專利名稱：一種增加酵母細(xì)胞微膠囊壁材孔徑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增加酵母細(xì)胞微膠囊壁材孔徑的方法，屬于生物材料加工的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微膠囊作為一項(xiàng)能夠改善功能性物質(zhì)性能的新技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。酵母細(xì)胞大小均勻，容易培養(yǎng)，價(jià)廉，其細(xì)胞壁和細(xì)胞膜構(gòu)成的雙層囊腔結(jié)構(gòu)，是包埋物質(zhì)的良好材料。法國(guó)專利FR2179528報(bào)道了工業(yè)用酵母經(jīng)過(guò)質(zhì)壁分離劑處理后，包埋了氯化釹、氯化鎂和洋蔥提取物；美國(guó)專利USA 4001480介紹了一種利用在低氮高碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)的脂肪含量高達(dá)40 60%的酵母細(xì)胞包埋油溶性化合物的方法；專利EP-0085805A1利用一種既能溶于油又能溶于水的公共溶劑，找到了一種以脂肪含量高于10%的酵母菌制備微膠囊的方法；而專利EP 0242135A2采用將酵母細(xì)胞放在含有囊心的濃溶液或分散液中溶脹，在室溫條件下攪拌進(jìn)行擴(kuò)散滲透的方法，提供了一種脂肪含量低于10%的酵母細(xì)胞作為微膠囊壁材而無(wú)需公共溶劑的微膠囊化方法。EP 0414282A1和0414283A1提供了一種將漂白劑和紡織柔軟劑中的芳香類(lèi)物質(zhì)包埋于酵母細(xì)胞中的方法。WO 93/11869則先用H2O2除臭后再制成了液體漂白催化劑的微膠囊。WO 94/22572公開(kāi)了一種先將待包埋物質(zhì)的溶液進(jìn)入到細(xì)胞中，然后通過(guò)物理或化學(xué)方法使待包埋物殘留其中的制備生物微膠囊的方法。2000年成立的Fluid Technologies Plc.公司專門(mén)生產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的酵母微膠囊，日本也開(kāi)發(fā)成功了油脂的酵母微膠囊產(chǎn)品。專利號(hào)為ZL2007101375531的中國(guó)發(fā)明專利提供一種制備安全無(wú)毒性能優(yōu)良的微膠囊壁材的方法。通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行改性后所制備的微膠囊壁材既可用于脂溶性物質(zhì)的包埋，又能用于水溶性物質(zhì)的微膠囊化。專利號(hào)為ZL2007101375527中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種小分子抗氧化劑生物微 膠囊的制備方法，不僅制備過(guò)程簡(jiǎn)便，而且在包埋過(guò)程中不會(huì)發(fā)生化學(xué)變化。上述專利文獻(xiàn)均是以酵母細(xì)胞為壁材對(duì)小分子物質(zhì)進(jìn)行了成功包埋。但只有流體力學(xué)半徑(Rh)小于O. 81 nm (或分子量低于620 Da )的物質(zhì)以及分子量低于400 kDa的球形蛋白能夠自由通過(guò)酵母細(xì)胞壁，而質(zhì)膜卻限制了 Rh大于O. 42 nm或分子量高于110 Da的物質(zhì)的穿越?，F(xiàn)有專利文獻(xiàn)中還未見(jiàn)通過(guò)增大酵母細(xì)胞孔徑來(lái)實(shí)現(xiàn)大分子物質(zhì)如多肽蛋白類(lèi)藥物包埋的方法。多肽蛋白類(lèi)藥物具有活性高、特異性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)，可有效治療癌癥、自身免疫性疾病及高血壓等疑難病，但其口服生物利用度通常低于I %，其常規(guī)給藥方式均以注射為主。如果將多肽蛋白類(lèi)藥物制成酵母細(xì)胞微膠囊后，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)快速降解，提高藥物的穩(wěn)定性，而且還能提高治療的有效性和安全性，降低成本。酵母細(xì)胞溫和的包埋過(guò)程還能避免大分子的聚集變性或鏈斷裂，其豐富的多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸也有助于保持多肽蛋白類(lèi)藥物的生物活性。因此，增大酵母細(xì)胞孔徑，對(duì)于大分子物質(zhì)的包埋，特別是對(duì)于親水性的多肽蛋白類(lèi)藥物的口服給藥的實(shí)現(xiàn)具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)原理是利用酵母細(xì)胞本身的水解酶系，將新培養(yǎng)的食用酵母細(xì)胞采用自溶促進(jìn)劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖匀芴幚砗?，離心，洗滌，重新懸浮在擴(kuò)孔劑溶液中，在2(T85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24-72小時(shí)后，離心，得沉淀進(jìn)行冷凍干躁，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材。本發(fā)明的目的是提供一種增大酵母細(xì)胞微膠囊壁材孔徑的方法，使酵母細(xì)胞主要用于蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的微膠囊化。步驟包括(I)采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)；(2)將所得的細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在具有自溶促進(jìn)功能的自溶促進(jìn)劑中，在40 60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 48小時(shí)后，離心、洗滌，其中所述的自溶促進(jìn)劑任一選自吐溫-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基銨、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀及氯化鈉；應(yīng)當(dāng)指出加入自溶促進(jìn)劑的作用在于促進(jìn)細(xì)胞自溶，如果加入高濃度的自溶促進(jìn)劑則反應(yīng)時(shí)間更短，如果加·入低濃度的自溶促進(jìn)劑則反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)。