一種基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法包括以下步驟：(1)配置不同濃度梯度的碳納米管?去離子分散液；(2)將分散液與釀酒酵母混合均勻，得到碳納米管?酵母懸浮液；(3)碳納米管?酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中進(jìn)行破壁處理，獲得破碎的酵母細(xì)胞；(4)通過(guò)核酸的提取與測(cè)定檢測(cè)酵母細(xì)胞破壁效果。在相同的操作條件下，釀酒酵母破壁率比純脈沖電場(chǎng)或碳納米管處理有明顯提高。本發(fā)明過(guò)程簡(jiǎn)單，易操作，可以在短時(shí)間到達(dá)較好的破壁效果，有利于提高釀酒酵母胞內(nèi)核酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提取。
【專利說(shuō)明】
一種基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種釀酒酵母破壁的方法，特指一種基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū) 動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，從而達(dá)到提取胞內(nèi)核酸的目的。
【背景技術(shù)】
[0002] 在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生夾帶大量酵母，每生產(chǎn)100噸啤酒就有1.5~2.0噸廢酵 母產(chǎn)生，我國(guó)啤酒行業(yè)每年可產(chǎn)生的啤酒廢酵母達(dá)60~80萬(wàn)噸。目前，啤酒廢酵母大部分作 為肥料、飼料，利用率很低，部分企業(yè)把廢酵母直接作為廢棄物排入啤酒廢水，增加了啤酒 廢水的處理負(fù)荷和難度，造成很大的浪費(fèi)。這些廢棄酵母中含有豐富的酵母多糖、核糖核 酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，在生物、醫(yī)藥及保健食品中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。因此從廢酵母中高效 充分地提取出各種功能性強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，制成功能性食品如氨基酸制劑和核酸制劑等是對(duì) 釀酒酵母綜合利用的一個(gè)大方向。細(xì)胞破壁技術(shù)研究對(duì)有效提取胞內(nèi)活性物質(zhì)具有重要意 義。
[0003] 釀酒酵母細(xì)胞壁較厚（100-300nm)，主要由β-D-葡聚糖、α-D甘露聚糖兩種多糖及 少量的幾丁質(zhì)組成。酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁具有典型的三明治結(jié)構(gòu)一一外層為甘露聚糖，內(nèi)層 為葡聚糖，中間夾有蛋白質(zhì)分子層。酵母細(xì)胞壁由復(fù)雜的分枝狀聚合物相互交聯(lián)而成，壁 厚，很難破除，必須借助外力才能破壞。目前所報(bào)道的關(guān)于酵母破壁的方法很多，常用的破 壁方法有物理法，如高壓勻漿破碎法、超聲波破碎法、微波破碎法等;化學(xué)法，如酸熱法、化 學(xué)滲透法;生物法，如酶溶細(xì)胞破壁法等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)陸續(xù)采用以上方法開展了酵母破壁 的研究，中國(guó)專利CN200910229778.9公布了一種利用微生物酶系對(duì)啤酒酵母細(xì)胞進(jìn)行破壁 裂解的方法；中國(guó)專利CN201310675002.6公布了一種紅酵母的破壁方法；中國(guó)專利 CN201510153242.9公布了一種富硒酵母破壁及納米化的制備方法等。
[0004] 但綜合來(lái)看，以上破壁技術(shù)存在以下不足之處：
[0005] (1)傳統(tǒng)的物理破壁法需要消耗較大能量，產(chǎn)生的熱降低了胞內(nèi)物質(zhì)如蛋白質(zhì)和 核酸的生物活性。
[0006] (2)化學(xué)處理法易引起營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)變性，后續(xù)處理土藝繁瑣。
