guī)定的一定的速度流過(guò)。對(duì)液滴604照射激發(fā)熒光色素的光，另外，需要將由此而發(fā)光的熒光通過(guò)熒光檢測(cè)單元取出，在該構(gòu)成的芯片中通過(guò)玻璃面進(jìn)行光的輸入輸出。在該構(gòu)成中，從該玻璃面到液滴流淌的流路的光學(xué)路徑相當(dāng)于光波導(dǎo)單元。
[0135]< 光源 >
[0136]為了有效地激發(fā)熒光色素，光源使用色素的吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng)附近的波長(zhǎng)的激光器或LED等。特別是作為光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)選盡量小型且高輸出，作為光源優(yōu)選半導(dǎo)體激光器等。在實(shí)施方式I中，使用波長(zhǎng)490nm的半導(dǎo)體激光器605。從半導(dǎo)體激光器605發(fā)射出的激光通過(guò)準(zhǔn)直透鏡606變成平行光，被二向色鏡607反射。
[0137]<熒光檢測(cè)單元>
[0138]二向色鏡是能夠根據(jù)波長(zhǎng)選擇反射、透射的鏡頭，在實(shí)施方式I中，使用例如截止波長(zhǎng)505nm的二向色鏡。該二向色鏡反射波長(zhǎng)短于505nm的光，透射波長(zhǎng)長(zhǎng)于505nm的光。反射的激光通過(guò)物鏡608而被集光到流路603中的液滴通過(guò)位置。包含靶標(biāo)DNA的液滴形成大量的熒光色素在液滴中游離的狀態(tài)，因而通過(guò)該激光器照射而熒光色素被激發(fā)，從而發(fā)出熒光。將從液滴604發(fā)出的熒光中的一部分通過(guò)物鏡608而取出到熒光檢測(cè)器側(cè)。
[0139]物鏡608需要盡量高效地收進(jìn)熒光，因而優(yōu)選開(kāi)口數(shù)(NA)大的鏡頭。在實(shí)施方式I中，使用例如ΝΑ0.85的物鏡。透射過(guò)物鏡608的熒光透射二向色鏡607。然后，通過(guò)透射熒光波長(zhǎng)的光的濾光器609，除去除熒光以外的光(例如激發(fā)光的漏入、從其他材料發(fā)出的熒光等)后，通過(guò)鏡頭610集光到熒光檢測(cè)器。通過(guò)在由鏡頭610集光的點(diǎn)設(shè)置聚集的光正好透射的尺寸的針孔611，能夠從聚集在傳感芯片的激光中截掉從焦點(diǎn)以外的區(qū)域反射來(lái)的雜散光成分。并且，僅透射了針孔的焚光被輸入焚光檢測(cè)器612。
[0140]熒光檢測(cè)器612需要高靈敏度且高速地檢測(cè)大小為激發(fā)光的I萬(wàn)分之一到10萬(wàn)分之一左右的熒光，因而使用光電倍增管(PMT)、雪崩光電二極管(APD)、光電二極管(PD)等高靈敏度檢測(cè)器。特別優(yōu)選靈敏度好、應(yīng)答速度快的PMT。在實(shí)施方式I中使用例如電流輸出型PMTο在本說(shuō)明書(shū)中，透過(guò)了在第9流路流淌的樣品液滴的透射光，包含通過(guò)在第9流路中流淌的樣品液滴的內(nèi)部而反射的光。
[0141]<DNA檢測(cè)單元>
[0142]DNA檢測(cè)單元208在檢測(cè)到的熒光的連續(xù)時(shí)間為規(guī)定值的情況下，判定樣品液滴所含的熒光探針?biāo)芤旱姆N類。熒光的連續(xù)時(shí)間是連續(xù)檢測(cè)到具有閾值以上的強(qiáng)度的熒光的時(shí)間。
[0143]更具體地，DNA檢測(cè)單元208基于透射光、油的流量和混合溶液的流量來(lái)檢測(cè)DNA溶液中是否包含檢測(cè)對(duì)象DNA ο油的流量和混合溶液的流量對(duì)應(yīng)于樣品液滴在第9流路中流淌的時(shí)間。于是，DNA檢測(cè)單元208參照混合溶液的流量與連續(xù)時(shí)間的對(duì)應(yīng)基準(zhǔn)，來(lái)確定與檢測(cè)到的連續(xù)時(shí)間對(duì)應(yīng)的混合溶液的流量。檢測(cè)樣品液滴中是否包含所確定的混合溶液所含的熒光探針劑的檢測(cè)對(duì)象DNA13DNA檢測(cè)單元208通過(guò)具備例如CPU、內(nèi)存、記憶裝置、輸入輸出部、顯示部、接口等的計(jì)算機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0144]能夠用包含以上各組件的傳感芯片和DNA檢測(cè)裝置進(jìn)行DNA檢測(cè)。在實(shí)施方式I中，基于檢查2種靶標(biāo)DNA的傳感芯片進(jìn)行具體說(shuō)明。
