一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測生物學(xué)樣品中CRNN基因，或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物的表達(dá)水平來診斷骨關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述產(chǎn)品在骨關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因CRNN，并進(jìn)一步證實該CRNN基因或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)下調(diào)。利用該基因檢測骨關(guān)節(jié)炎不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。
【專利說明】
一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，0A)是關(guān)節(jié)軟骨隨時間逐漸退化的慢性疾病，所述關(guān) 節(jié)軟骨覆蓋在骨末端，形成關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面。據(jù)報道有許多因素使患者易患骨關(guān)節(jié)炎，包括遺 傳易感性、肥胖癥、意外或運動創(chuàng)傷、手術(shù)、藥物和重體力需求。骨關(guān)節(jié)炎被認(rèn)為是從關(guān)節(jié)軟 骨的損傷開始的。最普遍的兩種對關(guān)節(jié)的損傷是運動相關(guān)損傷和長期"反復(fù)使用"關(guān)節(jié)損 傷。最經(jīng)常受骨關(guān)節(jié)炎影響的關(guān)節(jié)是膝、髖和手。在多數(shù)情況下，由于膝和髖必要的承重功 能，這些關(guān)節(jié)中的骨關(guān)節(jié)炎比手骨關(guān)節(jié)炎更易導(dǎo)致殘疾。隨著軟骨退化的發(fā)展，關(guān)節(jié)中和關(guān) 節(jié)周圍的其他組織(包括骨、肌肉、韌帶、半月板和滑膜）中發(fā)生次級變化。軟骨組織初級衰 竭和其他組織次級損傷的凈效應(yīng)是患者發(fā)生疼痛、腫脹、虛弱和患病關(guān)節(jié)喪失機能。這些癥 狀經(jīng)常發(fā)展到具有嚴(yán)重影響的程度，如使患者喪失勞動力或影響生活質(zhì)量。
[0003] 關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞、II型膠原、蛋白聚糖和水組成。關(guān)節(jié)軟骨沒有血或神經(jīng) 分布，軟骨細(xì)胞是該組織中僅有的細(xì)胞類型。軟骨細(xì)胞負(fù)責(zé)制造軟骨基質(zhì)的II型膠原和蛋 白聚糖。其后該基質(zhì)又具有允許用水使基質(zhì)飽和的物理化學(xué)特性。這種結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的凈 效應(yīng)是關(guān)節(jié)軟骨具有特殊的耐磨特征，并且關(guān)節(jié)軟骨面之間發(fā)生幾乎無摩擦的移動。在未 患骨關(guān)節(jié)炎時，關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)常在甚至高需求的身體條件下提供終生的無痛承重和無限制的 關(guān)節(jié)移動。
[0004] 與所有的活組織一樣，關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)地經(jīng)歷更新過程，其中去除（分解代謝活性） "老"細(xì)胞和基質(zhì)組分并產(chǎn)生(合成代謝活性）"新"細(xì)胞和分子。相對于多數(shù)組織，關(guān)節(jié)軟骨 的合成代謝或分解代謝周轉(zhuǎn)率較低。成熟軟骨結(jié)構(gòu)完整性的長期維持依賴于基質(zhì)合成和降 解之間適當(dāng)?shù)钠胶狻＼浌羌?xì)胞通過應(yīng)答于來自其環(huán)境中的化學(xué)和機械刺激維持基質(zhì)平衡。 軟骨細(xì)胞對這些刺激合適并有效的應(yīng)答是軟骨動態(tài)平衡所必需的。通過合成代謝活性不足 或分解代謝活性過剩破壞動態(tài)平衡可引起軟骨降解和骨關(guān)節(jié)炎（Adams等，1995， Nature377Suppl :3-174)。多數(shù)受到損傷和分解代謝活性提高的組織能夠啟動增強的合成 代謝應(yīng)答，允許組織復(fù)原。不幸的是，關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)答于軟骨基質(zhì)損傷或消耗而上調(diào)其合成代 謝活性以及提高合成蛋白聚糖和II型膠原的能力非常有限。
[0005] 現(xiàn)有的骨關(guān)節(jié)炎治療方法包括運動、藥物、休息和關(guān)節(jié)保健、手術(shù)、疼痛緩解技術(shù)、 替代治療和體重控制。治療骨關(guān)節(jié)炎中常用的藥物包括非留族抗炎藥如阿司匹林、布洛芬 等;直接用于皮膚的局部疼痛緩解乳膏、橡膠和噴霧劑等。可進(jìn)行手術(shù)以使骨表面重建、骨 復(fù)位和置換關(guān)節(jié)。盡管各種藥物療法已被用于治療疾病，但是它們對長期控制和預(yù)防是無 效的。此外，由于骨關(guān)節(jié)炎隱匿式發(fā)生并且發(fā)展緩慢，因此骨關(guān)節(jié)炎經(jīng)常在疾病發(fā)展的晚期 才得到鑒定，而不是潛在治療可能更有效的疾病發(fā)展早期。因此預(yù)防、改變或治療骨關(guān)節(jié)炎 疾病過程中的進(jìn)一步發(fā)展嚴(yán)重依賴于鑒定疾病的早期診斷標(biāo)志物，從而允許早期干涉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了實現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種新的骨關(guān) 節(jié)炎相關(guān)基因，以及該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物。
[0007] 本發(fā)明的還一目的是提供該骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物在檢測骨關(guān)節(jié)炎中 的應(yīng)用。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通 過檢測生物學(xué)樣品中CRNN基因，或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物的表達(dá)水 平來診斷骨關(guān)節(jié)炎。
[0009] 更進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)，所述CRNN基因，或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍 生物在骨性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)下調(diào)。
[0010]進(jìn)一步地，所述診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。
[0011]優(yōu)選的，所述芯片選自下組：
