一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物酶制劑生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木聚糖酶是指可將半纖維素降解成低聚糖和木糖的一組酶的總稱，主要包括外切0~1，4~木聚糖酶、內(nèi)切β~1，4~木聚糖酶和木聚糖酶。木聚糖酶在飼料、食品、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。木聚糖酶用作飼料酶制劑，可以有效解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，促進(jìn)畜禽對(duì)粗飼料的消化吸收。木聚糖酶作為新型的紙漿漂白助劑，降低漂白用氯，解決紙漿工業(yè)中的環(huán)境污染問題。在纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)實(shí)踐中，添加木聚糖酶可剝離木質(zhì)素與纖維素之間的聚合態(tài)，易于酶解過程中的酶與底物的充分接觸，利于酶解反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)能夠分解半纖維素成為酵母可利用的單糖，提高出酒率，降低纖維乙醇的成本。隨著纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，木聚糖酶的開發(fā)研究更加備受關(guān)注。
[0003]酶制劑生產(chǎn)通常以分批補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵兩種方式為主，較之于分批補(bǔ)料發(fā)酵，連續(xù)發(fā)酵可以提高設(shè)備的利用率和單位時(shí)間產(chǎn)量，只保持一個(gè)期的穩(wěn)定狀態(tài)；減少分批培養(yǎng)中每次清洗、裝料、消毒、接種、放罐等操作時(shí)間，提高生產(chǎn)效率；連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)出的發(fā)酵產(chǎn)品，質(zhì)量比較穩(wěn)定；發(fā)酵中各參數(shù)趨于恒值，便于自動(dòng)控制。
[0004]專利CN102776166A公開了一種木聚糖酶生產(chǎn)方法，利用黑曲霉菌(Asperillusniger),以乳糖為主原料，采取液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)木聚糖酶，其特征在于:在發(fā)酵過程中連續(xù)補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基，并在一個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)間斷的從發(fā)酵罐中放出發(fā)酵醪液；所得發(fā)酵醪液經(jīng)板框過濾，得到木聚糖酶液，再經(jīng)過超濾濃縮和噴霧干燥，得高活力木聚糖酶粉狀產(chǎn)品。采用高效連續(xù)的補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基料和間斷出醪法相結(jié)合；在相同原料量投入的情況下，每小時(shí)單位發(fā)酵體積產(chǎn)生的木聚糖酶發(fā)酵液提高71.9%，總產(chǎn)量提高約29%，單位原材料成本減低約22%。但木聚糖酶的活力水平較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)分批補(bǔ)料的不足，提供一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，在不增加設(shè)備投資成本的情況下，大幅提高設(shè)備利用率，增加產(chǎn)能，降低單位酶活力發(fā)酵成本，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，以綠色木霉為菌種，主要包括以下步驟:
I)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng):將綠色木霉菌株Trichoderma viride CGMCC N0.5832轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基上，30°C，培養(yǎng)7天，得到斜面孢子；然后用無菌水洗滌所述斜面孢子，得到孢子洗滌液；在無菌條件下將所述孢子洗滌液接入已滅菌的三角瓶種子培養(yǎng)基中，于180~220r/min，28~32°C條件下，培養(yǎng)18~24h，得活化菌種；將所述活化菌種以0.3-0.5體積％的接種量接入一級(jí)種子罐中，于28~32°C，通氣比1:0.6-0.8的條件下，培養(yǎng)18~20h，得到一級(jí)種子液；將所述一級(jí)種子液以8~10體積％的接種量接入二級(jí)種子罐，于28~32°C，通氣比1:0.6-0.8的條件下，培養(yǎng)8~12h，得到二級(jí)種子液；
2)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng):在發(fā)酵罐Fl中加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝料系數(shù)為30~40體積％，調(diào)節(jié)pH值為4.5-5.0，滅菌；待基礎(chǔ)培養(yǎng)基溫度降至30°C，在無菌條件下，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積8~12%的接種量接入所述二級(jí)種子液，接種后0~8h，通氣比為1:0.6-1.5，攪拌轉(zhuǎn)速為100~200r/min，培養(yǎng)溫度為30~32°C ;接種8h以后，通氣比1:1.5~2.0，攪拌轉(zhuǎn)速100?300r/min，培養(yǎng)溫度28~30°C ;當(dāng)還原糖濃度在0.3重量％以下時(shí)，開始連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料速率為每小時(shí)補(bǔ)料量為發(fā)酵液體積的0.7-1.2%，當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)到發(fā)酵罐Fl容積的70~80%時(shí)，將發(fā)酵罐Fl中1/2體積的發(fā)酵液導(dǎo)入二級(jí)發(fā)酵罐F2，以與發(fā)酵罐Fl相同的補(bǔ)料速率連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)，剩余的1/2體積的發(fā)酵液繼續(xù)連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)^#F1、F2的發(fā)酵液體積分別達(dá)到發(fā)酵罐容積的70~80%，以0.005-0.ΟΙ/h稀釋率D向F1、F2流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，同時(shí)以與補(bǔ)料相同的速率，由F1、F2共同向下一級(jí)發(fā)酵罐F3連續(xù)輸出發(fā)酵醪液，待F3發(fā)酵液體積與F1、F2分別相等時(shí)，終止發(fā)酵，發(fā)酵周期為7~10天；稀釋率D定義為:補(bǔ)料培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率M與發(fā)酵罐中發(fā)酵液體積V的比值，M的單位為L/h，V的單位為L ;