[0145]檢查2種靶標(biāo)DNA，是指成為靶標(biāo)的堿基序列有2個(gè)部位。因此，分別準(zhǔn)備與各個(gè)堿基序列互補(bǔ)結(jié)合的熒光探針。熒光探針可以人工地構(gòu)成所希望的堿基序列。各個(gè)熒光探針中在其末端修飾了熒光色素和消光劑。在實(shí)施方式I中，人工地構(gòu)成與2種靶標(biāo)DNA對(duì)應(yīng)的2種熒光探針，但修飾的熒光色素兩者均使用相同的熒光色素。即雖然熒光探針的堿基序列分別不同，但所修飾的熒光色素全部相同。在實(shí)施方式I中，作為熒光色素，使用激發(fā)波長(zhǎng)495nm、熒光波長(zhǎng)520nm的稱為熒光素的色素。將與革El標(biāo)DNA中的一種對(duì)應(yīng)的熒光探針和引物稱為第I熒光探針和第I引物，將與另一種靶標(biāo)DNA對(duì)應(yīng)的熒光探針和引物稱為第2熒光探針和第2引物。
[0146]如圖3所示，混合溶液生成單元中，使稀釋的DNA樣品302與DNA合成酶301在流路中混合后，打開(kāi)閥306，在流路中混合第I熒光探針和第I引物。此期間，閥307保持關(guān)閉，第2熒光探針和第2引物不與DNA樣品混合。在此狀態(tài)下，包含第I熒光探針和第I引物的混合溶液305被送入接下來(lái)的生成樣品液滴的一支流路中，生成液滴。此時(shí)，如果使送出各液體的栗的流量一定，并使送出的混合溶液305的流量一定，則在生成樣品液滴的一支流路中生成的液滴的尺寸也以大致相同的大小形成。在這種狀態(tài)下，在以一定的大小(一定的體積)生成了包含第I熒光探針和第I引物的液滴之后，通過(guò)關(guān)閉閥306、接著打開(kāi)閥307，從而使稀釋的DNA樣品、DNA合成酶、與第2熒光探針和第2引物在流路中混合，將包含第2熒光探針和第2引物的混合溶液305送出到接下來(lái)的生成樣品液滴的一支流路中。通過(guò)改變送出第I熒光探針和第I引物的流量、與送出第2熒光探針和第2引物的流量，從而從該混合溶液生成單元輸出的混合溶液305的流量，在第I熒光探針和第I引物、與第2熒光探針和第2引物之間是不同的。使送出第I熒光探針和第I引物的流量、與送出第2熒光探針和第2引物的流量不同，例如，可以通過(guò)改變用于送出它們的栗的壓力來(lái)進(jìn)行，或者也可以如圖3所示那樣改變送出第I熒光探針和第I引物的流路的寬度、深度、截面積，和送出第2熒光探針和第2引物的流路的寬度、深度、截面積，使得即使栗的壓力相同，送出的流量也不同。
[0147]圖7是顯示使油流量變化時(shí)液滴尺寸相對(duì)于混合溶液的流量與油材料的流量的比的關(guān)系的圖。該圖是如下獲得的:實(shí)驗(yàn)上使油材料的流量分別固定為50、75、100nL/min的流量，僅使第I熒光探針和第I引物的供給線有效，使對(duì)第I熒光探針和第I引物進(jìn)行送液的栗的流量階段性地變化，從而獲得。橫軸表示油材料流量/混合溶液流量的流量比，縱軸表示生成的液滴中各自約1000個(gè)液滴的體積的平均值。隨著油材料與混合溶液的流量比變大，生成的液滴的體積變小。由本結(jié)果確認(rèn)了，在實(shí)施方式I中的傳感芯片中，在油流量50?lOOnL/min的范圍生成體積0.1?2.2nL的液滴。另外，確認(rèn)了通過(guò)使油流量、混合溶液流量、及其流量比變化，能夠生成范圍內(nèi)的任意體積的液滴。
[0148]圖8是使油材料流量/混合溶液流量的流量比變化的情況下生成的樣品液滴的體積的分布圖。在圖8中，是顯示了通過(guò)與上述同樣的方法將油材料的流量固定在100nL/min，僅使第I熒光探針和第I引物的供給線有效，使混合溶液的流量變?yōu)?5、100、125nL/min的情況下的液滴的體積的分布的顯示液滴體積與液滴個(gè)數(shù)的關(guān)系的分布圖。在上述各條件下分別依次生成約5000個(gè)液滴。在混合溶液的流量75nL/min(流量比1.3)的條件下，是液滴體積平均值0.3nL、最大體積0.33nL、最小0.26nL、偏差(作為標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，計(jì)算± 3σ)為±0.03nL這樣的結(jié)果。另外，在混合溶液的流量100nL/min(流量比1.0)的條件下，是液滴體積平均值
