專利名稱：：傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自20世紀(jì)70年代以來，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)取得了巨大的成就，先后掀起了藻類、對(duì)蝦、魚類和貝類養(yǎng)殖等幾次大的浪潮，使我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖總量多年居世界第一。但隨著養(yǎng)殖密度的增大以及養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化，經(jīng)常發(fā)生傳染性疾病的暴發(fā)性流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。腫大細(xì)胞病毒是指虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬，是新近出現(xiàn)的對(duì)魚類具有重大危害作用的烈性傳染病的病原，分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，有50多種的海水魚類和近10種的淡水魚類是這種病毒的攜帶者。腫大細(xì)胞病毒對(duì)世界各國，特別是東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成巨大威脅，每年都能造成重大經(jīng)濟(jì)損失。腫大細(xì)胞病毒的代表種主要有鱖傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)(也稱為傳染性脾腎壞死病毒)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、條石鯛虹彩病毒(RBIV)、海艫虹彩病毒(SBIV)、大黃魚(LYCIV)、臺(tái)灣石斑魚虹彩病毒(TGIV)和斜帶石斑魚虹彩病毒(OSGIV)等。腫大細(xì)胞病毒的宿主覆蓋了眾多具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖魚類，對(duì)腫大細(xì)胞病毒所引發(fā)的系列魚病的控制成為有關(guān)國家的共識(shí)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，該疫苗可以用于傳染性脾腎壞病毒的預(yù)防，大大降低水產(chǎn)業(yè)病毒性疾病的發(fā)病率。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，該制備方法簡單，成本低，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供上述傳染性脾腎壞病毒疫苗在魚類傳染性脾腎壞病毒預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實(shí)現(xiàn)的傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)，就是指鱖傳染性脾腎壞死病毒，它是虹彩病毒科腫大細(xì)胞病毒屬的代表種，海水魚類病毒RSIV、RBIV和TGIV等均是和ISKNV具有微小差異的腫大細(xì)胞病毒的不同毒株而已，因此本發(fā)明是針對(duì)ISKNV進(jìn)行的疫苗研究。一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，該疫苗是通過在魚類細(xì)胞中接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。上述傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，其具體步驟如下-(1)細(xì)胞的制備將魚類細(xì)胞系經(jīng)酶消化分散后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)成片(即細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng))，用于接種傳染性脾腎壞病毒；(2)病毒接種和培養(yǎng)上述魚類細(xì)胞培養(yǎng)成片后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后加入傳染性脾腎壞病毒液，進(jìn)行病毒吸附；病毒吸附結(jié)束后，吸出感染上清，加入細(xì)胞維持液，再次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹梗?3)病毒收集、滅活和稀釋將上述病變的細(xì)胞經(jīng)三次凍融后，收獲病毒液，用有機(jī)溶劑滅活該病毒液，再用鹽類緩沖液稀釋滅活病毒液；(4)疫苗制備將上述稀釋后的病毒液與油性佐劑混合后，振蕩混勻，盡可能使得病毒能夠均勻分散在混合液的各個(gè)部分，即得傳染性脾腎壞死病毒疫苗成品。上述步驟(1)中，消化時(shí)可用胰酶；細(xì)胞培養(yǎng)成片時(shí)可采用DMEM完全培養(yǎng)液(市售)中2527'C培養(yǎng)，優(yōu)選27匸。上述步驟(2)中，病毒吸附可以選擇在2527"的溫度下(優(yōu)選27。C)吸附l小時(shí)；細(xì)胞維持液可選擇采用添加有5體積％胎牛血清(FBS)的DMEM;再次細(xì)胞培養(yǎng)的溫度可選擇2527'C，優(yōu)選27'C。