3)木聚糖酶的提純:發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾機(jī)進(jìn)行過濾，所得過濾液采用有機(jī)膜進(jìn)行超濾，濃縮至所需倍數(shù)；然后加入防腐劑，得液體木聚糖酶產(chǎn)品；
4)發(fā)酵液殘?jiān)奶幚?將經(jīng)過板框壓濾機(jī)所得的發(fā)酵液殘?jiān)鳛樵嫌糜谡託獍l(fā)電。
[0007]步驟I)中所述三角瓶種子培養(yǎng)基、一級(jí)種子罐及二級(jí)種子罐的組成均為，以質(zhì)量百分比計(jì)，葡萄糖1.5%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.6%，玉米漿2%，余量為水。
[0008]步驟2)中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成為，以質(zhì)量百分比計(jì)，葡萄糖2~3%，乳糖0.5-1.0%，玉米漿2.0-3.0%，硫酸銨0.4-0.6%，磷酸二氫鉀0.2-0.4%，硫酸鎂0.1-0.2%，氯化鈣0.05-0.1%，微量元素0.05-0.2%，余量為水。
[0009]步驟2)中所述補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為，以質(zhì)量百分比計(jì)，玉米漿1.5-2.0%，硫酸銨0.5-0.7%，磷酸二氫鉀 0.4-0.6%，硫酸鎂 0.2-0.4%，氯化鈣 0.1-0.2%，微量元素 0.05-0.1%，其余為淀粉酸解液；所述淀粉酸解液中葡萄糖的含量為15~20重量％。
[0010]所述淀粉酸解液是通過如下制備方法獲得的:用0.4-0.6重量％的鹽酸溶液將淀粉配制成15~20重量％的淀粉漿，于110~115°C下酸解30min，酸解結(jié)束后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.5~5.0之間，備用。
[0011]進(jìn)一步的，所述微量元素的組成為，以質(zhì)量百分比計(jì)，鉬酸銨0.04%，硫酸鋅0.2%，硫酸亞鐵0.3%，硫酸錳0.1%，氯化鈷0.15%，硫酸銅0.1%，余量為水。
[0012]進(jìn)一步的，步驟3)中所述有機(jī)膜為膜分子量為10000道爾頓的有機(jī)膜。
[0013]進(jìn)一步的，步驟3)中所述防腐劑的組分配比為:氯化鈉7g~10g，苯甲酸鈉0.1g?0.3g0
[0014]由于本發(fā)明一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法，包括I)菌種的制備及擴(kuò)大培養(yǎng)、
2)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)、3)木聚糖酶的提純和4)發(fā)酵液殘?jiān)奶幚?，該方法無廢棄物排出，環(huán)保無污染，具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明方法采用連續(xù)發(fā)酵，能夠在不增加固定資產(chǎn)投入的情況下提高設(shè)備利用率，提高產(chǎn)能，提高酶活力水平，并使生產(chǎn)效率提高20~30%。
[0015](2)本發(fā)明方法可降低單位酶活力發(fā)酵成本，保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；單位酶活力發(fā)酵成本降低10~15%，批次之間酶活力水平偏差低于5%。
[0016](3)本發(fā)明所產(chǎn)生的菌體殘?jiān)幸欢ǖ牡?，用于沼氣發(fā)電可減少環(huán)境污染，同時(shí)生產(chǎn)清潔能源。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步清楚闡述本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本發(fā)明更為徹底的理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明可以無需一個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本發(fā)明發(fā)生混淆，對(duì)于本領(lǐng)域公知的一些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。
[0018]本申請(qǐng)是發(fā)明人在2014年申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?014106385309 —種木聚糖酶的液態(tài)深層發(fā)酵方法的基礎(chǔ)上，跳出傳統(tǒng)思維局限，經(jīng)過深入探索和研究，積極提出的全新的木聚糖酶生產(chǎn)方法。本申請(qǐng)以申請(qǐng)?zhí)枮?014106385309的專利文件中記載的實(shí)施例3為對(duì)比例1，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的創(chuàng)新性。對(duì)比例I的具體實(shí)施細(xì)節(jié)在該專利文件中有詳細(xì)而明確的記載，不再贅述。
[0019]對(duì)比例I中，木聚糖酶的酶活力為3485.65U/mL，單罐單批發(fā)酵液總量97.6噸。
[0020]本發(fā)明中，所述PDA斜面培養(yǎng)基的配方為:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克、自來水1000毫升、自然PH，其制作方法為本領(lǐng)域