0.38nL、最大體積0.42nL、最小體積0.34nL、偏差為土 0.04nL這樣的結(jié)果。另外，在混合溶液的流量125nL(流量比0.8)的條件下，是液滴體積平均值0.48nL、最大體積0.52nL、最小體積
0.42nL、偏差為±0.05nL這樣的結(jié)果。在本次的結(jié)果中，最小的液滴群的體積平均值0.3nL與第2小的液滴群的體積平均值0.38nL的體積比為1.26，第2小的液滴群的體積平均值0.38nL與第3小的液滴群的體積平均值0.48nL的體積比為1.26。如果這樣使油材料與混合溶液的流量比變化，使各條件下的液滴體積的平均值從小的開(kāi)始依次大各25%以上地形成，則如圖8所示，各個(gè)液滴群的大小分布明確分離地分布，從而能夠根據(jù)其液滴群的大小差異來(lái)識(shí)別每個(gè)不同條件下的液滴群。
[0149]<DNA檢測(cè)方法>
[0150]接著，對(duì)于使用第I熒光探針和第I引物、第2熒光探針和第2引物來(lái)檢測(cè)2種靶標(biāo)DNA的方法進(jìn)行說(shuō)明。
[0151]<混合溶液生成工序>
[0152]混合溶液生成單元如圖3所示，分別設(shè)有供給第I熒光探針和第I引物的流路、供給第2熒光探針和第2引物的流路，在各個(gè)流路的出口設(shè)有閥，從而能夠?qū)⒌贗熒光探針和第I引物、第2熒光探針和第2引物分別供給。另外，供給第I熒光探針和第I引物的流路、和供給第2熒光探針和第2引物的流路在深度上兩者均為相同的30μπι的深度，但在寬度上設(shè)計(jì)為兩者不同，第I熒光探針的流路為ΙΟΟμπι，第2熒光探針的流路為120μπι。關(guān)于用于對(duì)各熒光探針進(jìn)行送液的栗的壓力，使用相同的壓力的栗，混合溶液生成單元的輸出中的流量根據(jù)供給該熒光探針的流路的寬度不同而變化。另外，這里通過(guò)不改變流路的寬度而改變深度也能得到相同的效果。只要改變流路的截面積，就不影響實(shí)施方式I中的效果。
[0153]<樣品液滴生成工序>
[0154]第一，打開(kāi)圖3的閥306，使DNA合成酶301、DNA樣品302與第I熒光探針和第I引物303在流路中混合，將生成的混合溶液305向接下來(lái)的生成樣品液滴的一支流路中進(jìn)行送液。此時(shí)，混合溶液生成單元的出口的流量例如為約100nL/min。將該混合溶液305送液至圖4所示的生成樣品液滴的一支流路的輸入流路401。圖4的油材料402的供給流路中的油材料的流量設(shè)定為約100nL/min。此時(shí)，在與生成樣品液滴的一支流路的T型結(jié)合的流路部分，混合溶液與油材料合流，如圖4所示，被油材料分離的混合溶液的液滴依次生成?；旌先芤核腄NA樣品被較大地稀釋，進(jìn)行調(diào)整使得DNA以一分子以下的數(shù)量進(jìn)入到此時(shí)生成的液滴中。在該條件下，生成的液滴的體積平均為0.38nL。然后，該液滴被送到接下來(lái)的DNA擴(kuò)增單
J L ο
[0155]接著，關(guān)閉圖3的閥306、打開(kāi)閥307，使DNA合成酶、DNA樣品與第2熒光探針和第2引物在流路中混合，將生成的混合溶液送液到接下來(lái)的生成樣品液滴的一支流路中。此時(shí)，混合溶液生成單元的出口的流量為約125nL/min。這是因?yàn)?，供給第2熒光探針和第2引物的流路的寬度相對(duì)于供給第I熒光探針和第I引物的流路的寬度較寬地形成，流路的截面積變大。該混合溶液被送液到圖4所示的生成樣品液滴的一支流路的輸入路徑401。圖4的油材料402的輸入流路中的油材料的流量設(shè)定為與之前相同的約100nL/min。此時(shí)，在與生成樣品液滴的一支流路T型結(jié)合的流路部分，混合溶液與油材料合流，如圖4所示，被油材料分離的混合溶液的液滴依次生成?；旌先芤核腄NA樣品被較大地稀釋，進(jìn)行調(diào)整使得DNA以一分子以下的數(shù)量進(jìn)入此時(shí)生成的液滴中。在該條件下，生成的液滴的體積平均為0.48nL。然后，該液滴被送到接下來(lái)的DNA擴(kuò)增單元。
[0156]<DNA擴(kuò)增工序>
