用于結(jié)直腸癌早期診斷的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及疾病相關(guān)DNA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及結(jié)直腸癌受試者早期血漿DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定區(qū)域甲基化實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒。所述定量檢測(cè)試劑盒是通過PCR引物及Taqman探針來完成檢測(cè)的。
【專利說明】
用于結(jié)直腸癌早期診斷的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及疾病相關(guān)DNA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及結(jié)直腸癌受試者早期血漿 DNA中rRNA_pseudogene，HECTDl和ZNF843基因的特定區(qū)域甲基化實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌是世界上第三大惡性腫瘤，近年來中國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率由7%激增到13%。 結(jié)直腸癌發(fā)病與生活方式、遺傳、大腸腺瘤等關(guān)系密切，且發(fā)病年齡趨老年化。結(jié)直腸癌早 期癥狀不明顯，僅感不適、消化不良、大便潛血等。目前的血腫瘤標(biāo)記物如癌胚抗原檢測(cè)，有 助于腫瘤的診斷。此外，結(jié)腸鏡檢查可以檢查結(jié)腸和直腸腸腔，并在檢查過程中進(jìn)行活檢和 治療。盡管活體組織檢查對(duì)結(jié)直腸癌的早期癌變和息肉癌變的確診有決定性意義，但其侵 入性的操作限制了在人群中進(jìn)行結(jié)直腸癌的早發(fā)普查。此外，脫落細(xì)胞學(xué)檢查盡管準(zhǔn)確性 高，但其取材繁瑣，且不易獲得滿意的標(biāo)本，臨床應(yīng)用較少。
[0003] DNA甲基化是一種表觀遺傳學(xué)修飾，大量研究表明DNA甲基化的異常變化可引起基 因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因 表達(dá)。因此，表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤形成和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。近年來研究表明， DNA異常甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)也有多個(gè)基因的異常高甲基化 在結(jié)直腸癌中頻繁發(fā)生。因此，DNA異常甲基化有望作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。 循環(huán)DNA是指腫瘤細(xì)胞在增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程中不斷釋放進(jìn)入血漿或血清中的游離DNA。 研究人員在多種惡性腫瘤患者的血清或血漿中發(fā)現(xiàn)了甲基化的游離DNA。熒光定量PCR是通 過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，能實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，并 結(jié)合相應(yīng)的軟件進(jìn)行產(chǎn)物分析的PCR技術(shù)。該方法較其他傳統(tǒng)甲基化檢測(cè)方法在時(shí)間上大 幅縮減，同時(shí)，可以對(duì)極微量的DNA基因水平上的改變進(jìn)行檢測(cè)和定量，解決血漿中DNA含量 少、丟失率尚、DNA降解、帶有致癌污染物等缺陷，使腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的尚甲基化在癌癥 患者的血漿中檢測(cè)出來。因此，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)腫瘤患者中血漿游離DNA的表觀遺傳變化對(duì)腫 瘤的早期診斷、療效評(píng)估、發(fā)生機(jī)制等研究具有重要意義，更加適合醫(yī)院或科研院所操作。
[0004] 目前，對(duì)血漿游離DNA中基因的異常甲基化檢測(cè)已成為腫瘤分子診斷學(xué)中無創(chuàng)診 斷的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。本項(xiàng)目開發(fā)計(jì)劃采用分析早期結(jié)直腸癌患者血漿或血清中游離 DNA的核糖體RNA假基因 （rRNA pseudogene)、HECT結(jié)構(gòu)域泛素蛋白鏈接酶1(HECT domain containing E3ubiquitin protein 1 igase 1，HECTD1)和鋅指蛋白843(zinc finger protein 843，ZNF843)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度，結(jié)合現(xiàn)代的生物信息技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原 理，提供操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、周期短、檢結(jié)果穩(wěn)定可靠的甲基化定量檢測(cè)方法，同時(shí)為患者 的治療隨訪和預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。
[0005] rRNA pseudogene是一類與編碼基因高度相似但不能表達(dá)功能蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)非 編碼基因。過去的研究認(rèn)為假基因是沒有功能的DNA片段，然而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā) 展，人們從測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)在腫瘤轉(zhuǎn)錄組中有大量假基因表達(dá)，這些假基因的表達(dá)不僅具 有癌癥特異性，還具有組織特異性。因此，越來越多的證據(jù)表明，假基因在人類癌癥等疾病 方面扮演著重要的角色。而該基因的甲基化水平異?？赡苡绊懟虻霓D(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn) 了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HECTD1基因表達(dá)在胚胎發(fā)育過程中起重要作用。且有研究表明，在人類 神經(jīng)管缺陷中，HECTD1基因是一個(gè)候選的易感基因。而其表觀遺傳學(xué)方面在國(guó)內(nèi)外的研究 中仍是空白。ZNF843是鋅指蛋白家族的成員之一。目前被報(bào)道的部分鋅指蛋白家族成員基 因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如肝細(xì)胞癌中ZNF331基因啟動(dòng)子區(qū)高甲 基化高達(dá)80%，提示該基因啟動(dòng)子甲基化可作為臨床對(duì)肝癌早期診斷的候選指標(biāo)。
