鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)交叉領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞 單位蛋白疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鮑曼不動(dòng)桿菌存在于醫(yī)院環(huán)境并在患者多部位定植，導(dǎo)致引起醫(yī)院獲得性肺炎、 血流感染、腹腔感染、腦膜炎、皮膚軟組織感染和泌尿系感染等。由于其強(qiáng)大的獲得耐藥性 及克隆傳播能力，鮑曼不動(dòng)桿菌已成為全球流行并呈高度耐藥的常見致病菌。在我國(guó)，鮑曼 不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，2013年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)顯示 鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率為11.97 %，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多數(shù)為多重耐 藥菌(對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.8%和59.4%;對(duì)頭孢哌酮舒巴坦、米諾環(huán) 素和左氧氟沙星的耐藥率分別為36.4%、41.8%和43.4%)。全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的出現(xiàn)和 不斷增多已成為臨床面臨的另一重大挑戰(zhàn)，XDR鮑曼不動(dòng)桿菌主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房或 燒傷病房，顯著增加患者住院費(fèi)用，延長(zhǎng)患者住院時(shí)間，并導(dǎo)致感染患者陷入無(wú)藥可用的困 境。當(dāng)前新的有效抗菌藥物研發(fā)嚴(yán)重滯后，新的針對(duì)性的治療手段刻不容緩。近年來(lái)，國(guó)內(nèi) 研究主要聚焦在監(jiān)測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性動(dòng)態(tài)變化及耐藥機(jī)制的研究，國(guó)外研究則涵蓋了 耐藥機(jī)制、致病機(jī)理、耐藥變化等方面，關(guān)于疫苗的研究則包括滅活疫苗、外膜蛋白疫苗、基 因重組疫苗和莢膜多糖疫苗。McConnell、Bomerger等人的研究結(jié)果表明IWC( inactivated whole cell滅活全菌）、0MC(outer membrane complex外膜蛋白復(fù)合物）、0MV(outer membrane vesic 1 e外膜囊泡)免疫的小鼠均能抵抗鮑曼不動(dòng)桿菌的侵襲。然而由于所含成 分繁多且復(fù)雜，在生產(chǎn)過(guò)程中難以標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量;而且其中脂多糖（內(nèi)毒素)含量過(guò)高，可 產(chǎn)生明顯的毒副作用。對(duì)應(yīng)的重組蛋白疫苗諸如Bap (biofilm associated protein生物膜 相關(guān)蛋白）、OmpA ( outer membrane protein A外月莫蛋白 A )和 A t a (t r imer i c autotransporter protein三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）均為保守基因表達(dá)產(chǎn)物，具有高度同源性， 并覆蓋了較大部分的鮑曼不動(dòng)桿菌毒株，表現(xiàn)了良好的免疫效果，且成分單一、重復(fù)性好、 產(chǎn)品批間差異小、易于控制細(xì)菌內(nèi)毒素含量等優(yōu)勢(shì)，但單一成分疫苗可能免疫保護(hù)不足，并 易將鮑曼不動(dòng)桿菌置于強(qiáng)大的選擇壓力下誘導(dǎo)細(xì)胞膜靶蛋白下調(diào)，出現(xiàn)免疫逃避導(dǎo)致疫苗 最終失效。
[0003] 多種革蘭陰性菌基因組中小蛋白A(small protein A，SmpA)幾乎都有同源性表 達(dá)，SmpA是鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞膜重要成分之一;SmpA被認(rèn)為是維持細(xì)胞膜完整的重要結(jié)構(gòu)， 是外膜形成過(guò)程中重要的功能配件。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)被證實(shí)在病原菌血源 傳播的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，同時(shí)，研究證明PLD是鮑曼不動(dòng)桿菌的重要致病因子。逆 向免疫學(xué)提示SmpA和PLD可以作為一個(gè)良好的蛋白疫苗靶點(diǎn)。此外，SmpA和PLD均可誘導(dǎo)機(jī) 體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，SmpA抗體可破壞體內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞膜的完整性，PLD抗體可滅活PLD 活性，減低體內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌毒力，兩者協(xié)同作用可發(fā)揮更完善的保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗及其制備方法。利用 免疫信息學(xué)和逆向遺傳學(xué)，分析多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白成分的抗原性和免疫原 性，進(jìn)行基因克隆，蛋白表達(dá)、純化以及免疫學(xué)研究，篩選出有效的外膜蛋白成分鮑曼不動(dòng) 桿菌外膜蛋白small protein A(SmpA)、鮑曼不動(dòng)桿菌磷脂酶D(PLD)，并予以聯(lián)合，提高疫 苗的安全性和有效性，較以往疫苗有更現(xiàn)實(shí)和誘人的應(yīng)用前景。