[0157]分別依次生成的包含第I熒光探針的液滴、和包含第2熒光探針的液滴被送到如圖5所示的DNA擴(kuò)增單元，以密集的形式充滿DNA擴(kuò)增腔室內(nèi)。在圖5中較少地畫(huà)出了DNA腔室內(nèi)的液滴的數(shù)量，但在本實(shí)施方式I中，分別生成了包含第I熒光探針的液滴約5000個(gè)，包含第2熒光探針的液滴約5000個(gè)，共計(jì)約10000個(gè)液滴充滿了 DNA擴(kuò)增腔室內(nèi)。另外，混合溶液內(nèi)或者油材料內(nèi)包含表面活性劑，這樣即使在液滴在腔室內(nèi)密集的狀態(tài)下，另外即使實(shí)施DNA擴(kuò)增處理中的溫度循環(huán)，液滴彼此也不會(huì)結(jié)合。如果生成了規(guī)定的數(shù)目的液滴，DNA擴(kuò)增腔室內(nèi)被液滴充滿，則將DNA擴(kuò)增單元的入口、出口的閥兩者均關(guān)閉，進(jìn)行DNA擴(kuò)增處理。
[0158]DNA擴(kuò)增處理進(jìn)行了圖1OA?C所說(shuō)明的使用熒光探針和引物的處理。在實(shí)施方式I中，熒光探針和引物使用與各靶標(biāo)DNA對(duì)應(yīng)的2種材料。但是，各熒光探針中使用的熒光色素使用相同的材料制作。這里，如之前所說(shuō)明的那樣使用了稱為熒光素的熒光色素。DNA擴(kuò)增處理通過(guò)重復(fù)溫度循環(huán)來(lái)進(jìn)行將雙鏈DNA分離成單鏈DNA的工序、使熒光探針和引物雜交的工序、以及以引物為起點(diǎn)進(jìn)行DNA延伸的工序。在本實(shí)施方式I中，在液滴充滿DNA擴(kuò)增單元之后，在95 0C的溫度下將腔室全體加熱約5分鐘，然后以95°C下10秒、65 °C下10秒、75 °C下10秒的溫度變化為I個(gè)循環(huán)，將該循環(huán)重復(fù)40次。通過(guò)該DNA擴(kuò)增處理工序，在包含靶標(biāo)DNA的液滴中，對(duì)應(yīng)的熒光探針和引物與靶標(biāo)DNA反應(yīng)，DNA被擴(kuò)增，熒光色素根據(jù)其擴(kuò)增次數(shù)而游離到液滴中。如果將溫度循環(huán)重復(fù)40次，則液滴中的I個(gè)DNA被擴(kuò)增到2的40次方個(gè)，熒光色素也以其擴(kuò)增個(gè)數(shù)而游離出來(lái)。在不包含靶標(biāo)DNA的液滴中，由于不包含靶標(biāo)DNA，因而熒光探針不結(jié)合，當(dāng)然熒光色素也不游離。此外，這里所示的溫度循環(huán)條件等根據(jù)熒光探針的種類、引物的種類不同而最適條件不同，因而優(yōu)選設(shè)定為適合其材料的溫度條件。在本實(shí)施方式I中，在上述條件下進(jìn)行DNA擴(kuò)增處理，但即使在與此不同的溫度條件下，只要在包含靶標(biāo)DNA的液滴中正常進(jìn)行DNA擴(kuò)增，根據(jù)DNA擴(kuò)增而發(fā)出熒光的材料的功能有效，則即使是其他方法也不影響其效果。另外，溫度循環(huán)設(shè)定為40次，但只要是后面的熒光檢測(cè)時(shí)能得到充分的熒光強(qiáng)度的條件，則并不必須是40次。由于根據(jù)熒光探針、引物的材料不同最適值不同，因而只要DNA擴(kuò)增到能得到充分的熒光強(qiáng)度，則即使是其他循環(huán)次數(shù)也沒(méi)有特別問(wèn)題。
[0159]<光照射工序和熒光檢測(cè)工序>
[0160]DNA擴(kuò)增處理后的液滴被導(dǎo)入接下來(lái)的光波導(dǎo)單元中。在本實(shí)施方式I中，構(gòu)成了在Si基板挖出的寬度50μπι、深度30μπι的溝上貼合厚500μπι的玻璃板的結(jié)構(gòu)的光波導(dǎo)單元。在該流路中，在DNA擴(kuò)增單元中受到DNA擴(kuò)增處理的液滴一個(gè)一個(gè)地排成一列被送液。此時(shí)的送液率在用熒光檢測(cè)單元計(jì)數(shù)流過(guò)的液滴的數(shù)量期間總是保持一定。使用圖6所示的光學(xué)系統(tǒng)來(lái)對(duì)液滴的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0161]為了激發(fā)本次使用的熒光色素即熒光素，激光器使用490nm的半導(dǎo)體激光器，作為熒光檢測(cè)器使用高靈敏度且具有高速應(yīng)答性的電流輸出型的PMT(光電倍增管)。另外關(guān)于物鏡，為了高效地收入更多的熒光，使用NA(開(kāi)口數(shù))0.85的石英物鏡。
