專利名稱：以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種DNA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)定量檢測(cè)DNA的方法有分光光度法，檢測(cè)260納米處的吸光值，DNA含量＝OD260×50μg/ml，此方法操作比較復(fù)雜；另一種常用方法是利用溴化乙錠結(jié)合DNA分子，在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，熒光強(qiáng)度與DNA量成正比，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可進(jìn)行DNA定量分析，由于溴乙錠是致癌物質(zhì)，不宜推廣?，F(xiàn)在采用TaqMan探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，但是成本高，背景信號(hào)強(qiáng)，對(duì)廣泛的定量檢測(cè)應(yīng)用有一定的影響。目前人們改用SYBR Green I和SYBR Gold為染料的熒光定量檢測(cè)DNA。因?yàn)檫@兩種熒光染料只與DNA雙鏈結(jié)合，在與DNA雙鏈結(jié)合后發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA雙鏈產(chǎn)物量呈正比，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行DNA定量分析，這兩種染料是目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的主要指示劑。由于有機(jī)染料不穩(wěn)定，高溫降解，見光易分解，發(fā)射光的光譜寬，光穩(wěn)定性差，檢測(cè)本底高。為此必須尋找性能好的熒光探針，實(shí)現(xiàn)DNA的檢測(cè)。
量子點(diǎn)是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類半導(dǎo)體納米粒子，由于存在顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，從而使它具有常規(guī)塊體材料不具備的光吸收特性，人們研究發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)的激發(fā)光譜在吸收閥值以上幾乎是連續(xù)的，譜峰較寬，只需一個(gè)比其發(fā)射光波長短的任何單一波長的光源激發(fā)，廉價(jià)的光源設(shè)備就可達(dá)到要求，發(fā)射的熒光具有亮度高、峰窄、對(duì)稱、光穩(wěn)定，是一類理想的熒光探針。染料需特定波長的光激發(fā)，對(duì)激發(fā)光源的設(shè)備要求高，且光穩(wěn)定性差。因此，量子點(diǎn)的熒光性能大大優(yōu)越于有機(jī)染料。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前，量子點(diǎn)已被用作熒光染料，已用于細(xì)胞顯色；用于Western blot雜交分析的結(jié)果顯色(Makrides SC等在Biotechniques雜志上2005年39卷第四期501-506頁發(fā)表了Bioconjugation ofquantum dot luminescent probes for Western blot analysis文章，該文中提出了用量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體進(jìn)行蛋白雜交顯色，并進(jìn)行定量分析。我們認(rèn)為，量子點(diǎn)也可以用于DNA的定量檢測(cè)方面，到目前為止，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們的有關(guān)研究文章已經(jīng)遞交。本發(fā)明已經(jīng)解決了量子點(diǎn)用于DNA定量檢測(cè)的技術(shù)方法問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺陷，利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能，提供一種以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法。使其具有簡便、快速、靈敏的特點(diǎn)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能，且DNA能使量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅，信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)性，建立了標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線，利用測(cè)量溶液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到溶液中的DNA濃度。具體實(shí)現(xiàn)過程為將DNA標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度的溶液，在每個(gè)溶液中加入相同量的量子點(diǎn)，混合后室溫放置10分鐘，采用熒光分光光度計(jì)，檢測(cè)熒光信號(hào)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，DNA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知樣品中DNA的含量。
在本發(fā)明的研究中，發(fā)現(xiàn)DNA能使量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅，且信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)測(cè)算，得出如下計(jì)算公式lgDNA含量＝(1264.4-Y)÷1786，DNA含量＝10(1264.4-Y)/1786ng/mL，其中Y代表溶液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。
所述量子點(diǎn)是采用帶負(fù)電荷的表面活性劑或用帶正負(fù)電荷的雙性離子型表面活性劑修飾的量子點(diǎn)，在與DNA作用時(shí)使量子點(diǎn)表面帶有負(fù)電荷。
本發(fā)明利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能，提供一種量子點(diǎn)熒光淬滅定量檢測(cè)DNA的方法。本發(fā)明將量子點(diǎn)的熒光特性應(yīng)用到DNA檢測(cè)中，建立快速、靈敏、簡便的DNA定量檢測(cè)方法。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖以及本發(fā)明的技術(shù)方案提供實(shí)施例。