因此在合適濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的自溶促進(jìn)劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以通過(guò)控制時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)達(dá)到預(yù)期效果。在另一具體實(shí)施方案中，所述的吐溫-80或TritonX-100的加入重量為O.1 5% ;或所述的溴化十六烷基三甲基銨的加入重量為O.1 5% ;或所述的乙酸乙酯的加入重量為O. 5 10% ;或所述的乙醇的加入重量為O. 5 10% ;或所述的鹽酸的加入重量為O. 5 10% ;或所述的氫氧化鈉的加入重量為I 10% ;或所述的氯化鈉的加入重量為I 20% ;或所述的氯化鉀的加入重量為I 20% ；(3)將經(jīng)過(guò)自溶處理的酵母細(xì)胞重新懸浮在擴(kuò)孔劑溶液中，在20 85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 72小時(shí)后，離心、洗滌，凍干，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材，其中所述的擴(kuò)孔劑任一選自甘露聚糖酶或葡聚糖酶；(4)將酵母細(xì)胞壁材與固體SOD酶混合后，加入十倍重量的水進(jìn)行攪拌，使酵母細(xì)胞壁材與SOD酶溶液高頻度接觸，離心，洗去細(xì)胞表面的SOD酶，凍干后磨細(xì)，即得SOD酶的酵母細(xì)胞微膠囊。應(yīng)當(dāng)指出加入擴(kuò)孔劑的作用在于部分萃取酵母細(xì)胞外壁上的甘露糖蛋白，如果加入高濃度的擴(kuò)孔劑則反應(yīng)時(shí)間更短，如果加入低濃度的則反應(yīng)時(shí)間更長(zhǎng)。因此在合適濃度范圍內(nèi)，加入不同濃度的擴(kuò)孔劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以通過(guò)控制時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)達(dá)到預(yù)期效果。在一個(gè)具體實(shí)施方案中,所述的甘露聚糖酶加入重量為O.1 5% ;或所述的葡聚糖酶的加入重量為O. 5 5%。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞壁材的重量g與固體SOD酶的重量g比為100 :20-50。技術(shù)效果1、本發(fā)明方法中所用的原料、設(shè)備均為常見(jiàn)的普通原料、設(shè)備，避免了工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于昂貴原材料、儀器的依賴，大大地降低了生產(chǎn)成本；2、采用甘露聚糖酶降解部分酵母細(xì)胞壁，在間隔超聲處理過(guò)程中能有效增大酵母細(xì)胞孔徑，不會(huì)過(guò)度對(duì)同一部位進(jìn)行持續(xù)水解酵母細(xì)胞壁，有效控制整個(gè)酵母細(xì)胞壁的孔徑大小。3、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，極大的延長(zhǎng)了大分子蛋白的體外活性，保證了大分子蛋白的穩(wěn)定性，降低了其生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)過(guò)程。
具體實(shí)施例方式下面，本發(fā)明將用實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，但是它并不限于這些實(shí)施例的任一個(gè)或類(lèi)似實(shí)例。實(shí)施例1 :采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)馬鈴薯培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48h。將所得的酵母細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在O. 5 10%鹽酸溶液中，在40 60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理48 h后，12000rpm離心10 min,用水洗漆兩次以上。將經(jīng)過(guò)自溶處理的酵母細(xì)胞重新懸浮在O.1 5%甘露聚糖酶溶液(長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司提供，5000U/g)中，在20 85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 72小時(shí)后，12000rpm離心lOmin，用水洗滌兩次以上，凍干，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材。將酵母細(xì)胞壁材20 g 與6 g固體SOD酶混合后，加入260 g的水進(jìn)行攪拌，使酵母細(xì)胞壁材與SOD酶溶液高頻度接觸，7000rpm離心5min，用十倍體積的水進(jìn)行洗三次，洗去細(xì)胞表面的SOD酶，凍干后磨細(xì)，即得SOD酶的酵母細(xì)胞微膠囊7 g，SOD酶的微膠囊檢測(cè)可以通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察。實(shí)施例2:采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)馬鈴薯培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48h。