[0007] (3)生物破壁法，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008] 所以有必要尋找一條簡(jiǎn)單、節(jié)能、節(jié)約成本的破壁工藝，近年來(lái)，脈沖電場(chǎng)破壁法 被廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)的提取，脈沖電場(chǎng)利用電穿孔機(jī)理在瞬間使細(xì)胞破壁，促進(jìn)活性組分 提取。劉錚等在《食品工業(yè)科技》第28卷3期(2007)發(fā)表了 "高壓脈沖電場(chǎng)破壁法提取啤酒酵 母中蛋白質(zhì)與核酸"和謝閣等在《食品與發(fā)酵工業(yè)》第34卷第3期(2008)發(fā)表了 "利用高壓脈 沖電場(chǎng)誘導(dǎo)啤酒酵母細(xì)胞釋放蛋白質(zhì)與核酸"。采用脈沖電場(chǎng)進(jìn)行破壁提取生物質(zhì)，避免了 傳統(tǒng)提取手段的缺陷。但單一物理場(chǎng)有一定自身的局限性，破壁效果有限。
[0009] 本項(xiàng)發(fā)明提出脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，通過(guò)施加 外電場(chǎng)的方法，來(lái)定向增強(qiáng)碳納米管對(duì)酵母細(xì)胞的破壁作用，充分應(yīng)用脈沖電場(chǎng)電穿孔作 用和碳納米管的電場(chǎng)響應(yīng)特性，以及二者的相互作用以強(qiáng)化破壁效率，可以大大縮短胞內(nèi) 活性物質(zhì)的釋放時(shí)間。經(jīng)檢索，超聲脈沖電場(chǎng)與碳納米管結(jié)合起來(lái)作用于酵母細(xì)胞進(jìn)行破 壁的研究還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種脈沖電場(chǎng)與碳 納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，大幅度提高酵母細(xì)胞破壁效率和活性組分提取 率。
[0011] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] -種脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，包括以下步驟：
[0013] (1)配置不同濃度梯度的碳納米管-去離子水分散液；
[0014] (2)將分散液與釀酒酵母混合均勻，得到碳納米管-酵母懸浮液；
[0015] (2-1)酵母的活化處理；
[0016] (2-2)不同濃度梯度的碳納米管處理酵母懸浮液
[0017] (3)碳納米管-酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中進(jìn)行破壁處理；
[0018] (4)通過(guò)核酸的提取與測(cè)定檢測(cè)酵母細(xì)胞破壁效果。
[0019] 所述不同濃度梯度的碳納米管-去離子分散液，具體為:取適量碳納米管，超聲均 勻分散于去離子水中，超聲時(shí)間為〇.5h，配置成濃度梯度分別為lg/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/ L碳納米管-去離子分散液。
[0020] 所述的碳納米管為多壁碳納米管，純度>95%，平均直徑10-20nm，長(zhǎng)度1-10μπι。
[0021] 所述對(duì)酵母的活化處理，具體為:將干酵母按1:10~20的比例投放于35~38°C的 溫水中復(fù)水15~2 0m i η制成酵母懸浮液。
[0022] 所述碳納米管處理酵母懸浮液，具體為:取五只小燒杯，分別加入50mL上述酵母懸 浮液，各加入l-5g/L的碳納米管-去離子分散液30mL，機(jī)械攪拌混合均勾，攪拌時(shí)間為0.5h， 即得碳納米管-酵母懸浮液。
[0023] 所述將碳納米管-酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中進(jìn)行破壁處理，具體為：
[0024] 將碳納米管-酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中，脈沖波形為指數(shù)衰減波、平板電 極的距離為10~40cm，脈沖放電電壓為10~40kV，頻率50~200Hz，脈沖寬度為40~lOOys， 脈沖數(shù)為500~1000次，脈沖處理時(shí)間為1~20s。
[0025] 所述核酸的提取與測(cè)定，具體為：不同方法得到的釀酒酵母細(xì)胞碎片，以4000~ 5000r/min的速度離心8~lOmin，得到的上清液即為核酸提取液，于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光 度。核酸量計(jì)算公式為：
[0027] A26Q為260nm處的紫外吸收值;0.024為濃度lyg/mL的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液的紫外吸收值； V為上清液體積，mL; η為稀釋倍數(shù);m為釀酒酵母質(zhì)量，g。
[0028]本發(fā)明的有益效果是：