實(shí)施例一氯化鎘溶解在含有巰基乙酸的堿性(pH10)水溶液中，加入離子型碲源NaHTe(由碲粉和硼氫化鈉制備成)，100℃反應(yīng)30～240分鐘，反應(yīng)時(shí)間不同得到量子點(diǎn)的粒徑不同，溶液顏色由綠色到橙色最終為紅色，合成表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)，用此方法可得到1.6nm～3nm范圍內(nèi)不同粒徑的CdTe量子點(diǎn)。這里選用粒徑為3納米的量子點(diǎn)，在小于500納米的任何波長激發(fā)，可得到發(fā)射波長為560nm的熒光。
取全長基因組是93.857kb的乳腺癌相關(guān)抗原基因(brcaa1基因)，它的基因庫接受號(hào)為AF208045，用蒸餾水配制系列不同濃度(1.25，2.5，5，10，20，40ng/mL)的brcaa1基因溶液，加入上制備的表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)(粒徑3納米)，使得量子點(diǎn)的終濃度為0.007mg/mL，混合后室溫放置10分鐘，用熒光光度計(jì)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，選擇激發(fā)波長450nm，測(cè)發(fā)射波長為560nm的熒光強(qiáng)度，采用熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，DNA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，得到DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附

圖1)。
實(shí)施例二用氯化鎘和碲粉，及硼氫化鈉為原料，在含有半胱氨酸的酸性(pH4)水溶液中，回流反應(yīng)30～240分鐘合成表面帶有氨基和羧基的CdTe量子點(diǎn)，通過控制反應(yīng)時(shí)間可制備不同粒徑(2.8nm～4.5nm)的CdTe量子點(diǎn)，得到的CdTe量子點(diǎn)紫外吸收峰位置從531nm紅移到590nm，熒光發(fā)射峰從552nm紅移到600nm。這里選用粒徑為4納米左右的量子點(diǎn)，在小于500納米的任何波長激發(fā)，可得到發(fā)射波長為582nm的熒光。
取全長基因組是93.857kb的乳腺癌相關(guān)抗原基因(brcaa1基因)，它的基因庫接受號(hào)為AF208045，用蒸餾水配制系列不同濃度(5，10，20，40，80，160μg/mL)的brcaa1基因溶液，加入上制備的表面帶有羧基的CdTe量子點(diǎn)(粒徑3納米)，使得量子點(diǎn)的終濃度為0.012mg/mL，混合后室溫放置10分鐘，用熒光光度計(jì)測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，選擇激發(fā)波長430nm，測(cè)發(fā)射波長為582nm的熒光強(qiáng)度，采用熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，DNA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，得到DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見附圖2)。
權(quán)利要求
1.一種以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法，其特征在于，利用量子點(diǎn)的熒光性能，且DNA能使量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅，信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)性，建立了標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線，利用測(cè)量溶液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到溶液中的DNA濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法，其特征是，具體實(shí)現(xiàn)過程為將DNA標(biāo)準(zhǔn)品配制成系列濃度的溶液，在每個(gè)溶液中加入相同量的量子點(diǎn)，混合后室溫放置10分鐘，采用熒光分光光度計(jì)，檢測(cè)熒光信號(hào)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，DNA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，制作DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知樣品中DNA的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法，其特征是，信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)性，具體數(shù)量關(guān)系為DNA含量＝10(1264，4-Y)/1786ng/mL，其中Y代表溶液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法，其特征是，所述量子點(diǎn)是采用帶負(fù)電荷的表面活性劑或用帶正負(fù)電荷的雙性離子型表面活性劑修飾的量子點(diǎn)，在與DNA作用時(shí)使量子點(diǎn)表面帶有負(fù)電荷。
全文摘要
一種以量子點(diǎn)為熒光示蹤劑定量檢測(cè)DNA的方法，屬于DNA檢測(cè)的領(lǐng)域。本發(fā)明利用量子點(diǎn)優(yōu)越的熒光性能，且DNA能使量子點(diǎn)的熒光信號(hào)淬滅，信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)性，建立了標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線，利用測(cè)量溶液中量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到溶液中的DNA濃度；信號(hào)淬滅的程度與DNA的量成正相關(guān)性，具體數(shù)量關(guān)系為DNA含量＝10
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1876838SQ200610026090
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月27日
發(fā)明者崔大祥, 高峰, 賀蓉, 潘碧峰 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)