[0162]<DNA檢測(cè)工序>
[0163]圖1的(a)是顯示在光波導(dǎo)單元的流路101中流過(guò)的液滴102、103的樣子的概略圖。圖1的(b)是顯示對(duì)于在圖1的(a)的光波導(dǎo)單元的流路101中流過(guò)的液滴102、103用PMT檢測(cè)的光信號(hào)的樣子的圖。如圖1的(a)所示，在光波導(dǎo)單元的流路101中，液滴102、103—個(gè)一個(gè)地依次流過(guò)。在實(shí)施方式I中，使用2種熒光探針，生成各自不同的體積的液滴，因此4個(gè)圖形的液滴在流路中流過(guò)。它們是熒光色素游離了的、包含第I熒光探針的平均體積0.38nL的小液滴，熒光色素未游離、且包含第2熒光探針的平均體積0.48nL的大液滴，熒光色素游離了的液滴，以及熒光色素未游離的液滴的4種。
[0164]使用圖6所示的光學(xué)系統(tǒng)，利用物鏡608使激光通過(guò)玻璃板602聚集到流路中的一點(diǎn)。在本實(shí)施方式I的光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成中，焦點(diǎn)位置的射束直徑為約0.7μπι。由于液滴在流路中以一定速度流過(guò)，因而激光分別地照射流過(guò)的一個(gè)一個(gè)液滴，逐個(gè)用PMT檢測(cè)信號(hào)。如圖1的(a)那樣液滴在流路中流過(guò)時(shí)，用PMT檢測(cè)到如圖1的(b)那樣的信號(hào)。包含靶標(biāo)DNA的液滴通過(guò)激光器照射而顯色熒光，因而用PMT所檢測(cè)的信號(hào)的強(qiáng)度也變強(qiáng)。另外，不包含靶標(biāo)DNA的液滴由于不發(fā)出熒光，因而用PMT檢測(cè)到非常弱的信號(hào)。將信號(hào)檢測(cè)閾值105設(shè)定為能夠檢測(cè)到不發(fā)出熒光的液滴的檢測(cè)信號(hào)的水平，獲得超過(guò)了該閾值的部分的信號(hào)強(qiáng)度最大值、和超過(guò)閾值的時(shí)間(將此稱為橫穿時(shí)間)。
[0165]包含第I熒光探針的液滴由于平均體積較小，為0.38nL，因而橫穿時(shí)間短，成為圖1
(b)中的A(秒)。另外，包含第2熒光探針的液滴由于平均體積較大，為0.48nL，因而橫穿時(shí)間比A長(zhǎng)，成為B(秒)。因此，即使使用相同的熒光色素，也能夠通過(guò)橫穿時(shí)間的差來(lái)判定2種靶標(biāo)DNA的區(qū)別。在本次的流路構(gòu)成和液滴的體積的情況下，液滴的體積差大致等于橫穿時(shí)間的差，因而橫穿時(shí)間B的平均值比橫穿時(shí)間A的平均值長(zhǎng)約25%。這樣在根據(jù)橫穿時(shí)間來(lái)區(qū)別是包含第I熒光探針的液滴還是包含第2熒光探針的液滴之后，對(duì)各個(gè)液滴的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0166]另外，根據(jù)包含第I熒光探針的液滴內(nèi)的橫穿時(shí)間中的信號(hào)強(qiáng)度最大值是位于閾值105與閾值106之間，還是大于閾值106的值，來(lái)判定液滴中是否包含靶標(biāo)DNA。另外，對(duì)于包含第2熒光探針的液滴也進(jìn)行同樣的判定。
[0167]然后，通過(guò)相對(duì)于包含第I熒光探針的液滴總數(shù)，調(diào)查值大于閾值106的液滴的數(shù)的比例，能夠定量地檢測(cè)原來(lái)的DNA樣品中的靶標(biāo)DNA的量。對(duì)包含第2熒光探針的液滴也進(jìn)行同樣的處理，通過(guò)相對(duì)于包含第2熒光探針的液滴總數(shù)，調(diào)查值大于閾值106的液滴的數(shù)的比例，能夠定量地檢測(cè)原來(lái)的DNA樣品中的勒標(biāo)DNA的量。此外，液滴中未必包含DNA，在DNA為I個(gè)或O個(gè)的任一條件下，為了求定量值，不能通過(guò)單純的除法來(lái)求。因此，定量值也可以按照泊松分布的思考方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0168]這樣在實(shí)施方式I中，即使靶標(biāo)DNA為2種、多種，也能夠使用相同的熒光色素進(jìn)行檢測(cè)，用于對(duì)液滴進(jìn)行計(jì)數(shù)的光學(xué)系統(tǒng)僅對(duì)應(yīng)于一個(gè)熒光波長(zhǎng)即可，光學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)成變得非常簡(jiǎn)單。