本發(fā)明的FBS(胎牛血清)和DMEM均為本領(lǐng)域通用試劑，市售。上述步驟(3)中，用于病毒滅活的有機(jī)溶劑可以選擇氯仿、乙醚、甲醛、福爾馬林(35體積％40體積％甲醛水溶液)等，優(yōu)選福爾馬林，用福爾馬林滅活該病毒液，福爾馬林的加入量為該病毒液的0.1%,用于稀釋病毒滅活液的鹽類緩沖液可以選擇無菌磷酸鹽緩沖液，稀釋倍數(shù)為20倍。上述步驟(4)中，稀釋后的病毒液與油性佐劑混合的體積比為3:.7，油性佐劑可以選擇ISA763A油性佐劑，混合液在振蕩器上震蕩均勻后，還可以再用超聲波粉碎儀進(jìn)行適當(dāng)作用，從而保證病毒能夠均勻分散在混合液的各個(gè)部分。本發(fā)明的傳染性脾腎壞病毒疫苗可用于預(yù)防海魚類、淡水魚類的傳染性脾腎壞病毒感染。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的傳染性脾腎壞病毒疫苗對(duì)魚類預(yù)防傳染性脾腎壞病毒感染的保護(hù)作用可達(dá)100%;2.本發(fā)明的疫苗本身不含對(duì)人類有害的成分，對(duì)注射疫苗的魚類可以安全食用；3.疫苗本身對(duì)魚類生長沒有影響，在保證水環(huán)境和飼料的情況下，被注射有疫苗的魚類生長狀況良好；4.免疫力持續(xù)時(shí)間長達(dá)半年以上；5.本發(fā)明的疫苗制備方法簡單，所用試劑成本低，有利于大規(guī)模推廣；6.本發(fā)明的疫苗本身不易失效，普通冰箱4度放置一周仍有效。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備本實(shí)施例的生物材料選擇發(fā)明人自己建立的鱖魚仔魚細(xì)胞系，該細(xì)胞系的相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)公布于巳發(fā)表論文中(Dong,C.,Weng，S.,Shi,X.,Xu，X.,Shi，N.&He,J.(2008).Developmentofamandarinfish5Vm》erc(3c/m她/frycelllinesuitableforthestudyofinfectiousspleenandkidneynecrosisvirus(ISKNV).F潛135,273-81.)。本實(shí)施例傳染性脾腎壞病毒疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)細(xì)胞的制備將鱖仔魚細(xì)胞系(MMF-1)用胰酶消化分散，加入DMEM完全培養(yǎng)(市售)在27"C培養(yǎng)成片，用于接種傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV);(2)病毒接種和培養(yǎng)將上述MMF-1細(xì)胞培養(yǎng)成片后，吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，然后加入傳染性脾腎壞死病毒液，置27"C約lh進(jìn)行病毒吸附；病毒吸附結(jié)束后，吸出感染上清，加入細(xì)胞維持液(添加5體積。/。FBS的DMEM)，再次置27'C細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹?約46天)；(3)病毒收集、滅活和稀釋病變的細(xì)胞經(jīng)三次凍融后，收獲病毒液，向病毒液中加入40%甲醛溶液，直到甲醛的體積占溶液總體積的0.1%為止，室溫放置24h(滅活)，再4'C放置7d即可將病毒徹底滅活。然后用無菌磷酸鹽緩沖液將滅活病毒液稀釋20倍；(4)疫苗制備將上述稀釋病毒液與ISA763A油性佐劑(ISA763A油性佐劑為Seppic公司產(chǎn)品，魚類疫苗專用)以3:7的體積比混合，振蕩器上先震蕩混勻，然后用超聲波粉碎儀適當(dāng)作用，盡可能使病毒能夠均勻分散在混合液的各個(gè)部分，即為成品。本實(shí)施例所用試劑均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通用試劑，實(shí)施例中所涉及的細(xì)胞培養(yǎng)、病毒接種、培養(yǎng)、吸附、滅活、稀釋和疫苗制備等操作，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作，詳細(xì)步驟可參考相關(guān)教科書或試劑盒說明。實(shí)施例2傳染性脾腎壞病毒疫苗用于預(yù)防ISKNV感染用實(shí)施例1制備所得傳染性脾腎壞病毒疫苗進(jìn)行預(yù)防ISKNV感染試驗(yàn)。1.試驗(yàn)魚及其飼養(yǎng)條件鱖購自廣東南海某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室的魚池中，平均規(guī)格約90g，水溫保持在2527°C，空氣動(dòng)力泵自動(dòng)充氣，循環(huán)水系統(tǒng)即時(shí)將魚池中的廢物吸出，日常投喂鮮活餌料魚，一天投喂一次，免疫前鱖在詞養(yǎng)池中最少暫養(yǎng)2周以上。2.免疫滅活組隨即選擇39尾鱖，腹腔注射實(shí)施例l所得傳染性脾腎壞病毒疫苗，0.5ml/尾。對(duì)照組隨即選擇40尾鱖，每尾注射0.5ml無菌磷酸鹽緩沖液。將兩組處理后的鱖放養(yǎng)在3.5xl.ox0.5m3的中等水泥魚池中。