[0006] 目前，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于在結(jié)直腸癌中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)rRNA pSeud〇gen e、HECTDl和ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的檢測(cè)試劑盒相關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供一種用于結(jié)直腸癌早期診斷的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試 劑盒;其通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)受試者血漿或血清樣本中游離DNA的rRNA_p Seud〇gene， HECTD1和/或ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化，來輔助判斷結(jié)直腸癌的易感性或發(fā)病。 [0008]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述定量檢測(cè)試劑盒是通過PCR引物及Taqman探針 來完成檢測(cè)的，其包含檢測(cè)rRNA_pseudogene基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列； 所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如下：
[0018]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述定量檢測(cè)試劑盒還包含檢測(cè)HECTD1基因啟動(dòng) 子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如 下：

[0046]在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述定量檢測(cè)試劑盒還包含檢測(cè)ZNF843基因啟動(dòng) 子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如 下：

[0074]在本發(fā)明中，上述核苷酸序列分別針對(duì)不同目的基因進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方 案中，所述定量檢測(cè)試劑盒包含用于檢測(cè)rRNA_pseudogene，HECTDl和/或ZNF843基因啟動(dòng) 子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列中各一組核苷酸序列。例如，包括但不限于，所述試劑盒 中包含的核苷酸序列由組1、組4和組13組成;或者所述試劑盒中包含的核苷酸序列由組2、 組6和組20組成。
[0075]在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述試劑盒包含用于檢測(cè)ACTB基因甲基化程度的 核苷酸序列，具體如下：
[0079] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述定量檢測(cè)試劑盒還包含如下組分：2XG〇ldStar TaqMan Mixture、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。進(jìn)一步地，所述陽性對(duì)照可以為Qiagen EpiTect methylated DNA;所述陰性對(duì)照為Qiagen EpiTect unmethylated DNA。
[0080] 本領(lǐng)域公知，ACTB基因作為參照基因廣泛應(yīng)用于DNA甲基化檢測(cè)中。
[0081] 在本發(fā)明中，所述試劑盒的檢測(cè)方法如下：20μ1的熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成 為：2XGoldstar TaqMan Mixture lO.Oul;上、下游引物各 1·0μ1(5μΜ);探針 1·0μ1(2μΜ); Η20 5. ΟμL，DNA樣本模板2. ΟμL。熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：（1 )95°C預(yù)變性lOmin; (2)95°C 變性15s，60 °C復(fù)性45s，共45個(gè)循環(huán)，期間連續(xù)采集熒光信號(hào)；（3)40°C維持。每例標(biāo)本設(shè)三 個(gè)復(fù)孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和Qiagen EpiTect unmethylated DNA作為陽 性、陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。
[0082]在本發(fā)明中，所述DNA樣本可以來源于任何生物樣品；更優(yōu)選地，所述待測(cè)DNA選自 細(xì)胞、組織(包括石蠟包埋組織）、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便、及其他分泌物。
[0083] 在本發(fā)明中，核苷酸序列中"C/T"是指該位置堿基選自C或T中一種堿基，"A/G"是 指該位置堿基選自A或G中的一種堿基。
[0084] 本發(fā)明的目的之二是提供上述試劑盒在制備用于結(jié)直腸癌早期診斷試劑中的應(yīng) 用。
[0085] 本發(fā)明通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)人體血漿或血清中是否存在大腸癌早期目標(biāo)基 因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化，設(shè)計(jì)巧妙，解決血漿中DNA含量少、丟失率高、帶有致癌污染物 等缺陷，相對(duì)傳統(tǒng)結(jié)直腸癌檢測(cè)技術(shù)具有發(fā)現(xiàn)早，靈敏度高，周期短等顯著優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果 穩(wěn)定可靠。該目標(biāo)基因是由rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843所組成。
【附圖說明】
[0086] 圖1是MethyLight熒光定量rRNA pseudogene基因的PCR擴(kuò)增曲線（組1-組3);
[0087] 圖2是MethyLight熒光定量HECTD1基因的PCR擴(kuò)增曲線（組4-組12);
[0088] 圖3是MethyLight熒光定量ZNF843基因的PCR擴(kuò)增曲線（組13-組21);
[0089] 圖4是MethyLight熒光定量ACTB基因的PCR擴(kuò)增曲線(組22)。
【具體實(shí)施方式】