[0029] 1)在脈沖電場(chǎng)和碳納米管協(xié)同作用下，碳納米管可以像"納米針" 一樣穿透細(xì)胞 膜，穩(wěn)定的外加電場(chǎng)可以定向增強(qiáng)碳納米管對(duì)細(xì)胞膜破壞作用，充分疏松細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)一 步擴(kuò)大脈沖電場(chǎng)致細(xì)胞電穿孔的效果，同時(shí)碳納米管塌縮過(guò)程中可以釋放巨大的范德華作 用能，提高釀酒酵母破壁率，加強(qiáng)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散、溶解及提取。
[0030] 2)協(xié)同提取速率比純脈沖電場(chǎng)或碳納米管處理有明顯提高，操作工藝簡(jiǎn)單、易行， 生產(chǎn)成本低，破壁率高。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。 [0032] 實(shí)施例1
[0033] 本實(shí)施例的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，步驟如 下:將lg多壁碳納米管，超聲均勻分散于l〇〇〇mL去離子水中，超聲時(shí)間為0.5h，配置成濃度 梯度為lg/L碳納米管-去離子分散液。將lg啤酒干酵母按1:10的比例投放于35°C的溫水中 復(fù)水15min制成酵母懸浮液后，加入30mL lg/L碳納米管-去離子分散液，機(jī)械攪拌0.5h，獲 得碳納米管-酵母懸浮液。將制備的碳納米管-酵母懸浮液置于兩板狀鐵電極之間的處理 室，電極的距離保持在40cm。脈沖放電電壓為10kV、頻率50Hz、脈沖寬度為40ys、脈沖數(shù)為 500次、脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間為Is，即得破碎的酵母細(xì)胞，再用離心機(jī)以5000r/min的速度離心 8min，收集上清液，于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。核酸量=A26Q X V X n/0.024m，式中A26〇為 260nm處的紫外吸收值;0.024為濃度lyg/mL的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液的紫外吸收值;V為上清液體 積，mL;n為稀釋倍數(shù);m為釀酒酵母質(zhì)量，g。經(jīng)分析，本實(shí)施例釀酒酵母破碎率比單獨(dú)使用脈 沖電場(chǎng)或碳納米管提高12%和22%。
[0034] 實(shí)施例2:-種脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，步驟如 下:將lg多壁碳納米管，超聲均勻分散于500mL去離子水中，超聲時(shí)間為0.5h，配置成濃度梯 度為2g/L碳納米管-去離子分散液。將1.5g啤酒干酵母按1:15的比例投放于36°C的溫水中 復(fù)水18min制成酵母懸浮液，加入30mL 2g/L碳納米管-去離子分散液，機(jī)械攪拌0.5h，獲得 碳納米管-酵母懸浮液。將制備的碳納米管-酵母懸浮液置于兩板狀鐵電極之間的處理室， 平板電極的距離保持在20cm。脈沖放電電壓為20kV、頻率100Hz、脈沖寬度為60ys、脈沖數(shù)為 800次、脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間為10s，即得破碎的酵母細(xì)胞，用離心機(jī)以4500r/min的速度離 9min，收集上清液，于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。核酸量=A26Q X V X n/0.024m，式中A26〇為 260nm處的紫外吸收值;0.024為濃度lyg/mL的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液的紫外吸收值;V為上清液體 積，mL;n為稀釋倍數(shù);m為釀酒酵母質(zhì)量，g。經(jīng)分析，本實(shí)施例釀酒酵母破碎率比單獨(dú)使用脈 沖電場(chǎng)或碳納米管提高14%和25%。
[0035] 實(shí)施例3:-種脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，步驟如 下:將lg多壁碳納米管，超聲均勻分散于200mL去離子水中，超聲時(shí)間為0.5h，配置成濃度梯 度為5g/L碳納米管-去離子分散液。將2g啤酒干酵母按1:20的比例投放于38°C的溫水中復(fù) 水20min制成酵母懸浮液，加入30mL lg/L碳納米管-去離子分散液，機(jī)械攪拌0.5h，獲得碳 納米管-酵母懸浮液。將制備的碳納米管-酵母懸浮液置于兩板狀鐵電極之間的處理室，平 板電極的距離保持在l〇cm。