[0012] (1)基因芯片，所述芯片具有基片和點樣于基片上點樣區(qū)的點樣DNA，所述點樣DNA 包括特異性結(jié)合于骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN基因；
[0013] (2)蛋白質(zhì)芯片，所述芯片具有基片和點樣于基片上點樣區(qū)的點樣蛋白，所述點樣 蛋白包括特異性結(jié)合于骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的抗體，所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN 基因。
[0014]優(yōu)選的，所述試劑盒包括特異性擴增骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因和管家基因的引物對，所 述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN基因。
[0015] 優(yōu)選的，所述特異擴增CRNN基因的引物對如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示。
[0016] 更優(yōu)選的，所述試劑盒還包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶，如lSuperScript_? in;所述 試劑盒還包括具有熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性的酶，如Tap酶。
[0017] 進(jìn)一步地，本發(fā)明公開了所述診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品在骨關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用。
[0018] 具體地，應(yīng)用步驟如下：
[0019] (1)檢測待測樣品中骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因 是CRNN基因；
[0020] (2)將待測細(xì)胞中骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平與對照相比較，CRNN基因表達(dá)下 調(diào)，表明研究對象為骨關(guān)節(jié)炎患者。
[0021] 優(yōu)選地，步驟(2)中判斷下調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群 中骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平至少10%以上的降低。
[0022]優(yōu)選地，步驟(2)中判斷上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群 中骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平低60%。
[0023]優(yōu)選地，步驟(2)中判斷上調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)是骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平比正常人群 中骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的表達(dá)水平低90%。
[0024]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，所述制劑中含有促進(jìn)CRNN 基因表達(dá)的試劑和促進(jìn)CRNN基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑;所述促進(jìn)CRNN基因表達(dá)的試劑包括促進(jìn) 基因轉(zhuǎn)錄的試劑，促進(jìn)基因翻譯的試劑，促進(jìn)CRNN蛋白含量提高的試劑;所述促進(jìn)CRNN基因 表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括促進(jìn)CRNN基因表達(dá)穩(wěn)定性的試劑，促進(jìn)CRNN基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試 劑，促進(jìn)CRNN基因表達(dá)產(chǎn)物功能的試劑。
[0025]本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種:激活分子標(biāo)志物的啟動子、激活分子標(biāo)志物表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)分子 標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
[0026]優(yōu)選的，所述治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑中含有促進(jìn)CRNN基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體 和/或激活CRNN基因的啟動子和/或激活CRNN基因表達(dá)的蛋白或因子。
[0027]本發(fā)明提供的治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑一方面用于補充內(nèi)源性CRNN蛋白的缺失或 不足，通過提高CRNN蛋白的表達(dá)，從而治療CRNN蛋白缺失導(dǎo)致的骨關(guān)節(jié)炎。另一方面可以用 于促進(jìn)CRNN蛋白的活性或功能，從而治療骨關(guān)節(jié)炎。
[0028]本發(fā)明的有益效果如下：
[0029] 本發(fā)明公開了一種與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因 CRNN，并進(jìn)一步證實該CRNN基因或該基 因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)上調(diào)。利用該基因檢測骨 關(guān)節(jié)炎不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了 治療靶點和重要依據(jù)。
【附圖說明】
[0030] 圖1本發(fā)明中實施例4中骨關(guān)節(jié)炎患者中CRNN基因表達(dá)下調(diào)。
【具體實施方式】
[0031] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。
[0032] 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件 如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版）（科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照 試劑制造廠家所建議的條件。
[0033] 本發(fā)明的發(fā)明人對10例骨性關(guān)節(jié)炎樣本及4例對照樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生 物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選基因 CRNN，現(xiàn)有研究中并沒有CRNN和骨性關(guān)節(jié)炎 相關(guān)的報道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗證，證實了 CRNN在骨性關(guān)節(jié)炎組織中 表達(dá)下調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療骨性關(guān)節(jié)炎。
