豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌lamp診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒。本發(fā)明構(gòu)建了一套完整的LAMP體系，LAMP擴(kuò)增法可使用水浴鍋或保溫杯進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果肉眼可見，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，特別適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢疫，且敏感性高。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物構(gòu)建的試劑盒，可檢測(cè)APP 1?15型，敏感性達(dá)到為0.3 pg/ L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP診斷方法可在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，并且結(jié)果準(zhǔn)確，使用方便。
【專利說明】
豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及家畜飼養(yǎng)及疾病防治領(lǐng)域，尤其是一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胸膜肺炎是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(dc i i/3 οci ? uspieuropneun1niae, APP)感染引起以纖維性肺炎為主要特征的豬呼吸道疾病。急性發(fā)病時(shí)，死亡率較高，出現(xiàn)呼吸嚴(yán)重困難，體溫升高，食欲減退，剖檢可見肺部與胸膜粘連，慢性發(fā)病時(shí)，死亡率較低，但豬生長(zhǎng)緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低。該病至1987年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)以來，全省各地報(bào)道較多，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，由于抗生素的濫用，APP耐藥性日益嚴(yán)重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，它實(shí)現(xiàn)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，以了解其耐藥情況，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，其特征在于:包括LAMP診斷反應(yīng)混合液250仙、Ast DNA聚合酶20仙、引物4條各40仙、陰性對(duì)照20仙、陽性對(duì)照20yL及超純水500yL;所述4條引物的序列分別為F3: 5’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG_3’ ; B3:
5’ -GCCCCACAATGACGTGTAC-3 ’ ； FIP: 5 ’ -GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3 ’ ；BIP: 5' -AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3'。
[0005]所述的陰性對(duì)照為超純水，陽性對(duì)照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA。
[0006]所述的引物F3與引物B3的濃度均為5-20μπιΟ1/1;所述的引物FIP與引物BIP的濃度為10_40ymol/L。
[0007]為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下試驗(yàn):
I材料與方法
1.1試驗(yàn)材料 1.1.1細(xì)菌
豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1-15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌由貴州畜禽重大疫病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。
[0008]主要試劑
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京藍(lán)譜生物科技有限公司；豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌PCR試劑盒由貴州省畜禽重大疫病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。
[0009]試驗(yàn)方法 1.2.1引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中的APP 1-15型apxIVA基因序列，應(yīng)用在線PrimerExplorer 4.0軟件設(shè)計(jì)4條特異性引物，包括外引物和內(nèi)引物$3、8311?、81?)。引物由寶生物(大連)工程有限公司合成。
[0010]F3: 5’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3’ ； B3:5’ -GCCCCACAATGACGTGTAC—3’ ；
FIP: 5’ -GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3’ ；
BIP: 5’-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3’。
[0011]細(xì)菌核酸的提取
臨床樣品:取I g病豬肺臟、淋巴結(jié)加入2 mL 0.1 mo I/L PBS研磨后，反復(fù)凍融3次，5000 r/ min離心5 min，取上清液用于細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。
[0012]細(xì)菌樣品:采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。
[0013]擴(kuò)增條件的優(yōu)化
LAMP擴(kuò)增條件的優(yōu)化主要包括擴(kuò)增溫度(分別為60、65、70 °C )，擴(kuò)增時(shí)間(分別為15、30,45 11^11)，卩3、83引物濃度(分別為5、10、20 ymol/L)，F(xiàn)IP、BIP引物濃度(分別為 10、20、40mol/D,Bst DNA聚合酶(分別為0.5、1、2 U)。