[0090]下面將結(jié)合附圖進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對(duì)本 發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范 圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0091]需要指出的是，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（Sambrook J，et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd Ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0092] 實(shí)施例1
[0093] 1、研究對(duì)象和樣本的收集
[0094]本研究收集了來自寧波市醫(yī)院的100例結(jié)直腸癌患者和100例健康人，所有患者均 經(jīng)病理確診。用含EDTA-K2的5ml帶蓋無菌塑料抗凝管抽取人外周靜脈血2ml，室溫狀態(tài)下放 置48小時(shí)內(nèi)以3000rpm離心10min，收集血衆(zhòng);再次以12000rpm離心10min，獲得無血細(xì)胞成 分的血漿，以1.5ml的離心管以每管200μ1分裝，-80°C保存，用于日后血漿標(biāo)本全基因組DNA 提取。所有研究對(duì)象都簽署知情同意書。
[0095] 2、血漿全基因組DNA的提取
[0096] 取血衆(zhòng)200μ1，使用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取游 離DNA，提取過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。再通過NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)所得DNA的純度和濃度備用。
[0097] 3、甲基化修飾
[0098] 米用EZ DNA Methylation Gold? Kit甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒（Zymo research，美國(guó)）， 嚴(yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作。經(jīng)此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟?嘧啶(U)。
[0099] 4、MethyLight 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR
[0100] 20μ1 的熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成為：2XGoldstar TaqMan Mixture 10·0μ1; 上、下游引物各1.0μ1 (5μΜ);探針1.0μ1 (2μΜ) ;Η20 5.0μ1，樣本模板2.0μ1。熒光定量PCR反 應(yīng)條件如下：（l)95°c預(yù)變性10min;(2)95°C變性15s，60°C復(fù)性45s，共45個(gè)循環(huán)，期間連續(xù) 采集熒光信號(hào)；（3)40°C維持。每例標(biāo)本設(shè)三個(gè)復(fù)孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和 Qiagen EpiTect unmethylated DNA作為陽性、陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照。
[0101 ]本實(shí)施例中，采用的引物及Taqman探針序列如下：
[0102] rRNA_pseudogene 基因甲基化檢測(cè)：
[0106] HECTD1基因甲基化檢測(cè)：
[0118] 5、數(shù)據(jù)計(jì)算
[0119] Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀的計(jì)算過程是首先通過ACTB參照基因來 對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量，然后再用陽性對(duì)照DNA的相對(duì)定量對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品值進(jìn)一步作歸一 化處理，通過以下?lián)Q算得到甲基化百分比參數(shù)(PMR):
[0120] PMR=(GENEsample/REFsample)/(GENEPositive/REFPositive) X 100%
[0121] 其中，GENE為目的基因，REF為參照基因，sample為實(shí)驗(yàn)樣本，positive為甲基化陽 性對(duì)照DNA。PMR值越高，代表甲基化水平越高;PMR值越低，代表甲基化水平越低。
[0122] 6、結(jié)果
[0123] 本次實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，Me thyLight結(jié)果運(yùn)用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。我們發(fā)現(xiàn)用161±71^8111:法發(fā)現(xiàn)：在結(jié)直腸癌患者血衆(zhòng)0麻中11?財(cái)_ pseudogene和HECTD1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率低于健康人，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均小 于0.05，見表1)，ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率均高于健康人，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值 均小于0.05,見表1)。
[0124] MethyLight法檢測(cè)rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843啟動(dòng)子區(qū)甲基化，用于診斷 結(jié)直腸癌的敏感性分別為98.3%，96.7%，90%，特異性分別為96.7%，95.0%，91.7%。三 者聯(lián)合檢測(cè)直結(jié)腸癌的靈敏度為100 %，特異性為100 %，診斷準(zhǔn)確率為1。
[0125] 本發(fā)明試劑盒可用于實(shí)時(shí)定量檢測(cè)直結(jié)腸癌患者血清DNA中rRNA_pseudogene， HECTD1和ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度，具有以下顯著特點(diǎn)：（1)操作簡(jiǎn)便，周期短。該試 劑盒可同時(shí)測(cè)定60個(gè)樣本，大大縮短檢測(cè)時(shí)間，適合醫(yī)院或研究所大規(guī)模推廣應(yīng)用。（2)穩(wěn) 定性。該試劑盒在-20°C溫度下可保存12個(gè)月，其靈敏度和特異度都沒有下降。
[0126] 表1MethyLight方法中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水 平在病例組與對(duì)照組間的比較