[0034]本發(fā)明的CRNN基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：
[0035] Genbank登錄號：NCBI GeneID:49860,來源于人類基因組。
[0036]本發(fā)明還采用RT-PCR方法和基因芯片方法檢測上述基因在骨關(guān)節(jié)炎患者和正常 人群中的表達(dá)，并驗證了該基因為骨關(guān)節(jié)炎表達(dá)下調(diào)基因。
[0037]熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的 初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定量。 多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù) 性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。
[0038]基因芯片(genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的?；?芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測 定的方法，在一炔基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的 核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒 光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。
[0039] 基因芯片又稱為DNA微陣列(DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在聚 合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶 基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測。這種方法的優(yōu)點是所需檢測設(shè)備與目前分子 生物學(xué)所用的放射顯影技術(shù)相一致，相對比較成熟。但芯片上探針密度不高，樣品和試劑的 需求量大，定量檢測存在較多問題。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列，通過與熒 光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。這種方法點陣密度可有較大的提高，各個探針在表面上的 結(jié)合量也比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。3)在玻璃等硬質(zhì) 表面上直接合成的寡核苷酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測。該方法把微電 子光刻技術(shù)與DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的 用量，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)，有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?br>[0040] 基因芯片技術(shù)主要包括四個基本要點：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反 應(yīng)和信號的檢測。1、芯片制備，先將玻璃片或硅片進(jìn)行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì) 分子按順序排列在芯片上。2、樣品制備，生物樣品往往是非常復(fù)雜的生物分子混合體，除少 數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)?？蓪悠愤M(jìn)行生物處理，獲取其中的蛋白質(zhì)或 DNA、RNA，并且加以標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度。3、生物分子反應(yīng)，芯片上的生物分子之間的 反應(yīng)是芯片檢測的關(guān)鍵一步。通過選擇合適的反應(yīng)條件使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況 中，減少生物分子之間的錯配比率。4、芯片信號檢測，常用的芯片信號檢測方法是將芯片置 入芯片掃描儀中，通過掃描以獲得有關(guān)生物信息。
[0041] 本發(fā)明的CRNN基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或 人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀 框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA 作為模板，擴增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴增，然后再將 多次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0042] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成 多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0043]目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明的蛋白（或其片段，或其衍生物） 的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還 可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0044]本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而 加以生產(chǎn)（Stewart等人，（1969)Soliod_Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co·,San Francisco;Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以 用手工或自動進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City， CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn) 生全長的分子。
[0045] 本文使用的術(shù)語"骨關(guān)節(jié)炎"指關(guān)節(jié)炎的特定形式，特別是關(guān)節(jié)軟骨隨時間逐漸退 化的慢性疾病，所述關(guān)節(jié)軟骨覆蓋在形成關(guān)節(jié)面的骨末端上。