即使在靶標(biāo)DNA的數(shù)量為3個(gè)以上的情況下，只要將與各個(gè)靶標(biāo)DNA對(duì)應(yīng)的液滴群的體積平均值分別改變各25%以上進(jìn)行設(shè)定，則能得到同樣的效果，能夠通過(guò)非常簡(jiǎn)易的光學(xué)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)的定量檢測(cè)。
[0169]另外，以上通過(guò)生成樣品液滴的一支流路，使油材料的流量一定，使混合溶液的流量變化，從而使每種熒光探針的液滴的大小變化，但是相反地使混合溶液的流量為一定，使油材料的流量變化，也可以改變液滴的大小。
[0170]無(wú)論是供給包含第I熒光探針和第I引物的混合溶液時(shí)，還是供給包含第2熒光探針和第2引物的混合溶液時(shí)，都設(shè)定流量使得混合溶液的流量一定。然后，使得供給包含第I熒光探針和第I引物的混合溶液時(shí)的油材料的流量、與供給包含第2熒光探針和第2引物的混合溶液時(shí)的油材料的流量不同。由此，使每種熒光探針的混合溶液與油材料的流量比不同，使生成樣品液滴的一支流路中生成的液滴的體積不同。圖11是顯示使混合溶液的流量變化時(shí)的混合溶液與油材料的流量比、和液滴體積的關(guān)系的圖。圖11顯示將混合溶液的流量固定為50、75、100nL/min的情況下使油材料的流量變化時(shí)的混合溶液與油材料的流量比、和生成的液滴的體積的關(guān)系。確認(rèn)了在測(cè)試條件下，在液滴群的體積平均值0.19nL?1.75nL的范圍內(nèi)可以任意調(diào)整液滴的體積。即使使油材料的流量變化，只要將每種熒光探針的液滴群的體積平均值改變各25%以上進(jìn)行設(shè)定，則即使在多種不同的熒光探針使用相同的熒光色素的情況下，也能夠根據(jù)橫穿時(shí)間的差來(lái)區(qū)別液滴群。
[0171]圖9是顯示生成樣品液滴的一支流路的構(gòu)成的變形例的概略圖。在生成樣品液滴的一支流路中設(shè)置多個(gè)油材料的供給流路，在各個(gè)出口設(shè)置閥，使其能夠分別地開(kāi)閉。例如，在包含第1熒光探針和第1引物的混合溶液流淌時(shí)，打開(kāi)全部的閥903、905、907，將混合溶液與油材料合流的部分的油材料的流量設(shè)定得較高。在包含第2熒光探針和第2引物的混合溶液流動(dòng)時(shí)，僅關(guān)閉閥907，使油材料的流量變小，則能夠使混合溶液與油材料的流量比不同，也能夠使生成的液滴的體積變化。這樣，只要調(diào)整油材料的流量使流量比變化，使生成的液滴的體積對(duì)于每種熒光探針變化25%以上，則能獲得效果。另外，這里使用了圖9那樣的流路構(gòu)成，但只要能夠使油材料的流量以規(guī)定的量變化，則不限于上述構(gòu)成。
[0172]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0? 73]本公開(kāi)所涉及的DNA檢測(cè)裝置是由血液等采集樣本對(duì)分析對(duì)象DNA的量進(jìn)行定量分析的微流路器件，特別在同時(shí)分析多個(gè)分析對(duì)象DNA的量時(shí)是有用的。根據(jù)本公開(kāi)，即使在同時(shí)分析多種DNA的情況下，也能夠以非常簡(jiǎn)單的構(gòu)成實(shí)現(xiàn)進(jìn)行熒光檢測(cè)的光學(xué)系統(tǒng)，因而作為能夠在訂制醫(yī)療的現(xiàn)場(chǎng)利用的迅速、簡(jiǎn)便的裝置是特別有用的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種DNA檢測(cè)方法，包括: (a)在DNA檢測(cè)裝置中設(shè)置傳感芯片， 所述DNA檢測(cè)裝置具備PCR處理部、熒光檢測(cè)部和DNA檢測(cè)部， 所述傳感芯片具備第I流路、第2流路、第3流路、第4流路、第5流路、第6流路、第7流路、第8流路和第9流路， 所述第I流路的一端以及所述第2流路的一端，與所述第3流路的一端連接， 