3.攻毒免疫后30天，無菌PBS將l()8'2TCIDB50B/ml的病毒懸液稀釋20倍，以0.5ml/尾的劑量，腹腔注射兩組鱖。感染期間繼續(xù)投喂鮮活餌料魚，池水溫度穩(wěn)定在2527'C。每日不定時(shí)觀察，死魚及時(shí)清理，印片法檢測(cè)死亡魚類的脾臟腫大情況。4.感染病毒后兩組魚的死亡情況如表1所示。表l注射滅活疫苗再攻毒后鱖的死亡情況<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV，InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus)是一種主要的造成魚類大量死亡的病毒，感染后10天死亡率為90%~100%，目前國內(nèi)外尚無有效抑制ISKNV的藥物，通常養(yǎng)殖者釆用生石灰、硫酸銅、次氯酸鹽、碘鹽或投放抗生素等方法，通過改變水體環(huán)境抑制病毒生長，但是該病毒生命力非常頑強(qiáng)，無法起到預(yù)防作用，尤其在水溫2730"C時(shí)更有大規(guī)模的爆發(fā)，傳統(tǒng)的抗生素對(duì)該病毒也不起作用。但是從表l可以看出，感染了1SKNV后，對(duì)照組的鱖魚死亡了37條，尤其是在感染后的第8、9天，而滅活疫苗組注射了本發(fā)明方法制備的傳染性脾腎壞病毒疫苗，感染后的15天內(nèi)沒有一條死亡，由此可以看出本發(fā)明傳染性脾腎壞病毒疫苗其預(yù)防傳染性脾腎壞病毒感染的保護(hù)作用可達(dá)到100%。權(quán)利要求1、一種傳染性脾腎壞病毒疫苗，其特征在于該疫苗是通過對(duì)魚類細(xì)胞接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。2、一種制備權(quán)利要求l所述傳染性脾腎壞病毒疫苗的方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟(1)細(xì)胞的制備將魚類細(xì)胞系經(jīng)酶消化分散后，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)病毒接種和培養(yǎng)在上述培養(yǎng)好的細(xì)胞中加入傳染性脾腎壞病毒液，進(jìn)行病毒吸附；病毒吸附結(jié)束后，吸出感染上清，再次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變?yōu)橹梗?3)病毒收集、滅活和稀釋將上述病變的細(xì)胞經(jīng)凍融后，收獲病毒液，用有機(jī)溶劑滅活該病毒液后，用鹽類緩沖液稀釋；(4)疫苗制備將上述稀釋后的病毒液與油性佐劑混合后，振蕩混勻，即得病毒疫苗成品。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(1)中，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為2527'C。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，病毒吸附所用溫度為2527"C，吸附時(shí)間為l小時(shí)。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，細(xì)胞培養(yǎng)溫度為2527"C。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，有機(jī)溶劑是氯仿、乙醚或35體積％40體積％甲醛水溶液。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶劑的加入量為病毒液終體積的0.1%8、根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于所述步驟(4)中，稀釋后的病毒液與油性佐劑混合的體積比為3:7。9、權(quán)利要求l所述傳染性脾腎壞病毒疫苗在預(yù)防海魚類、淡水魚類傳染性脾腎壞病毒感染中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種傳染性脾腎壞病毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用，該疫苗是通過在魚類細(xì)胞中接種傳染性脾腎壞病毒，收獲病毒液并滅活后得到的。本發(fā)明疫苗的制備方法包括細(xì)胞的制備，病毒接種和培養(yǎng)，病毒收集、滅活和稀釋以及疫苗制備四個(gè)步驟，本發(fā)明的傳染性脾腎壞病毒疫苗可用于預(yù)防淡水魚類、海水魚類的傳染性脾腎壞病毒感染，其保護(hù)作用可達(dá)100％。本發(fā)明的疫苗本身不含對(duì)人類有害的成分，對(duì)注射疫苗的魚類可以安全食用；且疫苗本身對(duì)魚類生長沒有影響。本發(fā)明疫苗的免疫力持續(xù)時(shí)間長達(dá)半年以上。本發(fā)明疫苗的制備方法簡單，所用試劑成本低，有利于大規(guī)模推廣。文檔編號(hào)A61K39/12GK101530613SQ20091003869公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2009年4月17日優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日發(fā)明者何建國,殷志新,翁少萍,董傳甫申請(qǐng)人:中山大學(xué)