[0046] 本文使用的術(shù)語"表達(dá)下調(diào)"指對應(yīng)于所表達(dá)基因的序列，其中序列量的測量證 明，與從正常個體或從通過骨關(guān)節(jié)炎分期確定與骨關(guān)節(jié)炎不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個體中 分離的生物學(xué)樣品中的同一基因相比，所述基因在從患骨關(guān)節(jié)炎或通過骨關(guān)節(jié)炎分期確定 的骨關(guān)節(jié)炎已鑒定疾病狀態(tài)的個體中分離的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平降低。根據(jù)本發(fā)明， "表達(dá)下調(diào)"是指通過本發(fā)明方法雜交強度測量的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、 8%、9%、10%或更多的表達(dá)降低，例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更 低。
[0047] 本文使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)類物質(zhì)"（如蛋白質(zhì)、多肽、肽和抗體）的上下文中使用的 術(shù)語"類似物"指這樣的蛋白質(zhì)類物質(zhì)：其與第二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)具有相似或相同的功能， 但不一定包含與所述第二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)相似或相同的氨基酸序列或具有與第二種蛋白 質(zhì)類物質(zhì)相似或相同的結(jié)構(gòu)。具有相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)類物質(zhì)指滿足以下至少一項 的第二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)：
[0048] (a)具有與第二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)的氨基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至 少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少95%或至少99% -致性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)類物質(zhì)；
[0049] (b)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，所述核苷酸序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼第 二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)的至少5個連續(xù)氨基酸殘基、至少10個連續(xù)氨基酸殘基、至少15個連續(xù)氨 基酸殘基、至少20個連續(xù)氨基酸殘基、至少25個連續(xù)氨基酸殘基、至少40個連續(xù)氫基酸殘 基、至少50個連續(xù)氨基酸殘基、至少60個連續(xù)氨基酸殘基、至少70個連續(xù)氨基酸殘基、至少 80個連續(xù)氨基酸殘基、至少90個連續(xù)氨基酸殘基、至少100個連續(xù)氨基酸殘基、至少125個連 續(xù)氨基酸殘基或至少150個連續(xù)氨基酸殘基的核苷酸序列雜交；
[0050] 和(c)由核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，所述核苷酸序列與編碼第二種蛋白質(zhì) 類物質(zhì)的核苷酸序列有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至 少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少 99%-致性。與第二種蛋白質(zhì)類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)類物質(zhì)指具有與第二種蛋白質(zhì)類物 質(zhì)相似的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。
[0051] 本文使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)"、"多肽"和"蛋白質(zhì)類物質(zhì)"可互換使用，指通過肽鍵連 接在一起的氨基酸鏈，任選地可包含天然或非天然氨基酸。任選地，蛋白質(zhì)或多肽可包含除 氨基酸以外的其他分子。所述鏈可以為任何長度，如所述蛋白質(zhì)由通過肽鍵連接在一起的 少于200個、少于175個、少于150個、少于125個、少于100個、少于50個、少于45個、少于40個、 少于35個、少于30個、少于25個、少于20個、少于15個、少于10個或少于5個氨基酸組成。在另 一實施方案中，蛋白質(zhì)由通過肽鍵連接在一起的至少200個、至少250個、至少300個、至少 350個、至少400個、至少450個、至少500個或更多氨基酸組成。
[0052]本文使用的術(shù)語"表達(dá)水平"指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文所述的方法測定 的給定核酸或蛋白質(zhì)的可測量。涉及本發(fā)明生物標(biāo)志物對應(yīng)的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA剪接 變體時，表達(dá)水平可以通過雜交或更多定量測量來測定，例如包括使用SYBR綠、TaqMan和分 子信標(biāo)技術(shù)的定量實時RT PCR。
[0053]本文使用的"對照"指未顯示任何0A癥狀(包括關(guān)節(jié)痛)并且未診斷為關(guān)節(jié)損傷或 0A的個體或個體組。優(yōu)選地，所述對照個體未使用影響0A的藥物，并且未診斷為患有任何其 他疾病。更優(yōu)選地，對照個體具有與測試樣本相比相似的性別、年齡和體重指標(biāo)(BMI)。根據(jù) 本發(fā)明，"對照"還指分離自正常個體的樣品，包括分離自正常個體的總RNA或mRNA。取自對 照個體的樣品可包括分離自樣本組織的RNA，其中RNA分離自樣本組織，所述樣本組織分離 自組織移除時未診斷為0A并且未顯示任何0A癥狀的個體。在本發(fā)明的一個實施方案中，為 半月板損傷及交叉韌帶損傷進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者。
[0054]本文使用的術(shù)語"引物"指存在于純化的限制性消化物中或合成產(chǎn)生的寡核苷酸， 置于誘導(dǎo)合成與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的條件下時，即存在核苷酸和誘導(dǎo)劑(如DNA聚 合酶）以及適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H時，所述寡核苷酸能作為合成的起始點。引物可以為單鏈或雙 鏈，并且必須具有足夠的長度，以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長 度會取決于許多因素，包括溫度、引物來源和使用的方法。例如，就診斷應(yīng)用而言，取決于靶 序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，盡管也可以含有更少的核苷 酸。引物合適長度的確定中涉及的因素為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。一般而言，根據(jù)本領(lǐng) 域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)計和選擇本發(fā)明的引物，參閱Dieff enbach，C. W.，Lowe，T .M. J.， Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.《PCR Primer,A Laboratory Manual》（Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.編輯）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，133-155。