所述第3流路的另一端與所述第6流路的一端連接， 所述第4流路以及所述第5流路，連接于所述第3流路的一端與另一端之間， 所述第6流路的另一端以及所述第7流路的一端，與所述第8流路的一端連接， 所述第8流路的另一端與所述PCR處理部連接， 所述PCR處理部與所述第9流路連接， (b)在所述第I流路和第2流路中分別導(dǎo)入DNA水溶液和DNA合成酶水溶液，從而使所述DNA水溶液和所述DNA合成酶水溶液的第I混合水溶液在所述第3流路中通過(guò)，所述DNA水溶液包含作為對(duì)象的單鏈DNA， (c)當(dāng)所述第I混合水溶液在所述第3流路中流淌時(shí)，對(duì)所述第4流路以第I流量導(dǎo)入第I熒光探針劑與第I引物混合而成的第I熒光探針?biāo)芤海瑥亩顾龅贗混合水溶液和所述第I熒光探針?biāo)芤旱牡?混合水溶液在所述第6流路中通過(guò)，所述第I熒光探針劑與第I單鏈DNA互補(bǔ)地結(jié)合， (d)對(duì)所述第7流路以第2流量導(dǎo)入油材料，從而使多個(gè)第2混合水溶液部和多個(gè)油材料部在所述第8流路中通過(guò)，所述多個(gè)第2混合水溶液部與所述多個(gè)油材料部沿著所述第8流路交互地排列， (e)當(dāng)所述第I混合水溶液在所述第3流路中流淌時(shí)，對(duì)所述第5流路以第3流量導(dǎo)入第2熒光探針劑與第2引物混合而成的第2熒光探針?biāo)芤?，從而使所述第I混合水溶液和所述第2熒光探針?biāo)芤旱牡?混合水溶液在所述第6流路中流淌，所述第2熒光探針劑與所述第I熒光探針劑不同，并且與第2單鏈DNA互補(bǔ)地結(jié)合， (f)對(duì)所述第7流路以第4流量導(dǎo)入所述油材料，從而使多個(gè)第3混合水溶液部和多個(gè)油材料部在所述第8流路中通過(guò)，所述多個(gè)第3混合水溶液部與所述多個(gè)油材料部沿著所述第8流路交互地排列， (g)通過(guò)所述PCR處理部，對(duì)所述多個(gè)第2混合水溶液部和所述多個(gè)第3混合水溶液部進(jìn)行PCR處理，使其在所述第9流路中通過(guò)， (h)通過(guò)所述熒光檢測(cè)部，對(duì)透過(guò)了在所述第9流路中流淌的所述多個(gè)第2混合水溶液部和所述多個(gè)第3混合水溶液部的透射光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)， (i)通過(guò)所述DNA檢測(cè)部，基于所述透射光的強(qiáng)度、所述第I流量、所述第2流量、所述第3流量和所述第4流量，檢測(cè)所述作為對(duì)象的單鏈DNA是否包含選自所述第I單鏈DNA和所述第2單鏈DNA中的至少I種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)方法， 在所述(i)中，所述DNA檢測(cè)部獲得在所述熒光檢測(cè)部連續(xù)檢測(cè)到第I閾值以上的光強(qiáng)度的連續(xù)時(shí)間，根據(jù)所述連續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)度是否是對(duì)應(yīng)于所述第I流量和第2流量的時(shí)間、或?qū)?yīng)于所述第3流量和第4流量的時(shí)間，檢測(cè)所述DNA溶液所含的所述作為對(duì)象的單鏈DNA中是否包含所述第I單鏈DNA或所述第2單鏈DNA。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA檢測(cè)方法， 在所述連續(xù)時(shí)間是對(duì)應(yīng)于所述第I流量和第2流量的時(shí)間的情況下，所述DNA檢測(cè)部檢測(cè)為所述作為對(duì)象的單鏈DNA中包含所述第I單鏈DNA， 在所述連續(xù)時(shí)間是對(duì)應(yīng)于所述第3流量和第4流量的時(shí)間的情況下，所述DNA檢測(cè)部檢測(cè)為所述作為對(duì)象的單鏈DNA中包含所述第2單鏈DNA。