脈沖放電電壓為40kV、頻率200Hz、脈沖寬度為100ys、脈沖數(shù)為 1000次、脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間為20s，即得破碎的酵母細(xì)胞，用離心機(jī)以4000r/min的速度離心 10min，收集上清液，于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。核酸量=A26Q X V X n/0.024m，式中A26〇為 260nm處的紫外吸收值;0.024為濃度lyg/mL的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液的紫外吸收值;V為上清液體 積，mL;n為稀釋倍數(shù);m為釀酒酵母質(zhì)量，g。經(jīng)分析，本實(shí)施例釀酒酵母破碎率比單獨(dú)使用脈 沖電場(chǎng)或碳納米管提高18%和28%。
[0036]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受所述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 配置不同濃度梯度的碳納米管-去離子分散液； (2) 將分散液與釀酒酵母混合均勻，得到碳納米管-酵母懸浮液； (2-1)酵母的活化處理； (2-2)不同濃度梯度的碳納米管處理酵母懸浮液 (3) 碳納米管-酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中進(jìn)行破壁處理； (4) 通過(guò)核酸的提取與測(cè)定檢測(cè)酵母細(xì)胞破壁效果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脈沖電場(chǎng)協(xié)同碳納米管強(qiáng)化釀酒酵母細(xì)胞破壁方法，其 特征在于，步驟(1)所述配置不同濃度梯度的碳納米管-去離子分散液，具體為:取適量碳納 米管，超聲均勻分散于去離子水中，超聲時(shí)間為〇.5h，配置成濃度梯度分別為lg/L，2g/L， 3g/L，4g/L，5g/L碳納米管-去離子分散液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的 方法，其特征在于，步驟（1)所述的碳納米管為多壁碳納米管，純度>95%，平均直徑10-20nm,長(zhǎng)度 1-10μηι。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方 法，其特征在于，步驟(2-1)所述對(duì)酵母的活化處理，具體為： 將干酵母按1:10~20的比例投放于35~38 °C的溫水中復(fù)水15~20min制成酵母懸浮 液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方 法，其特征在于，步驟(2-2)進(jìn)一步包括如下步驟： 取五只小燒杯，分別加入50mL上述酵母懸浮液，各加入l-5g/L的碳納米管-去離子分散 液30mL，接續(xù)攪拌混合均勾，攪拌時(shí)間為0.5h，即得碳納米管-酵母懸浮液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方 法，其特征在于，步驟(3)所述將碳納米管-酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中進(jìn)行破壁處 理，具體為： 將酵母懸浮液置于高壓脈沖處理室中，脈沖波形為指數(shù)衰減波、平板電極的距離為10 ~40cm，脈沖放電電壓為10~40kV，頻率50~200Hz，脈沖寬度為40~100ys，脈沖數(shù)為500~ 1000次，脈沖處理時(shí)間為1~20s。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方 法，其特征在于，步驟(4)所述核酸的提取與測(cè)定，具體為： 不同方法得到的細(xì)胞碎片，以4000~5000r/min的速度離心8~lOmin，得到的上清液即 為蛋白質(zhì)提取液，于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于脈沖電場(chǎng)與碳納米管協(xié)同驅(qū)動(dòng)釀酒酵母細(xì)胞破壁的方 法，其特征在于， 上清液中的核酸量計(jì)筧公式為：A26Q為260nm處的紫外吸收值;0.024為濃度lyg/mL的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液的紫外吸收值;V為 上清液體積，mL; η為稀釋倍數(shù);m為釀酒酵母質(zhì)量，g。
【文檔編號(hào)】C12N13/00GK105950476SQ201610403345
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】劉丹, 丁利君, 肖思杰
【申請(qǐng)人】廣東工業(yè)大學(xué)