[0055]本文使用的"核酸"，通常指任何多聚核糖核苷酸和多聚脫氧核糖核苷酸，可以是 未修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA或其任何組合。"核酸"包括但不限于單鏈和雙鏈核 酸。本文使用的術(shù)語"核酸"還包括如上文所述含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA。因此， 為了穩(wěn)定性或其他原因修飾了骨架的DNA或RNA為"核酸"。本文使用的術(shù)語"核酸"包括核酸 的這些化學(xué)、酶或代謝修飾的形式以及病毒和細(xì)胞(包括如簡單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞)DNA和RNA 特征的化學(xué)形式。"核酸"或"核酸序列"還可包括單鏈或雙鏈RNA或DNA的區(qū)域或其任何組 合，并可包括本發(fā)明一些實施方案的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST) AST是通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA區(qū)以產(chǎn)生 cDNA而產(chǎn)生的基因的一部分表達(dá)序列（即序列的"標(biāo)簽"）。
[0056]本文使用的"核酸探針"包括能通過一組非共價結(jié)合相互作用(包括互補堿基配對 相互作用）與陣列上核酸成員的互補序列結(jié)合的核酸。本文使用的核酸探針可包含天然（即 A、G、C或T)或修飾堿基(7-脫氮鳥苷、肌苷等）。此外，核酸探針中的堿基可以通過磷酸二酯 鍵以外的鍵結(jié)合，只要它不干擾雜交（即該核酸探針仍在標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)謹(jǐn)或選擇性雜交條件下與 其互補序列特異性結(jié)合）。因此，核酸探針可以為肽核酸，其中組成堿基通過肽鍵而不是磷 酸二酯鍵結(jié)合。
[0057]本文使用的術(shù)語"生物學(xué)樣品"包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、軟骨、滑膜 組織等樣品。
[0058]本發(fā)明的生物學(xué)樣品
[0059]用于本發(fā)明的生物學(xué)樣品得自任何受試者的任何組織樣品（如軟骨、滑膜、滑液或 血樣)或細(xì)胞樣品（如軟骨細(xì)胞或血細(xì)胞樣品）均可以根據(jù)本發(fā)明方法使用?？梢詮闹蝎@得 這些樣品并根據(jù)本發(fā)明方法使用這些樣品的受試者實例包括但不限于無癥狀受試者、表現(xiàn) 或更多骨關(guān)節(jié)炎癥狀的受試者、臨床診斷為患有骨關(guān)節(jié)炎的受試者、易患骨關(guān)節(jié)炎的受試 者(如有骨關(guān)節(jié)炎家族史的受試者、有骨關(guān)節(jié)炎遺傳易感性的受試者以及生活方式使其易 感骨關(guān)節(jié)炎或提高患骨關(guān)節(jié)炎可能性的受試者）、懷疑患有骨關(guān)節(jié)炎的受試者、正接受骨關(guān) 節(jié)炎治療的受試者、患有骨關(guān)節(jié)炎和非接受骨關(guān)節(jié)炎治療的受試者、開業(yè)醫(yī)生(如醫(yī)師)確 定為健康或無骨關(guān)節(jié)炎的受試者（即正常）、已治愈骨關(guān)節(jié)炎的受試者、正在控制其骨關(guān)節(jié) 炎的受試者和未診斷為骨關(guān)節(jié)炎的受試者。在一個具體的實施方案中，可獲得樣品并使用 的受試者患手、足、脊柱、膝、髖和/或腕骨關(guān)節(jié)炎。
[0060]軟骨、滑膜
[00611在一個方面中，根據(jù)本領(lǐng)域已知并描述于下文的方法從生存的正常個體或死后14 小時以內(nèi)的軟骨組織獲得軟骨樣品或滑膜樣品。使用任何已知方法獲得來自成人的正常關(guān) 節(jié)軟骨，如軟骨或滑膜得自接受關(guān)節(jié)鏡手術(shù)或全膝置換術(shù)的個體，樣品在液氮中保存待用。 由于倫理考慮，通常不能從活供體中廣泛采樣真實的正常軟骨或滑膜。因此，優(yōu)選地，在14 小時的死后窗口中在停止對采樣關(guān)節(jié)灌注后從死亡供體獲得正常軟骨或滑膜樣品，以使觀 察到的RNA降解最小。在另一方面中，軟骨或滑膜得自診斷為骨關(guān)節(jié)炎的受試者。使用任何 已知技術(shù)獲得來自骨關(guān)節(jié)炎個體的人關(guān)節(jié)樣品。優(yōu)選地，將關(guān)節(jié)樣品保存在液氮中待用。在 一個具體實施方案中，分離至少0.05g軟骨或滑膜樣品，以獲得2yg總RNA提取物?？筛鶕?jù)本 發(fā)明使用的軟骨或滑膜樣品為足以檢測一種或多種本發(fā)明核酸序列或氨基酸序列的量。
[0062] 滑液
[0063] 在一個方面中，使用本領(lǐng)域熟知的方法從受試者獲得滑液樣品。例如，可以進(jìn)行關(guān) 節(jié)穿刺。在關(guān)節(jié)穿刺中，使用無菌針從關(guān)節(jié)中移出滑液?？梢允褂藐P(guān)節(jié)穿刺從膝、肘、腕、指、 髖、脊柱或任何其他關(guān)節(jié)收集滑液。在一個具體的實施方案中，滑液收集自患骨關(guān)節(jié)炎或懷 疑患骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)。滑液可得自患0A、未患0A的受試者或得自測試受試者。
[0064] 可根據(jù)本發(fā)明使用的滑液樣品為足以檢測一種或多種本發(fā)明核酸序列或氨基酸 序列的量。在一個具體實施方案中，可根據(jù)本發(fā)明使用的滑液樣品的量范圍從O.lmL至 20mL、0.lmL至15mi、0.lmL至10mL、0.lmL至5mL、0.1至2mL、0.5mL至20mL、0.5mL至15mL、 0·5mL至1OmL、0·5mL至 5mL或 0·5mL至 2mL 〇
[0065] 在本發(fā)明的一些實施方案中，使用本領(lǐng)域已知的方法分離滑液中存在的細(xì)胞，并 根據(jù)本發(fā)明方法使用。通常在滑液中可見以下細(xì)胞:淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞）、單核細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在來自病理狀態(tài)(如骨關(guān)節(jié)炎）的患者的滑液中還可 見以下細(xì)胞:軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法分離并使用這些細(xì) 胞。在一個具體實施方案中，從滑液樣品中分離淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)并根據(jù)本發(fā)明方 法使用。在另一實施方案中，從滑液樣品中分離單核細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞并根據(jù)本發(fā)明方 法使用。在用于本發(fā)明方法前，可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)冷凍分離自滑液的細(xì)胞。
