一種中性低溫木聚糖酶CaXyn10A及其基因和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中性低溫木聚糖酶CaXyn10A及其基因和應用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質(zhì)：最適pH6.0?6.5，最適溫度40℃，在0℃保持20％以上的酶活，比活為453U/mg；具有木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶的活性；且易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的廣譜酶制劑,可廣泛用于水產(chǎn)飼料、食品、造紙、能源工業(yè)等。
【專利說明】
一種中性低溫木聚糖酶CaXynl 0A及其基因和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中性低溫木聚糖酶CaXynlOA 及其基因和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木聚糖(xylan)是植物生物質(zhì)的主要成分，在自然界中的含量僅次于纖維素 (Lynd et al .Microbiology and Molecular Biology Review 2002,66:506-577)，在生物能源方 面有潛在的利用價值。現(xiàn)有生物技術(shù)可以高效降解植物中的纖維素成分并轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵的 葡萄糖，后者在酵母作用下生成生物乙醇。高組分的木聚糖不但限制了纖維素酶與纖維素 的結(jié)合反應，抑制催化反應，而且作為副產(chǎn)品排入自然界可引起營養(yǎng)富集化從而破壞生態(tài) 系統(tǒng)（Polizeli et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2005,67:577_591)〇 因此在生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過程中，通常要添加木聚糖酶，一方面去除木聚糖的物理屏障，促進 纖維素酶與纖維素的結(jié)合(Hu et al .Biotechnology for Biofuels，2011，4:14;Qing and Wyman CE.Biotechnology for Biofuels，2011，4:18)，另一方面生成的木寡糖也可以進一 步降解成可發(fā)酵的木糖，為生物乙醇的生產(chǎn)提供10-25%的原料物質(zhì)(Ho et al. 1998,64: 1852-1859;Jin et al.Applied and Environmental Microbiology,2004,70:6816-6825) 〇
[0003] 基于氨基酸序列和催化域的結(jié)構(gòu)，大部分木聚糖酶(EC 3.2.1.8)劃分在糖苷水解 酶第10和11家族。與專一降解木聚糖的第11家族木聚糖酶相比，第10家族的木聚糖酶具有 寬泛的底物特異性，除了作用于木聚糖外，還可催化纖維素、葡聚糖等多種底物的降解，因 此在工業(yè)領(lǐng)域中具有更廣泛的應用前景。
[0004] 絲狀真菌易于培養(yǎng)、可以大量分泌木聚糖酶而成為木聚糖酶的理想來源(Tanaka et al.Journal of Bioscience and Bioengineering,2005,100:623-630)。大多數(shù)絲狀真 菌來源的木聚糖酶都是中溫或高溫酶，在環(huán)境溫度或低溫條件下喪失酶活?，F(xiàn)有的生物乙 醇加工工藝包括木質(zhì)纖維素的酸堿預處理、長時間高溫酶反應，從而消耗大量的能量和酸 堿化學試劑，造成成本的大幅度提升和嚴重的環(huán)境污染。因此開發(fā)中性低溫的木質(zhì)纖維素 降解酶系在節(jié)約能源、保護環(huán)境、易于催化反應等方面具有重要的意義（Ji et al .Biotechnology for Biofuels,2014,7:130)。截至目前，只有一個低溫木聚糖酶系被報 道(Del-Cid A et al.Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，172:524-532)， 沒有真菌來源的低溫第10家族木聚糖酶的報道。
[0005] 盡管真菌來源的木聚糖酶已廣泛應用于不同的工業(yè)領(lǐng)域，獲得新型具有優(yōu)良特性 的中性低溫木聚糖酶仍具有重大的研究意義與應用價值。克隆和異源表達低溫木聚糖酶， 為生物降解、飼料、食品和造紙工業(yè)提供經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的候補酶，是木聚糖酶應用于 工業(yè)化生產(chǎn)所必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種能高效應用的中性低溫木聚糖酶。
[0007] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述中性低溫木聚糖酶的基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中性低溫木聚糖酶的基因工程方法。
[0011] 本發(fā)明的另一目的提供上述中性低溫木聚糖酶的應用。
[0012] 本發(fā)明從枝孢菌(Cladosporium acalyphae SL-16)中分離得到一種新的中性低 溫木聚糖酶CaXy η 10 A。
[0013] 本發(fā)明提供了一種中性低溫木聚糖酶CaXynlOA，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所 不。
[0016] 其中，該酶基因編碼3 3 2個氨基酸，N端1 8個氨基酸為其信號肽序列 "mlisnaiaalsvlslasa"（SEQ ID NO.3)。
[0017] 因此，成熟的中性低溫木聚糖酶CaXynlOA的理論分子量為34.5kDa，其氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示：
[0019] 本發(fā)明的木聚糖酶CaXynlOA在中性(pH 6.0-6.5)和中低溫(20-45)范圍內(nèi)均具有 高活性的特性。Cladosporium acalyphae SL-16所產(chǎn)生的木聚糖酶CaXynlOA，其最適pH值 為6.5，在pH6.0~7.2的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性;最適溫度為40°C，在20-45°C間均具 有70%以上的酶活力;在0°C條件下還有20%酶活;且對多種木聚糖、葡聚糖、纖維素具有降 解作用。這種性質(zhì)的中性低溫木聚糖酶還未曾有過報道。