[0128]注:N表示樣本個(gè)數(shù)，P值小于0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0129] 實(shí)施例2rRNA_pseudogene基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化靈敏度檢測(cè)
[0130] 取實(shí)施例1中的結(jié)腸癌患者血漿樣本(PMR=8.3% );按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行血漿 全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測(cè)DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對(duì)待測(cè)DNA樣 本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1: 25、1:50、1:100、1: 200、1:400、1:600、1:800，然后 按照實(shí)施例1的檢測(cè)方法分別采用組1至組3列出的引物及探針序列對(duì)稀釋的待測(cè)DNA樣本 進(jìn)行檢測(cè)，直至熒光檢測(cè)中在45個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有出現(xiàn)PCR擴(kuò)增曲線，以可以出現(xiàn)擴(kuò)增曲線及可 以計(jì)算CT值的樣本作為最低檢測(cè)限。
[0131] 結(jié)果表明，組1至組3列出的引物及探針序列在待測(cè)DNA樣本稀釋800倍的情況下仍 然可以檢測(cè)rRNA_pSeUd 〇gene基因甲基化程度。在本測(cè)試中，組3的上游引物為5'-CGGGAGTCGCAGGGAAGGGG-3, 。
[0132] 還需要指出的是，針對(duì)組3列出的引物及探針序列，本發(fā)明也進(jìn)行了相關(guān)測(cè)試，并 取得了類似結(jié)果，其中，組3的上游引物序列如下：
[0137] 實(shí)施例3HECTD1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化靈敏度檢測(cè)
[0138] 取實(shí)施例1中的結(jié)腸癌患者血漿樣本(PMR= 12.6 % );按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行血 漿全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測(cè)DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對(duì)待測(cè)DNA 樣本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800，然 后按照實(shí)施例1的檢測(cè)方法分別采用組4至組12列出的引物及探針序列對(duì)稀釋的待測(cè)DNA樣 本進(jìn)行檢測(cè)，直至熒光檢測(cè)中在45個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有出現(xiàn)PCR擴(kuò)增曲線，以可以出現(xiàn)擴(kuò)增曲線及 可以計(jì)算CT值的樣本作為最低檢測(cè)限。
[0139] 結(jié)果表明，組4至組12列出的引物及探針序列在待測(cè)DNA樣本稀釋600倍的情況下 仍然可以檢測(cè)HECTD1基因甲基化程度。
[0140] 本測(cè)試中，組7的下游引物為5'-六了六六六六00^六六六0^了0^0：-3'；
[0141] 組8的下游引物為5'-厶0^厶0：0：1'7^11'0：0：-3'；
[0142] 組 12的上游引物為 5 ' -TTGAATGCGTGTGAAATAAAGTT-3 '
[0143] 另外，在組7、8和12的其他測(cè)試中，也取得類似的技術(shù)效果，具體來說，
[0144] 組7的下游引物為5'-6丁厶厶厶厶〇0^厶厶厶0^0^0：-3'；
[0145] 組8的下游引物為5'-60^厶0：0：1'7^11'0：0：-3'；
[0146] 組 12的上游引物為5'-TTGAATGTGTGTGAAATAAAGTT-3' ；
[0147] 這些序列也取得極佳的測(cè)試效果。
[0148] 實(shí)施例4ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化靈敏度檢測(cè)
[0149] 取實(shí)施例1中的結(jié)腸癌患者血漿樣本(PMR= 10.2% );按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行血 漿全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測(cè)DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對(duì)待測(cè)DNA 樣本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800，然 后按照實(shí)施例1的檢測(cè)方法分別采用組13至組21列出的引物及探針序列對(duì)稀釋的待測(cè)DNA 樣本進(jìn)行檢測(cè)，直至熒光檢測(cè)中在45個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有出現(xiàn)PCR擴(kuò)增曲線，以可以出現(xiàn)擴(kuò)增曲線 及可以計(jì)算CT值的樣本作為最低檢測(cè)限。
[0150] 結(jié)果表明，組13至組21列出的引物及探針序列在待測(cè)DNA樣本稀釋600倍的情況下 仍然可以檢測(cè)ZNF843基因甲基化程度。
[0151] 在本測(cè)試中，組17的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ； 下游引物：5 ' -CCAACAATACTAACTACAACACACC-3 ' ；
[0152] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0153] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5 '-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3 '
[0154] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0155] 組21的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -AGTGGCGAGATTTCGGTTTAT-3 ' ；下游引物： 5 '-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 '。
[0156] 另外，在組7、8和12的其他測(cè)試中，也取得類似的技術(shù)效果，具體來說，