[0014]LAMP反應(yīng)在25 反應(yīng)體系中進(jìn)行，引物F3、B3 2 yL、引物FIP、BIP 4 \iL,Bst DNA聚合酶I μ!Χ0.5、1、2 U)，LAMP反應(yīng)緩沖液12.5 yL，模板I yL，加入環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測(cè)試劑盒的熒光顯色液I HL，用ddH20補(bǔ)足至25 nL。擴(kuò)增產(chǎn)物用紫外光下進(jìn)行觀察。
[0015]敏感性試驗(yàn)
將提取的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌I型核酸用核酸蛋白儀測(cè)定濃度后，經(jīng)10倍系列稀釋用于LAMP、PCR反應(yīng)，以確定建立的LAMP診斷方法的敏感性。PCR試劑盒敏感性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。
[0016]特異性試驗(yàn)
以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1-15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、gij豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌DNA為模板分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以確定建立的LAMP診斷方法的特異性。
[0017]重復(fù)性試驗(yàn)
應(yīng)用建立LAMP診斷方法，重復(fù)檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1-15型3次以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
[0018]建立的LAMP對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
對(duì)2014年3月至2016年3月在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣在15個(gè)規(guī)模場(chǎng)和48家養(yǎng)殖戶236份疑似病豬樣品采用建立的LAMP診斷方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用研制的PCR診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0019]結(jié)果
2.1 LAMP診斷方法的建立
LAMP診斷方法最優(yōu)25 UL擴(kuò)增體系為引物F3、B3濃度5 μπιοΙ/L各I yL，引物FIP、BIP濃度40 ymol/L各2 yL，AsiDNA聚合酶I U I yL，LAMP擴(kuò)增緩沖液12.5 yL，模板I yL，加入環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測(cè)試劑盒的熒光顯色液I nL，用ddH20補(bǔ)足至25 uL。最佳擴(kuò)增條件為，反應(yīng)溫度65°C，反應(yīng)30 min，94°C滅活2 min。擴(kuò)增完后，在紫外燈光下觀察，陽性反應(yīng)管顏色為綠色，陰性反應(yīng)管為無色，見圖1。
[0020]敏感性試驗(yàn)經(jīng)10倍系列稀釋的APP I型DNA用于LAMP、PCR反應(yīng)，結(jié)果，建立的LAMP診斷方法最低核酸檢測(cè)量為2 pg/yL，見圖2，而PCR診斷方法最低核酸檢測(cè)量為200 pg/yL，見圖3。
[0021 ] 特異性試驗(yàn)
以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1-15型、豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、gij豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌DNA為模板，結(jié)果，紫外光下豬源大腸桿菌、豬源沙門氏菌、豬源支原體、副豬嗜血桿菌、豬源多殺性巴氏桿菌DNA均為陰性，而豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌1-15型DNA顯示為陽性，見圖4。
[0022]重復(fù)性試驗(yàn)
應(yīng)用建立的LAMP方法，重復(fù)檢測(cè)APP DNA樣品3次，結(jié)果均一致。
[0023]建立的LAMP對(duì)臨床樣品的檢測(cè)
對(duì)2014年3月至2016年3月在貴州省貴陽市、安順市、遵義市、凱里市、興義市、銅仁市、甕安縣15個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)236份疑似病豬樣品采用建立的LAMP診斷方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用研制的PCR診斷試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。236份疑似病豬樣品陽性率為37.7%( 89/236)，而PCR陽性率為34.3.0%(81/236)。建立的LAMP診斷方法與PCR診斷方法符合率為91.0%。
[0024]結(jié)論
近年來，隨著生豬養(yǎng)殖規(guī)?；粩喟l(fā)展，生豬養(yǎng)殖病害不斷增多，呼吸道疾病尤為嚴(yán)重。APP是近幾年較為常見的呼吸道病病原。目前APP檢測(cè)方法很多，傳統(tǒng)的病原分離鑒定，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，且APP病原分離對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，病原檢測(cè)多使用PCR檢測(cè)技術(shù)，但PCR技術(shù)需要專業(yè)設(shè)備和專業(yè)人員操作。LAMP擴(kuò)增法可使用水浴鍋或保溫杯進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果肉眼可見，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，特別適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢疫，且敏感型較PCR高。劉亞娟等建立的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP方法，最低檢測(cè)限為0.307ng/L。本研究建立的LAMP診斷方法利用APP1-15型共有的apxIVA基因設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)方法可檢測(cè)APP 1-15型，敏感性達(dá)到為0.3 pg/L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP診斷方法可在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0025]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明構(gòu)建了一套完整的LAMP體系，LAMP擴(kuò)增法可使用水浴鍋或保溫杯進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果肉眼可見，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，特別適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢疫，且敏感性高。根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物構(gòu)建的試劑盒，可檢測(cè)APP 1-15型，敏感性達(dá)到為0.3 pg/L，比PCR高100倍，因此建立的LAMP診斷方法可在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，并且結(jié)果準(zhǔn)確，使用方便。