將所得的酵母細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在O. 5 10%氫氧化鈉溶液中，在40 60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 h后，12000rpm離心lOmin，用水洗滌兩次以上。將經(jīng)過(guò)自溶處理的酵母細(xì)胞重新懸浮在O. 5 5%葡聚糖酶溶液(長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司提供，3500U/g)中，在20 85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 72小時(shí)后，12000rpm離心lOmin，用水洗滌兩次以上，凍干，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材。將酵母細(xì)胞壁材30 g與12 g固體SOD酶混合后，加入420 g的水進(jìn)行攪拌，使酵母細(xì)胞壁材與SOD酶溶液高頻度接觸，7000rpm離心5min，用十倍體積的水進(jìn)行洗三次，洗去細(xì)胞表面的SOD酶，凍干后磨細(xì)，即得SOD酶的酵母細(xì)胞微膠囊11 g，SOD酶的微膠囊檢測(cè)可以通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察。實(shí)施例3 采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)馬鈴薯培養(yǎng)基的斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48h。將所得的酵母細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在O. 5 10%氯化鉀溶液中，在40 60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理36 h后，12000rpm離心lOmin，用水洗滌兩次以上。將經(jīng)過(guò)自溶處理的酵母細(xì)胞重新懸浮在O. 5 5%葡聚糖酶溶液(長(zhǎng)沙湘資生物科技有限公司提供，3500U/g)中，在20 85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 72小時(shí)后，12000rpm離心lOmin，用水洗滌兩次以上，凍干，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材。將酵母細(xì)胞壁材25 g與8 g固體SOD酶混合后，加入330 g的水進(jìn)行攪拌，使酵母細(xì)胞壁材與SOD酶溶液高頻度接觸，7000rpm離心5min，用十倍體積的水進(jìn)行洗三次，洗去細(xì)胞表面的SOD酶，凍干后磨細(xì)，即得SOD酶的酵母細(xì)胞微膠囊9 g，SOD酶的微膠囊檢測(cè)可以通過(guò)顯微鏡進(jìn) 行觀察。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種增大酵母細(xì)胞微膠囊壁材孔徑的方法，其具體步驟包括 (1)采用酵母細(xì)胞為出發(fā)菌株，經(jīng)斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)； (2)將所得的細(xì)胞離心，洗滌后，重新懸浮在具有自溶促進(jìn)功能的自溶促進(jìn)劑中，在40 60°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 48小時(shí)后，離心、洗滌，其中所述的自溶促進(jìn)劑任一選自吐溫-80或TritonX-100、溴化十六烷基三甲基銨、乙酸乙酯、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀及氯化鈉； (3)將經(jīng)過(guò)自溶處理的酵母細(xì)胞重新懸浮在擴(kuò)孔劑溶液中，在20 85°C的溫度下進(jìn)行振蕩處理24 72小時(shí)后，離心、洗滌，凍干，即得到所述的孔徑增大的酵母細(xì)胞微膠囊壁材，其中所述的擴(kuò)孔劑任一選自甘露聚糖酶或葡聚糖酶； (4)將酵母細(xì)胞壁材與固體SOD酶混合后，加入十倍重量的水進(jìn)行攪拌，使酵母細(xì)胞壁材與SOD酶溶液高頻度接觸，離心，洗去細(xì)胞表面的SOD酶，凍干后磨細(xì)，即得SOD酶的酵母細(xì)胞微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的甘露聚糖酶加入重量為O.1 5% ;或所述的葡聚糖酶的加入重量為O. 5 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中酵母細(xì)胞壁材的重量g與固體SOD酶的重量g比為,100 :20-50。
全文摘要
經(jīng)加入適量的擴(kuò)孔劑進(jìn)行處理酵母細(xì)胞壁使大分子物質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞壁內(nèi)。本發(fā)明方法中所用的原料、設(shè)備均為常見(jiàn)的普通原料、設(shè)備，避免了工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)于昂貴原材料、儀器的依賴，大大地降低了生產(chǎn)成本；采用甘露聚糖酶降解部分酵母細(xì)胞壁，在間隔超聲處理過(guò)程中能有效增大酵母細(xì)胞孔徑，不會(huì)過(guò)度對(duì)同一部位進(jìn)行持續(xù)水解酵母細(xì)胞壁，有效控制整個(gè)酵母細(xì)胞壁的孔徑大?。槐景l(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，極大的延長(zhǎng)了大分子蛋白的體外活性，保證了大分子蛋白的穩(wěn)定性，降低了其生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)過(guò)程。
文檔編號(hào)C12N11/16GK103060307SQ20121059046
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者石國(guó)榮 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)