[0157] 組17的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCAACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0158] 組17的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0159] 組17的上下游引物序列為：上游引物:5 ' -GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0160] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTTGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0161] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0162] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTCGGGTTTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACGAACCAACACCTCCA-3,；
[0163] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACGAACCAACACCTCCA-3,；
[0164] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACGAAACTCCGTCTCA-3,；
[0165] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGTGTGGGGTTTATGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3,；
[0166] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTATGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACGAAACTCCATCTCA-3,；
[0167] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3,；
[0168] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0169] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5'-了厶1'1'了厶1'1'1'1'了6厶6厶了66厶61'1'-3'；下游引 物:5，-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0170] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGATGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0171] 組21的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -AGTGGCGAGATTTTGGTTTAT-3 ' ；下游引物： 5 '-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 '。
[0172] 這些序列在測(cè)試中也取得極佳的測(cè)試效果，待測(cè)DNA樣本稀釋600倍的情況下仍然 可以檢測(cè)ZNF843基因甲基化程度。
[0173] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技 術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到 的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開 內(nèi)容中具體記載一樣。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于結(jié)直腸癌早期診斷的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒；其通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)受試者血漿或血清樣本中游離DNA的rRNA_pseudogene，HECTDl和/或ZNF843基因啟 動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化，來輔助判斷結(jié)直腸癌的易感性或發(fā)病。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述定量檢測(cè)試劑 盒是通過PCR引物及Taqman探針來完成檢測(cè)的，其包含檢測(cè)rRNA_pseudogene基因啟動(dòng)子區(qū) 甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如下： 組 1:上游引物：5 ' -GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -AAAACCTAAAAACCTCAAATTAITT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3 ' ； 組2:上游引物:5 ' -GGAAGGGG (C/T) GGGAAAATTAT-3 ' 下游引物：5 ' -AATCCCTAAACCCTTCCCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-TCTACGCTCCCCATAAAATCCGA-BHQ1-3 ' ； 組3:上游引物:5 ' - (C/T) GGGAG (C/T) (C/T) G (C/T) AGGGAAGGGG-3 ' 下游引物:5 ' -ACCCGACAC (A/G) ACCTAAAACT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CCTCCGACCCGATCTTTCTACC-BHQ1-3 '。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述定量檢測(cè)試劑 盒還包含檢測(cè)HECTDl基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列 中的任意一組或多組，具體如下： 組4:上游引物：5 ' -AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3 ' 下游引物:5 ' -AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CAACGTAAATCGTTAITTTAAAACGTA-BHQ1-3 ' ； 組5:上游引物：5 ' -AGAATTAAATTTTTATAGTGTTTTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -CAACAACCTAATCAACTTATATACTCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-AAACACTCTTACGTCCAAACGTACT-BHQ1-3 ' ； 組6:上游引物:5 ' -AAAAAAGGAAAGGTTAAAAGTAAATG-3， 下游引物：5 ' -CCAACTACCCTATCTTATAAAACTAAA-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CATTCGTTCGAATCCGTAACCT-BHQ1-3 ' ； 組7:上游引物：5 ' -TATAAGATAGGGTAGTTGGTTAAAAAA-3 ' 下游引物：5 ' - (A/G) TAAAACCCAAAACTATCCTCC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ATCAAAACGCTTACGAAACGCTT-BHQ1-3 ' ； 組8:上游引物：5 ' -GAAGGTTTGGTAG(C/T)GAATTTT-3 ' 下游引物：5 ' - (A/G) CTAACCCCTTTATTCCCC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CGATTACCCGCGCCAAAA-BHQ1-3 ' ； 組9:上游引物：5 ' -TAGGTTGGAGTGAGGTGGTATTA-3 ' 下游引物：5 ' -ACAACATAAACCTAATCTCTACAAAAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCAAATACGATAACGCACACCT-BHQ1-3 ' ； 組 10:上游引物：5 ' -TTTTTTGTAGAGATTAGGTTTATGTTG-3 ' 下游引物：5 ' -TCCCAACACTTTATAATTTTACTCTCT-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-AACCCGAAATTCGAAACCAA-BHQ1-3 ' ； 組11:上游引物：5 ' -GGTTGTTTGAGGGATTATGTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -ATTCTTTTCAAACTTTATTTCACAC-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-AACCCGAAAACGTCCTACTATACTC-BHQ1-3 ' ； 組 12:上游引物：5 ' -TTGAATG (C/T) GTGTGAAATAAAGTT-3 ' 下游引物:5，-CAAATAAAACACTAAAACTCCAAAAA-3， 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCAACGCCGTACCCGATC-BHQ1-3 '。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述定量檢測(cè)試劑 盒還包含檢測(cè)ZNF843基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列 中的任意一組或多組，具體如下： 組 13:上游引物：5 ' -AGGGATAAAGGGTTGAGATTGT-3 ' 下游引物:5 ' -TAAAAACCACTACTTTAACCCCTAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCCGAAACACTAAACCGAACA-BHQ1-3 ' ； 組 14:上游引物：5 ' -GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTT-3 ' 下游引物：5 ' -AACGCTACGACTCACGTCTATAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCAAAACGAAAAAATCGCTTAA-BHQ1-3 ' ； 組15:上游引物：5 ' -GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTTA-3 ' 下游引物:5 ' -ACCTTAAACACCTCAATACATAACC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCGAACGCTACGACTCACG-BHQ1-3 ' ； 組 16:上游引物：5 ' -TTTGAATTGTTGGATTTAATGTTAT-3 ' 下游引物:5 ' -CACACAAACATAAACACCCATCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CACACGCCCCGTTTACTTTC-BHQ1-3 ' ； 組 17:上游引物:5 ' -GGG (C/T) GTGTGAAAAGATGGG-3 ' 下游引物：5 ' -CC (A/G) ACAATACTAACTACAACACACC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCTCCCCCGTCCCGAAAT-BHQ1-3 ' ； 組 18:上游引物：5 ' - (C/T) GGGT (C/T) GGGTGTGTTGTAG-3 ' 下游引物:5 ' -AAAAC (A/G) AACCAACACCTCCA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CGCCTTTACGACCGACCGT-BHQ1-3 ' ； 組 19:上游引物：5 ' - (C/T) GTGTGGGGTTTA (C/T) GGAA (C/T) -3 ' 下游引物:5 ' -ACACAAC (A/G) AAACTCC (A/G)TCTCA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CTAAACACGCGCCTCCGC-BHQ1-3 ' ； 組 20:上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGA(C/T)GGAGTT-3 ' 下游引物:5 ' -ACTC (A/G) AAAAACTAAAACAAAAAAATC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-AATAAACCGAAATCTCGCCACT-BHQ1-3 ' ； 組21:上游引物：5 ' -AGTGGCGAGATTT (C/T) GGTTTAT-3 ' 下游引物：5 ' -AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCGAACGTAATAACGAACGC-BHQ1-3 '。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用 于檢測(cè)ACTB基因甲基化程度的核苷酸序列，具體如下： 組 22:上游引物:5 ' -TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ' 下游引物：5 ' -AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3 '。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)甲基化定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述定量檢測(cè)試劑 盒還包含如下組分:2XGoldstar TaqMan Mixture、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述試劑盒在制備用于結(jié)直腸癌早期診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105950723SQ201610291803
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】王紅衛(wèi), 段世偉, 鄧友平, 朱勇, 王琳
【申請(qǐng)人】王紅衛(wèi)