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA檢測(cè)方法， 對(duì)應(yīng)于所述第I流量和第2流量的時(shí)間，與所述第9流路中的所述多個(gè)第2混合水溶液部的流量相對(duì)應(yīng)， 對(duì)應(yīng)于所述第3流量和第4流量的時(shí)間，與所述第9流路中的所述多個(gè)第3混合水溶液部的流量相對(duì)應(yīng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)方法， 通過(guò)使所述第2流量與所述第4流量相同、并且所述第I流量與所述第3流量不同，從而使所述第2混合水溶液與所述第3混合水溶液的流量比分別對(duì)應(yīng)于所述第I熒光探針?biāo)芤汉退龅?熒光探針?biāo)芤憾鵀椴煌牧髁勘取?.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA檢測(cè)方法， 通過(guò)使所述第4流路的截面積與所述第5流路的截面積不同，從而使所述第I流量與所述第3流量不同。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)方法， 所述第2流量與所述第4流量不同。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)方法， 所述第I熒光探針?biāo)芤汉退龅?熒光探針?biāo)芤核臒晒馍厥秋@色同一波長(zhǎng)的熒光的熒光色素。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA檢測(cè)方法， 所述多個(gè)第2混合水溶液部的體積的平均值與所述多個(gè)第3混合水溶液部的體積的平均值相差25%以上。10.—種DNA檢測(cè)裝置， 是基于從在傳感芯片的表面上的流路中流淌的多個(gè)DNA混合水溶液部輸出的熒光來(lái)檢測(cè)DNA的DNA檢測(cè)裝置， 所述多個(gè)DNA混合水溶液部是DNA混合溶液、第I熒光探針?biāo)芤号c第2熒光探針?biāo)芤夯旌隙傻乃芤海? 所述DNA混合水溶液是包含作為對(duì)象的單鏈DNA的DNA溶液與DNA合成酶混合而成的水溶液， 所述第I熒光探針?biāo)芤菏桥c第I單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合的熒光探針劑與引物混合而成的水溶液， 所述第2熒光探針?biāo)芤菏桥c第2單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合的熒光探針劑與引物混合而成的水溶液， 該DNA檢測(cè)裝置具備熒光檢測(cè)部和DNA檢測(cè)部， 所述熒光檢測(cè)部對(duì)從在所述流路中流淌的所述多個(gè)DNA混合水溶液部輸出的熒光的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)， 所述DNA檢測(cè)部基于所述熒光的連續(xù)時(shí)間，判定所述多個(gè)DNA混合水溶液部所含的熒光探針?biāo)芤旱姆N類，基于相對(duì)于所述熒光的閾值的大小關(guān)系，檢測(cè)所述作為對(duì)象的單鏈DNA是否包含選自所述第I單鏈DNA和所述第2單鏈DNA中的至少I種。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA檢測(cè)裝置， 所述DNA檢測(cè)部獲得連續(xù)檢測(cè)到具有第I閾值以上的強(qiáng)度的熒光的連續(xù)時(shí)間，基于所述連續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)度，檢測(cè)所述作為對(duì)象的單鏈DNA是否包含選自所述第I單鏈DNA和所述第2單鏈DNA中的至少I種。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA檢測(cè)裝置， 如果設(shè)從每種所述熒光探針?biāo)芤核傻乃龆鄠€(gè)DNA混合水溶液部檢測(cè)到的所述熒光的連續(xù)時(shí)間的平均值從短到長(zhǎng)依次為T(mén)(n)，其中n = l、2、...，且T(n)的單位為秒，貝丨打⑷父丄^僅奸^的關(guān)系成立。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105936930SQ201610059640
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日
【發(fā)明人】佃雅彥
【申請(qǐng)人】松下知識(shí)產(chǎn)權(quán)經(jīng)營(yíng)株式會(huì)社