【附圖說明】
[0026]圖1為L(zhǎng)AMP檢測(cè)方法的建立；
圖1中，1-15: APP 1-15型LAMP產(chǎn)物；16:陰性對(duì)照；
圖2為APP LAMP敏感試驗(yàn)；
圖2中，I?8:2.0 X 16?2.0 X 10—1PgAiL稀釋的APP DNA LAMP結(jié)果;
圖3為APP PCR敏感試驗(yàn)
圖3中，M:DL200; I?6:2.0X 16?2.0X 11PgAiL稀釋的APP DNA PCR結(jié)果;
圖4為APP LAMP特異性試驗(yàn)；
圖4中，1-15:APP卜 15型 LAMP產(chǎn)物；16:E.coli LAMP產(chǎn)物；17:Salmonella LAMP產(chǎn)物;18: Mycoplasma LAMP 產(chǎn)物；19: Haemophilus suis LAMP 產(chǎn)物；20: Pasteurellamultocida LAMP產(chǎn)物;21:陰性對(duì)照.。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明的實(shí)施例1:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，包括LAMP診斷反應(yīng)混合液250仙、Ast DNA聚合酶20UL、引物4條各40μ?、陰性對(duì)照20仙、陽性對(duì)照20μ?及超純水 500yL;所述 4條引物的序列分別為 F3: 5’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3’ ;B3:5'-GCCCCACAATGACGTGTAC-3’ ；FIP:5'-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3' ；BIP:5’-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3’ ；所述的陰性對(duì)照為超純水，陽性對(duì)照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA;所述的弓I物F3與弓I物B3的濃度均為I Opmo I/L;所述的引物FIP與引物BIP的濃度為20μπιΟ1/1。
[0028]本發(fā)明的實(shí)施例2:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，包括LAMP診斷反應(yīng)混合液250仙、Ast DNA聚合酶20UL、引物4條各40μ?、陰性對(duì)照20仙、陽性對(duì)照20μ?及超純水 500yL;所述 4條引物的序列分別為 F3: 5’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3’ ;B3:5'-GCCCCACAATGACGTGTAC-3’ ；FIP:5'-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3' ；BIP:5’-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3’ ；所述的陰性對(duì)照為超純水，陽性對(duì)照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA;所述的引物F3與引物B3的濃度均為5μπι01/1;所述的引物FIP與引物BIP的濃度為lOymol/L。
[0029]本發(fā)明的實(shí)施例3:豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，包括LAMP診斷反應(yīng)混合液250仙、Ast DNA聚合酶20UL、引物4條各40μ?、陰性對(duì)照20仙、陽性對(duì)照20μ?及超純水 500yL;所述 4條引物的序列分別為 F3: 5’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3’ ;B3:5'-GCCCCACAATGACGTGTAC-3’ ；FIP:5'-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3' ；BIP:5’-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3’ ；所述的陰性對(duì)照為超純水，陽性對(duì)照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA;所述的引物F3與引物B3的濃度均為20μπιΟ1/1;所述的引物FIP與引物BIP的濃度為40μπιΟ1/1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，其特征在于:包括LAMP診斷反應(yīng)混合液250μ?、Α5? DNA聚合酶20μL、引物4條各40μL、陰性對(duì)照20μL、陽性對(duì)照20仙及超純水500μL;所述 4條引物的序列分別為F3: 5 ’-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3 ’ ； B3: 5’-GCCCCACAATGACGTGTAC-3’ ；FIP:5'-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3' ；BIP:5' -AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3'。2.—種如權(quán)利要求1所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，其特征在于:所述的陰性對(duì)照為超純水，陽性對(duì)照為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP診斷試劑盒，其特征在于:所述的引物F3與引物B3的濃度均為5-20μπιΟ1/1;所述的引物FIP與引物BIP的濃度為10-40μmol/L.
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105950764SQ201610502566
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】余波, 楊莉, 史開志
【申請(qǐng)人】貴州省畜牧獸醫(yī)研究所