用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用，涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。該菌株名稱為單不動(dòng)桿菌(Acinetobacter soli)GZ?27，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016351，于2016年6月27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心。該菌株對(duì)青枯勞爾氏菌具有拮抗作用的單不動(dòng)桿菌，對(duì)于青枯病的防治又提供了一種途徑。CCTCC NO：M201635120160627
【專利說明】
用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)菌性青枯病是由青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種維 管束毀滅性土傳細(xì)菌性病害，在亞熱帶、熱帶和溫帶地區(qū)發(fā)生普遍系統(tǒng)侵染的毀滅性土傳 病害，俗稱"植物瘟病"。青枯勞爾氏菌寄主廣泛，可侵染54個(gè)科的450余種植物。目前，細(xì)菌 性青枯病的防治是世界公認(rèn)的一大難題，它廣泛分布于世界各地，在我國南方省市發(fā)生嚴(yán) 重，尤其在浙江，近年來不但茄科、瓜類受害，大面積發(fā)生的桑青枯病更對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán) 重?fù)p失。
[0003] 青枯菌有很多小種，根據(jù)青枯菌的寄主范圍分為5個(gè)生理小種，小種1主要危害多 數(shù)茄科植物，包括番茄、馬鈴薯、茄子和煙草等，還危害其他科植物;小種2能侵染香蕉、海里 康(Heliconais)和大蕉等植物;小種3主要危害馬鈴薯，也可弱侵染煙草和番茄;小種4侵染 姜以及弱侵染馬鈴薯等其他植物。另有研究人員將從我國南方桑樹上分離到的青枯病菌株 命名為小種5。侵染馬鈴薯的青枯病菌主要是小種1和小種3。
[0004] 目前，青枯病的防治方法主要有加強(qiáng)田間管理、培育抗病品種、使用化學(xué)藥劑和施 用生防菌劑等，但實(shí)踐證明，田間管理難以有效控制青枯病發(fā)生，抗性材料的選育耗時(shí)長(zhǎng)， 而化學(xué)防治污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡，且化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因 此，利用生防菌株及其活性產(chǎn)物防治生姜青枯病越來越受到人們的重視。大量研究表明，部 分細(xì)菌、放線菌是較理想的青枯病拮抗菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一株用于防治青枯病的 單不動(dòng)桿菌。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一株用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌，名稱 為單不動(dòng)桿菌(Acinetobacter soli)GZ-27,保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2016351，于2016年6月 27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0008] 所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用。
[0009] 所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用，是將單不動(dòng)桿菌菌液 施加于培養(yǎng)農(nóng)作物的土壤中或是噴灑在農(nóng)作物的表面。
[0010] 所述的農(nóng)作物為易于被青枯菌感染的農(nóng)作物;優(yōu)選為茄科作物。
[0011] 所述的農(nóng)作物可為已被青枯菌感染的農(nóng)作物，或是未被青枯菌感染的農(nóng)作物。
[0012] -種青枯病生物防治菌劑，含有上述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌。
[0013] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明提供了一株對(duì)青枯勞爾氏 菌具有拮抗作用的單不動(dòng)桿菌，為青枯病的防治又提供了一種途徑。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明中菌株GZ-27對(duì)青枯菌的拮抗效果照片圖。
[0015] 圖2是本發(fā)明中青枯病拮抗菌生防試驗(yàn)效果圖。
[0016] 圖3是本發(fā)明中菌株GZ-27單菌落的照片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0018] 實(shí)施例1:細(xì)菌進(jìn)行分離純化
[0019] 1、培養(yǎng)基
[0020] LB瓊脂培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用 H20定容至 1000ml，PH 7 ·0-7 · 2。121°C滅菌20分鐘。
[0021] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0022] (1)樣品采集:選擇具代表性的地點(diǎn)（青枯病發(fā)病田地中健康植株根系土壤，地點(diǎn) 廣東?。?，鏟去表層土，用采土工具采取距離地表下5~10厘米深度的土層中的土壤，每個(gè)地 點(diǎn)采5個(gè)樣本，裝入袋中并作好記錄。