[0020] 本發(fā)明提供了編碼上述中性低溫木聚糖酶CaxynlOA。具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID N0.4所示：
[0021]
[0022]本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因 CaxynlOA，DNA全序列分析結(jié)果表 明，木聚糖酶CaXyn 10A結(jié)構(gòu)基因 Caxyn 10A全長1224bp，含有4個內(nèi)含子，cDNA長999bp，+132 ~+186bp，+518 ~+568bp，+815 ~+869bp 和+1074 ~+1137bp 為 55,51，55和6仙口的內(nèi)含子序 列，其cDNA序列如SEQIDN0.5所示：

[0025] 成熟蛋白理論分子量為34.5kDa。將木聚糖酶基因 CaxynlOA cDNA序列及推導出的 氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對。該基因與來源于Aspergillus fumigatus的木聚 糖酶氨基酸序列一致性為63%。說明CaXynlOA是一種新的木聚糖酶。
[0026]本發(fā)明還提供了包含上述中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組載體，優(yōu)選為 pET30-Caxynl0A。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案， 優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒pET30(a)上的Ndel和EcoRI限制性酶切位點之 間，使該核苷酸序列位于T7啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET30-Caxyn10A〇
[0027] 本發(fā)明還提供了包含上述中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組菌株，優(yōu)選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、曲霉或木霉，優(yōu)選為重組菌株P(guān)ET30/ CaxynlOA〇
[0028] 本發(fā)明還提供了一種制備中性低溫木聚糖酶CaXynlOA的方法，包括以下步驟：
[0029] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；
[0030] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及
[0031 ] 3)回收并純化所表達的木聚糖酶CaXynlOA。
[0032] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿 菌細胞(Escherichia coli)BL21，得到重組菌株pET30/Caxynl0A。
[0033] 本發(fā)明還提供了上述中性低溫木聚糖酶CaXynlOA的應用。
[0034] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得低溫木聚糖酶的菌 物資源，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在飼料、食品、工業(yè)中應用新的中性低溫木聚糖酶。本 發(fā)明的木聚糖酶最適pH為6.0，在pH6.0~7.2都有較高的酶活性;pH穩(wěn)定性好；比活力為 453U/mg;具有寬泛的底物特異性。其中性低溫的特點，可降低木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)上的能 源成本。pH適應范圍提高水產(chǎn)飼料消化能和代謝能，降低配方成本，減少環(huán)境污染。其寬泛 的底物特異性可以提尚谷物加工副廣品的營養(yǎng)價值，提升伺料廣品品質(zhì)。本木聚糖酶可應 用于釀酒工業(yè)，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉層，提高淀粉利用率，增加酒 精的產(chǎn)率。還可以在常溫條件下，將造紙工業(yè)廢料及農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被轉(zhuǎn)化為木 寡糖，而木寡糖可以被細菌、酵母及真菌轉(zhuǎn)化成有價值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工 業(yè)中的應用也顯示出其巨大的潛力。水解產(chǎn)物(木糖和低聚木糖)可應用在食品行業(yè)，作為 增稠劑、脂肪代替物、益生寡糖和抗凍食品添加劑;在制藥工業(yè)中木聚糖與其它物質(zhì)結(jié)合使 用，可以延緩藥物成分的釋放。木聚糖的水解產(chǎn)物還可以進一步轉(zhuǎn)化為液體燃料、單細胞蛋 白、溶劑和低熱量甜味劑。
【附圖說明】
[0035]圖1在大腸菌中表達的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1:純化的重組木聚糖 酶;Μ:低分子量蛋白質(zhì)Marker。
[0036]圖2重組木聚糖酶的最適pH。
[0037]圖3重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。
[0038]圖4重組木聚糖酶的最適溫度。
[0039]圖5重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0040] 試驗材料和試劑
[0041 ] 1、菌株及載體:本發(fā)明從枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16,保存于中國農(nóng) 業(yè)科學院農(nóng)業(yè)菌種保藏中心（北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號，中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)菌種 保藏中心，100081)，其保藏號為:ACCC32700。大腸桿菌表達載體pET30(a)及菌株BL21由本 實驗室保藏。