[0066] 血
[0067] 在本發(fā)明的一個方面中，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法從受試者中獲得血樣。可以使用 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(特別是已知的采血方法)從受試者的任何身體部位(如指、手、 腕、臂、腿、足、踝、胃和頸)取血。在一個具體的實施方案中，從受試者獲得靜脈血并根據(jù)本 發(fā)明方法使用。可以使用真空管、注射器或蝶形針取血。
[0068] 采血量將取決于采血部位、本發(fā)明方法需要的量和受試者的舒適度而變化。如在 多個具體的實施方案中，從受試者收集〇. 001mL、0.005mL、0.01mL、0.05mL、0. lmL、0.15mL、 Ο · 2mL、0 · 25mL、0 · 5mL、0 · 75mL、lmL、1 · 5mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL 或更多血。將血保 存在K3/EDTA管中。
[0069] 在一個方面中，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的采血方法從正常個體或者從診斷為患骨關(guān)節(jié)炎 或懷疑患骨關(guān)節(jié)炎的個體取全血。全血包括可直接使用的血，并包括已經(jīng)根據(jù)本領(lǐng)域熟知 的方法(例如優(yōu)選在300-800 Xg溫和離心5-10分鐘）除去血清或血漿并且已經(jīng)從剩余血樣 中分離了RNA或mRNA的血。在一個具體的實施方案中，將得自受試者的全血（即未分級血)與 裂解緩沖液（如裂解緩沖液（1L): 0.6g EDTA; 1.0g KH⑶2，8.2gNH4Cl，用NaOH調(diào)整至到 PH7.4)混合，離心樣品并保留細(xì)胞沉淀，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法提取RNA或mRNA( "裂解血"） (參閱如Sambrook等）。優(yōu)選使用全血，因為它避免了昂貴耗時的分離血中細(xì)胞類型的步驟 (Kimoto, 1998,Mol.Gen.Genet258：233-239；Chelly J等，1989， Proc·Nat·Acad·Sci·USA86:2617-2621;Chelly J等，1988，Nature333:858-860)〇
[0070] 在本發(fā)明的一些實施方案中，將收集自受試者的全血進(jìn)行分級（即分離成組分）。 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)從收集自受試者的全血分離血細(xì) 胞。例如，可以對收集自受試者的血進(jìn)行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)梯度離心。這種離心 將紅細(xì)胞(血紅細(xì)胞)與各種類型的有核細(xì)胞和血漿分離開。具體地，F(xiàn)i co 11-Hypaque梯度 離心可用于分離外周血白細(xì)胞(PBL)，它們可根據(jù)本發(fā)明方法使用。其他全血分離方法按照 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行操作。
[0071] 在根據(jù)本發(fā)明方法使用前，任選地(但優(yōu)選)將收集的生物學(xué)樣品保存在低溫如4 °(：下。在一些實施方案中，在第一時間根據(jù)本發(fā)明方法使用樣品的一部分，而將一個或多個 剩余的樣品部分保存一段時間以備后用。該段時間可以是1小時或更長、1天或更長、1周或 更長、1月或更長、1年或更長或不確定。就長期保存而言，可以使用本領(lǐng)域熟知的保存方法， 例如在冷凍溫度(如低于_80°C)保存。在一些實施方案中，作為保存樣品的補充或替代，將 分離的核酸或蛋白質(zhì)保存一段時間（如1小時或更長、1天或更長、1周或更長、1月或更長、1 年或更長或不確定）以備后用。
[0072] 實施例1高通量測序篩選差異表達(dá)基因
[0073] 1、取樣
[0074]取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診骨性關(guān)節(jié)炎患者，病例 組共收集10例，對照來源于同時期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。獲取所有研究對 象的滑液樣本，編號后置_80°C低溫冰箱保存。
[0075]病例組均符合膝關(guān)節(jié)0A診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者;對照組為半 月板損傷及交叉韌帶損傷進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者。根據(jù)1995年美國風(fēng)濕協(xié)會骨性關(guān)節(jié) 炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為重度骨性關(guān)節(jié)炎，有膝關(guān)節(jié)置換指征的患者病例。
[0076] 其中，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1995年美國風(fēng)濕病協(xié)會所制定的標(biāo)準(zhǔn)：
[0077] (1)1個月內(nèi)大多數(shù)時間有膝痛；
[0078] (2)關(guān)節(jié)活動時響聲；
[0079] (3)晨僵不大于30分鐘；
[0080] (4)年齡不小于40歲；
[0081] (5)膝關(guān)節(jié)骨性腫脹伴彈響；
[0082] (6)膝關(guān)節(jié)骨性腫脹不伴有彈響。
[0083]最少存在（（1)、（2)、（3)、（4)或（1)、（2)、（3)、（5)或（1)、（6)即可診斷0八。
[0084] 2、對滑液進(jìn)行總RNA提取
[0085] 采用TRlzol? Reagent (invitrogen，貨號 15596-018)進(jìn)行樣本 RNA 提取，實驗操 作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：
[0086] 收集樣本后凍存于液氮，取出后把滑液放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣 本成粉末狀后：
[0087] ①加入Trizol，室溫保存5分鐘；
[0088]②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；
[0089]③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70% )到另一新離心管管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上10分鐘；