[0023] (2) 土壤稀釋液的制備:稱取10g 土壤，放入裝有90mL無菌水的三角瓶中充分振蕩， 制成1:10濃度的土壤稀釋液。待土粒沉淀后，吸取lml上清液，移入盛有9ml滅菌水的試管 中，制成1:100濃度的土壤懸浮液，依次類推，制成1:1000和1:10000的土壤懸浮液，制成10 -2、10- 3、10-4、10-5和10-6倍的土壤溶液備用。
[0024] (3)細(xì)菌分離:選擇10-3、10-4、10- 5和10-6四個(gè)濃度各0.1ml，將稀釋的土壤懸浮液分 別倒入含LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，將涂布棒在酒精燈火焰充分灼燒滅菌，待冷卻后涂布 平板。將接種完的培養(yǎng)皿倒置，30°C恒溫培養(yǎng)，設(shè)置三個(gè)重復(fù)。
[0025] (4)結(jié)果:分離得到細(xì)菌384株。
[0026] 實(shí)施例2:分離得到的細(xì)菌對(duì)青枯菌的平板拮抗試驗(yàn)
[0027] 1、培養(yǎng)基
[0028] TTC固體培養(yǎng)基：①蛋白胨10g，酸水解酪蛋白（Casein Acid Hydrolysate)lg，葡 萄糖5g，瓊脂15g，用H20定容至1000ml，PH6 · 8-7 · 2; 121°C滅菌20分鐘，得到溶液I;②TTC(2， 3,5-氯化三苯四氮唑）用蒸餾水配成質(zhì)量百分比1%的溶液，用0.22μπι濾膜過濾除菌，得到 溶液Π ;③在溶液I冷卻至約45°C時(shí)，每100mL溶液I加入0.5mL溶液II，即可倒平板。
[0029] TTC液體培養(yǎng)基:不加瓊脂和TTC即可。
[0030] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0031] 2 · 1平板拮抗試驗(yàn)--初篩
[0032] 2.1.1菌種活化
[0033] 青枯菌和細(xì)菌進(jìn)行菌種活化:青枯菌GMI1000 (ATCC)和實(shí)施例1分離得到的384株 細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接至TTC固體培養(yǎng)基平板和LB固體培養(yǎng)基平板，分別于28 °C培養(yǎng)2天以及于30 °C 培養(yǎng)1天，備用。
[0034] 2.1.2青枯菌平板的制備
[0035]活化的青枯菌接入TTC液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，28°C，200rpm培養(yǎng)2天，得到青 枯菌發(fā)酵液。隔天以TTC固體培養(yǎng)基倒平板，等培養(yǎng)基凝固后每個(gè)平板中加入0.1ml(OD6〇〇約 2.0) 青枯菌發(fā)酵液，涂布均勻，吹干備用，得到青枯菌平板。
[0036] 2 · 1 · 3平板拮抗試驗(yàn)初篩
[0037]用滅菌的牙簽挑取活化的384株細(xì)菌單菌落，點(diǎn)接在青枯菌平板上，每個(gè)平板接30 株不同的拮抗菌，3個(gè)重復(fù)，28°C培養(yǎng)，24h、36h和48h分別觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要觀察抑菌圈的 有無。
[0038] 2 · 2平板拮抗試驗(yàn)--復(fù)篩
[0039] 2.2.1菌種活化
[0040]同2.1.1，活化選擇初篩有抑菌圈的分離細(xì)菌。
[00411 2.1.2青枯菌平板的制備
[0042]活化的青枯菌接入TTC液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，28°C，200rpm發(fā)酵2天，得到青 枯菌發(fā)酵液。隔天以TTC固體培養(yǎng)基倒平板，等培養(yǎng)基凝固后每個(gè)平板中加入0.1ml(OD6〇〇約 2.0) 青枯菌發(fā)酵液，涂布均勻，吹干后打孔器（Φ5_)打孔，每個(gè)平板打一個(gè)孔備用。
[0043] 2.2.3分離細(xì)菌液體發(fā)酵
[0044] 在青枯菌液體搖瓶培養(yǎng)的第二天，活化的分離細(xì)菌轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶 培養(yǎng)，30 °C，200rpm培養(yǎng)24小時(shí)(0D6QQ約 2 · 0)。
[0045] 2.2.4平板拮抗試驗(yàn)復(fù)篩
[0046] 用移液槍吸取10μ1分離細(xì)菌發(fā)酵液放入青枯菌平板的孔中，吹干，3個(gè)重復(fù)，28°C 培養(yǎng)。24h、36h和48h分別觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要觀察抑菌圈的有無和大小。
[0047] 3、結(jié)果
[0048]通過初篩試驗(yàn)得到有拮抗效果的細(xì)菌53株，通過平板拮抗試驗(yàn)打孔復(fù)篩，抑菌圈 越明顯，說明拮抗作用越好。復(fù)篩得到拮抗效果較好的細(xì)菌6株，菌株GZ-27就是其中一株。 [0049]由圖1可以看出抑菌圈明顯，說明菌株GZ-27對(duì)青枯菌具有明顯的拮抗作用。
[0050]實(shí)施例3:菌株GZ-27的生物防治效果試驗(yàn)
[00511為了檢驗(yàn)菌株GZ-27的生防效果，將菌株GZ-27發(fā)酵液在盆栽上對(duì)青枯病進(jìn)行生防 效果試驗(yàn)。
[0052] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0053] 1.1買茄子苗
[0054]購買在大棚中育好的茄子苗。
[0055] 1.2苗移栽
[0056]在花盆(規(guī)格170mm*160mm)裝滿基質(zhì)土，略壓緊，然后每盆移入1株前子苗，饒水后 兩指在根部略壓緊，在大棚中培養(yǎng)。花盆中培養(yǎng)4周左右。
[0057] 1.3青枯菌和拮抗菌活化和發(fā)酵液制備
[0058]青枯菌GMI1000和拮抗菌GZ-27分別活化，然后挑單菌落分別接入TTC液體培養(yǎng)基 和LB液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，分別于28 °C和30 °C，200rpm，培養(yǎng)約兩天(到0D6QQ都約2.5)。 [0059] 1.4青枯菌和拮抗菌接種