[0042] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。櫸 木木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0043] 3、培養(yǎng)基：
[0044] (1 )Cladosporium acalyphae SL-16培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基：lOOOmL馬鈴薯汁， l〇g葡萄糖，25g瓊脂，ρΗ5·0。
[0045] (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCl，ρΗ7.0)。
[0046] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0047] 實施例1 枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16產(chǎn)酶特性
[0048] 將枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，制成孢子懸 液，接種于鼓皮液體培養(yǎng)基中（Luo et al .Enzyme Microbial Technology,2009,45:126-133)，15°C培養(yǎng)7d，以1%的櫸木木聚糖為底物，在pH 6.0和30°C條件下反應10min，以DNS法 (Miller 1959)確定其具有木聚糖酶活性。
[0049] 實施例2枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶編碼基因 CaxynlOA的克 隆
[0050] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16基因組DNA:
[0051 ]將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔10min混勻一次，在4°C下 lOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于 室溫靜置5min后，4 °C下lOOOOrpm離心10min。棄上清，沉淀用70 %的乙醇洗滌兩次，真空干 燥，加入適量TE溶解，置于-20 °C備用。
[0052] 設(shè)計合成特異引物 CaxynlOA-F/CaxynlOA-F:
[0053] CaxynlOA-F：5'-atgctgatttccaacgccattgccg-3'；
[0054] CaxynlOA-R:5' -ttacaaagcgttgaggagagcagtgtaggc-3J；
[0055] 以枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16總DNA為模板進行PCR擴增DPCR反應參 數(shù)為：94°C變性5min;然后94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，30個循環(huán)后72 °C保溫10min。得到一約1224bp片段，將該片段回收后與PEASY-T3載體相連送三博生物技術(shù) 有限公司測序。
[0056] 實施例3枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶基因的RT-PCR分析
[0057] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的 一條鏈，然后以引物CaxynlOA-E-F/CaxynlOA-E-F擴增該單鏈cDNA，獲得木聚糖酶的cDNA序 列，擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。
[0058] CaxynlOA-E-F：5'-ccccatatgatgctgatttccaacgccattgcc-3'；
[0059] CaxynlOA-E-R:5 '-cccgaattcttagtggtggtggtggtggtgcaaagcgttgaggagagcagtg-3，；
[0060] 通過比較木聚糖酶的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因有4個內(nèi)含子，cDNA長 999bp，編碼332個氨基酸和一個終止密碼子，N端18個氨基酸為其信號肽序列。所測出的基 因 CaxynlOA的成熟蛋白部分核甘酸序列與GenBank上的木聚糖酶基因序列進行同源比較， 分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基因為新基因。
[0061]實施例4重組木聚糖酶的制備。
[0062] 將表達載體pET30(a)進行雙酶切（Nedl+EcoRI)，同時將編碼木聚糖酶的基因 CaxynlOA雙酶切(Nedl+EcoRI)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體pET30(a)連 接，獲得含有枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組質(zhì)粒 pET30_Caxynl0A并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組大腸桿菌菌株pET30/Caxynl0A。
[0063]以同樣的方法構(gòu)建包含信號肽序列的重組表達載體，并獲得重組菌株。
[0064] 取含有重組質(zhì)粒的BL21菌株，接種于100mL LB培養(yǎng)液中，16°C150rpm振蕩培養(yǎng)12h 后，加入0.6% IPTG誘導10h，收集細胞，超聲波破碎，離心收集上清液。測定木聚糖酶的活 力。重組木聚糖酶的表達量為1. SAU/mkSDS-PAGE結(jié)果（圖1)表明，重組木聚糖酶在大腸桿 菌中得到了表達。所表達的木聚糖酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達到總蛋白的15%以 上。
[0065] 實施例5重組木聚糖酶CaXynlOA的性質(zhì)測定
[0066] DNS法:具體方法如下：在pH6.5,40°C條件下，lmL的反應體系包括100yL適當?shù)南?釋酶液，900yL底物，反應10min，加入1.5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm測定0D 值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Ιμπιο?還原糖的酶量。
[0067] 1、重組木聚糖酶CaXynlOA的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下：