[0090] ④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按I mL/mL Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗漆沉淀(4°C保存），洗漆沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5分鐘； [0091]⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0092] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-SOt^RNA質(zhì)量判 定標(biāo)準(zhǔn):RNA樣本的0D260/0D280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶； 70°C水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。
[0093] 3、RNA樣品的質(zhì)量分析
[0094] RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與 否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品的 提取情況，1?熟-869測序的樣品要求:00260/00280為1.8-2.2。
[0095] 4、高通量測序
[0096] 測序平臺為Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度 測序，測序后我們運用 Fast_QC(http: //www · bioinf ormatics · babraham. ac · uk/pro jects/ fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分 布，GC含量，PCR dup 1 i cat ion含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時，根據(jù)得到 的FPKM值，采用國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時，L0G2FO1或<-l，F(xiàn)DR〈 〇.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對差異表達(dá)基因進(jìn)行了Gene Onlogy和信 號通路分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù) 分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)基因 CRNN，該基因在骨性關(guān)節(jié)炎樣本組織中表 達(dá)下調(diào)。
[0097] 實施例2RT-PCR驗證骨性關(guān)節(jié)炎患者及對照滑液CRNN基因表達(dá)情況
[0098] 1、材料
[0099]選取42例骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織及8例對照軟骨組織，對其進(jìn)行分組及編號。病 例組均符合膝關(guān)節(jié)0A診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)人工關(guān)節(jié)置換術(shù)患者;對照組為半月板損傷及 交叉韌帶損傷進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療的患者。
[0100] 2、方法
[0101] 2.1對滑液進(jìn)行總RNA提取，同實施例1的提取方法。
[0102] 2.2逆轉(zhuǎn)錄合成〇0嫩
[0103] 米用Superscript? III Reverse Transcriptase(invitrogen，貨號 18080-044) 進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：
[0104] 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lyg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25yL 反應(yīng)體系，每個樣品取lyg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20 °C冰箱備用。
[0105] 2.3Real-Time PCR
[0106] 2.3.1儀器及分析方法
[0107]用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-AACT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。
[0108] 2.3.2引物設(shè)計
[0109] 采用在線引物設(shè)計軟件，基因序列參照NCBI:Gene ID:69860(CRNN)，內(nèi)參選 GAPDH，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表1所示：
[0110]表1引物序列 [0111]
[0112] 操作過程如下：
[0113] (一）反應(yīng)體系：用Power SYBR?Green PCR Master Mix( invitrogen，貨號 4367659)進(jìn)行擴增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴增程序為:95°5!1^11，（95°(：1586(3,61 1€ 45sec，72°C35sec) X40個循環(huán)。
[0114] 表2RealTime反應(yīng)體系
[0117] (二）引物篩選
[0118] 將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2yL作模板， 分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴增，同時在60-95Γ進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴 增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。
[0119] (三）樣品 RealTime-PCR 檢測
[0120]將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2yL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn) 行擴增。同時在60-95 °C進(jìn)行溶解曲線分析。
[0121] 二、實驗結(jié)果
[0122] 實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效 率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高;樣本擴增產(chǎn)物溶 解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增;根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式:2_ Δ CtX 100%，比較CRNN基因在骨性關(guān)節(jié)炎組織和對照組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:qRT-PCR擴增結(jié)果穩(wěn)定，其中CRNN基因在骨性關(guān)節(jié)炎組織中的表達(dá)水平僅為對照組織的25%，以 上結(jié)果驗證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析CRNN基因在骨性關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)下調(diào) 的結(jié)果。