[0060] 本實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)對(duì)照組，即CK1和CK2XK1:不加任何菌，只加入5ml TTC液體培養(yǎng) 基;CK2:只加5ml青枯菌發(fā)酵液，不加拮抗菌發(fā)酵液。菌株GZ-27處理:按照體積比青枯菌:拮 抗菌為1:1、1:2.5和1:5，做3個(gè)處理，每個(gè)處理5盆，每株根部先澆5ml青枯菌發(fā)酵液，然后再 澆5ml、12.5ml、25ml拮抗菌發(fā)酵液。
[0061] 1.5記錄
[0062] 隔一天記錄發(fā)病植株數(shù)和發(fā)病嚴(yán)重程度。
[0063] 2、結(jié)果
[0064] 如圖2所示，人工接種后，只接TTC液體培養(yǎng)基的對(duì)照組CK1不發(fā)病，死亡率0,直接 青枯菌GMI1000發(fā)酵液的對(duì)照組CK2全部發(fā)病，死亡率100%，接種青枯菌GMI1000發(fā)酵液和 拮抗菌GZ-27發(fā)酵液的處理組1:1、1:2.5、1:5死亡率分別為60 %、40 %、20 %，由此可見，拮 抗菌GZ-27發(fā)酵液處理能使茄子植株青枯病的發(fā)生得到有效控制。
[0065] 實(shí)施例4:對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定
[0066] 經(jīng)廣東省微生物分析檢測(cè)中心檢測(cè)，其檢測(cè)依據(jù)為《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東 秀珠主編科學(xué)出版社)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版以及《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版黃培堂 譯2002科學(xué)出版社），鑒定結(jié)果為：菌種GZ-27的16S rDNA序列與Acinetobacter soli(單不 動(dòng)桿菌）的同源性達(dá)99.4%，其形態(tài)特征及生理生化特性與Acinetobacter soli(單不動(dòng)桿 菌)最相似。具體檢測(cè)結(jié)果如下：
[0067] (1)該菌株的形態(tài)、培養(yǎng)、生理、生化等特征如下：
[0068] 單不動(dòng)桿菌GZ-27:屬單不動(dòng)桿菌(Acinetobacter soli);在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良 好，菌株細(xì)胞桿狀，在LB瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)菌落圓形，邊緣不整齊，表面光滑，菌落不透明 (如圖3所示）；在LB液體培養(yǎng)基中呈擴(kuò)散性渾濁。
[0069] (2)菌株GZ-27的理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如表1所示。
[0070]表 1
[0072] 注："+"表示陽性，表示陰性。
[0073] (3)菌株GZ-27 16S rRNA基因序列測(cè)定結(jié)果如下：
[0075] 將16S rRNA基因序列進(jìn)行Blast結(jié)果分析，得到與單不動(dòng)桿菌相似度達(dá)99.4%，其 形態(tài)特征及生理生化特性與單不動(dòng)桿菌最相似，因此根據(jù)16S rRNA基因序列測(cè)定和形態(tài)特 征、生理生化特性結(jié)果來看，該菌株可以歸為單不動(dòng)桿菌(Acinetobacter soli)。
[0076] 將GZ-27命名為單不動(dòng)桿菌(Acinetobacter soli)GZ-27,保藏編號(hào)為CCTCC NO: M2016351，于2016年6月27日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0077] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌，其特征在于：名稱為單不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter soli)GZ-27,保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2016351，于2016年6月27日保藏于位 于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心。2. 權(quán)利要求1所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征 在于:是將單不動(dòng)桿菌菌液施加于培養(yǎng)農(nóng)作物的土壤中或是噴灑在農(nóng)作物的表面。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征 在于:所述的農(nóng)作物為易于被青枯菌感染的農(nóng)作物。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述用于防治青枯病的單不動(dòng)桿菌在防治青枯病中的應(yīng)用，其特征 在于:所述的農(nóng)作物為茄科作物。6. -種青枯病生物防治菌劑，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述用于防治青枯病的單不 動(dòng)桿菌。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK105969706SQ201610614211
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】鄧音樂, 宋施豪, 尹文芳, 張春燕, 蔡靈芝, 黃小容
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)