[0068] 將實施例4純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。底 物木聚糖用不同pH的0.1m〇l/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中30°C下進行木聚糖酶活力測 定。結(jié)果（圖2)表明，CaXyn 10A的最適pH為6.0，在pH6.0~7.2的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最 大酶活性的80 %以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中30 °C處理60min，再在pH6.0 緩沖液體系中40°C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果（圖3)表明木聚糖酶在pH 4.0-10.0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在70%以上，這說明此酶具有較 好的pH穩(wěn)定性。
[0069] 2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下：
[0070] 木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(PH6.0)緩沖液體系 及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在 pH6.0、40°C下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結(jié)果（圖4)表明其最適溫度為40°C。酶 的熱穩(wěn)定性性試驗表明（圖5)，重組酶在30°C時穩(wěn)定性非常好。40°C下保溫60min，完全失去 酶活。
[0071 ] 3、木聚糖酶的1(?值測定方法如下：
[0072] 用不同濃度的櫸木木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0)緩沖液體 系中，20 °C和40 °C下測定酶活性，計算出其在20 °C和40 °C下的Km、Vmax、kca4Pkcat/K m值。經(jīng)測 定，此木聚糖酶在40°C下以木聚糖為底物的U直為1.87mg/mL，最大反應速度VmaA331.6μ mol/min · mg，kcat值為 190.7/s和kcat/Km值為 102.0ml/mg · s;在20°C下以木聚糖為底物的km 值為 12 · 23mg/mL，最大反應速度Vmax為322 · 9ymol/min · mg^c^t值為 185 · 7/s和kc^t/lUIS 15.2ml/mg · s
[0073] 4、不同金屬離子化學試劑對CaXynlOA酶活的影響測定如下：
[0074] 在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為5mmo 1 /L。在40 °C、pH6.0條件下測定酶活性。結(jié)果(表1)表明，大 多數(shù)離子和化學試劑在濃度為5mmol時重組木聚糖酶的活力沒有明顯變化。但是Ag+強烈抑 制其活力，Pb2+，Zn2+，SDS和EDTA有部分抑制作用。Ni2+和Co 2+在5mmol時能使重組酶活力增加 到原來的1.27和1.16倍。
[0075] 表1.各種化學試劑對木聚糖酶CaXynlOA活力的影響
[0078] 5、CaXynlOA的底物特異性
[0079]在酶促反應體系中加入不同的底物，研究CaXynlOA的酶活性。在40°C、pH6.0條件 下測定酶活性。結(jié)果(表2)表明，CaXynlOA同時具有木聚糖酶、纖維素酶和葡聚糖酶的活性。 [0080] 表2. CaXynlOA的底物特異性
[0083] 6、CaXynlOA木聚糖酶降解櫸木木聚糖產(chǎn)物的分析如下：
[0084] 在500yL 1 %的木聚糖中加入1 OOyL純化的酶液，最適溫度下保溫12h。用無水乙醇 將酶蛋白沉淀，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培(HPAEC-PAD)檢 測方法，進行產(chǎn)物中糖種類的分析。分析結(jié)果表明：木聚糖酶CaXynlOA降解櫸木木聚糖的產(chǎn) 物主要是木二糖，木三糖和木四糖。產(chǎn)物中木二糖含量為50.1 %，木三糖含量為45.9 %，和 木四糖含量為4.0%。
【主權(quán)項】
1. 一種中性低溫木聚糖酶CaXynlOA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO .2所示。2. -種中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的中性低溫 木聚糖酶CaXynlOA。3. 如權(quán)利要求2所述的中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO.4或5所示。4. 包含權(quán)利要求2所述中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組載體。5. 包含權(quán)利要求2所述中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組載體pET30-Caxynl0A。6. 包含權(quán)利要求2所述中性低溫木聚糖酶基因 CaxynlOA的重組菌株。7. 如權(quán)利要求6的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、乳 酉支桿囷、曲霉或木霉。8. -種制備權(quán)利要求1所述中性低溫木聚糖酶CaXynlOA的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 1) 用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及 3) 回收并純化所表達的中性低溫木聚糖酶CaXynlOA。9. 權(quán)利要求1所述中性低溫木聚糖酶CaXynlOA的應用。
【文檔編號】C12N15/56GK105950591SQ201610343782
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】姚斌, 馬銳, 柏映國, 黃火清, 羅會穎, 蘇小運, 王亞茹, 王苑, 師霞
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所