[0123] 實施例3基因芯片驗證骨性關(guān)節(jié)炎患者及對照滑液CRNN基因表達(dá)情況
[0124] 1、材料的取得，同實施例2。
[0125] 2、總RNA的提取，同實施例1的方法。
[0126] 3、基因芯片驗證
[0127] 總RNA經(jīng)線性化擴增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0128] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0129] 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著意義。結(jié)果顯示，與正常人相比，骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中CRNN基因的mRNA水平 僅為21%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。
[0130] 實施例4試劑盒的制備
[0131] 基于實施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于檢測骨關(guān)節(jié)炎的試劑盒，所述 試劑盒包括特異擴增CRNN基因的引物對如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示，和特異擴增管 家基因（GAroH)的引物對如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈 式反應(yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBR Green熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mM KCL，2.5mM MgCL2,200mM(NH4)2S〇4〇
[0132] 通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表3所示：
[0133] 表3PCR反應(yīng)體系

[0135] 最佳反應(yīng)條件為：
[0136] 95° 預(yù)變性5min，（95°C變性 15sec，61°C退火45sec，72°C延伸35sec) X 40個循環(huán)， 72°C 延伸 15min。
[0137] 實施例5試劑盒對骨關(guān)節(jié)炎的性能驗證
[0138] 1、病例
[0139] 取60例待檢骨關(guān)節(jié)炎病人和10例正常人的滑液組織，待檢骨關(guān)節(jié)炎病人為北京協(xié) 和醫(yī)院骨科就診骨性關(guān)節(jié)炎患者，10例正常人來自于該醫(yī)院骨科，為外傷手術(shù)病人關(guān)節(jié)滑 液組織。本研究的所有臨床樣本，均對患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會通過。
[0140] 2、方法
[0141] 使用常規(guī)方法或使用特定的試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實施例4中的試劑 盒進(jìn)行檢測反應(yīng)。
[0142] 3、結(jié)果
[0143] 通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，△ ACt法進(jìn)行相對定量，結(jié)果如圖1所 示，與正常組織相比，CRNN基因在骨關(guān)節(jié)炎患者中表達(dá)僅是正常人群的20%，證明該基因表 達(dá)下調(diào)。所以，用該基因檢測骨關(guān)節(jié)炎不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治 療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。
[0144] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測生物學(xué)樣品中CRNN 基因，或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物的表達(dá)水平來診斷骨關(guān)節(jié)炎。2. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述CRNN基因，或該基因的表達(dá)蛋白及其片 段、類似物和衍生物在骨性關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)下調(diào)。3. 如權(quán)利要求1或2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片或試劑盒。4. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述芯片選自下組： (1) 基因芯片，所述芯片具有基片和點樣于基片上點樣區(qū)的點樣DNA，所述點樣DNA包括 特異性結(jié)合于骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的探針，所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN基因； (2) 蛋白質(zhì)芯片，所述芯片具有基片和點樣于基片上點樣區(qū)的點樣蛋白，所述點樣蛋白 包括特異性結(jié)合于骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的抗體，所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN基 因。5. 如權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒包括:特異性擴增骨關(guān)節(jié)炎相關(guān) 基因和管家基因的引物對，所述骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因是CRNN基因。6. 如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述特異擴增CRNN基因的引物如SEQIDNO: 1 和 SEQIDN0:2所示。7. 如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒還包括具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。8. 如權(quán)利要求5至7任意一項所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑盒還包括具有熱穩(wěn)定 DNA聚合酶活性的酶。9. 權(quán)利要求1至8任意一項所述產(chǎn)品在骨關(guān)節(jié)炎診斷中的應(yīng)用。10. -種治療骨性關(guān)節(jié)炎的制劑，其特征在于，所述制劑中含有促進(jìn)CRNN基因表達(dá)的試 劑和促進(jìn)CRNN基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。
【文檔編號】G01N33/68GK105950714SQ201610269633
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】范彧, 林進(jìn), 翁習(xí)生, 邱貴興, 金今, 錢文偉, 陳俊, 馬培, 楊躍梅
【申請人】范彧