[0005] -種鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗，是由如SEQ ID No . 1所示的鮑曼不動(dòng)桿 菌SmpA和如SEQ ID No . 2所示的鮑曼不動(dòng)桿菌PLD核酸序列，分別連入表達(dá)載體，分別構(gòu)建 SmpA和PLD重組質(zhì)粒，分別誘導(dǎo)表達(dá)重組SmpA和PLD蛋白（蛋白序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No. 4)，再將兩種蛋白混合佐劑制備的疫苗。
[0006] 所述的鮑曼不動(dòng)桿菌聯(lián)合亞單位蛋白疫苗的制備方法：
[0007] (1)根據(jù)SmpA、PLD基因序列，設(shè)計(jì)合成SmpA、PLD序列引物，在兩端引物分別引入 Nde I和Xho I的酶切位點(diǎn)，PCR合成SmpA和PLD基因；
[0008] (2)回收純化PCR產(chǎn)物，TA克隆至載體pMD 18-T，構(gòu)建克隆載體pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，并將其轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，小量提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定測(cè) 序；
[0009] (3)用Nde I和Xho I雙酶切測(cè)序正確的pMD 18-SmpA和pMD 18-PLD，與經(jīng)同樣酶切 的pET28b質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET28b-SmpA和pET28b-PLD，并將其轉(zhuǎn)化 到表達(dá)宿主E. co 1 i BL21 (DE3)中，PCR篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
[0010] (4)將陽(yáng)性單菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組SmpA和重 組PLD蛋白；
[0011] (5)SDS-PAGE和Western Blotting分析鑒定重組蛋白；
[0012] (6)采用離子交換層析法純化重組蛋白并去除內(nèi)毒素；
[0013] (7)重組的SmpA蛋白和重組PLD蛋白混合后，再與佐劑混合制備疫苗。
[0014] 步驟(7)具體是將重組的SmpA蛋白25yg和重組PLD蛋白5yg混合后，再與1 %氫氧化 錯(cuò)溶液按質(zhì)量比1:1混合制備疫苗。
[0015] 本發(fā)明在GenBank中檢索到的ATCC19606來(lái)源SmpA基因序列和PLD基因序列，SmpA 蛋白（轉(zhuǎn)錄基因名稱ABAYE2921，GeneBankID: CAM87743.1)和PLD蛋白（轉(zhuǎn)錄基因名稱A1 S_ 2989,Genebank ID：AB013392.1)〇
[0016] 本發(fā)明重組質(zhì)粒構(gòu)建：
[0017] ⑴在GenBank中檢索到的ATCC19606來(lái)源SmpA基因序列和PLD基因序列，設(shè)計(jì)合成 SmpA和PLD序列的引物，并在兩端引物分別引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)；
[0018] (2)以測(cè)序正確的質(zhì)粒為模板，以pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引入酶切位點(diǎn)；
[0019] (3)反應(yīng)條件：94°C 預(yù)變性 5111丨11，941€3〇8,511€3〇8,721€3〇8,30個(gè)循環(huán)，72°(：延伸 1 Omin，1.5 %凝膠電泳后回收純化PCR產(chǎn)物；
[0020] (4)用Nde I和Xho I雙酶切PCR產(chǎn)物，所得產(chǎn)物與經(jīng)同樣酶切的pET28b質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主E. col i。
[0021 ]本發(fā)明重組蛋白的原核表達(dá)及純化過(guò)程具體如下：
[0022] (1)取lul重組的pET28b質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，42°C熱擊90s后冰上靜置2min后涂含 有30ug/mL卡那霉素的培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜；
[0023] (2)挑取轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3)的單菌落于裝有4mL含有30ug/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基的試管中，37°C，220rpm過(guò)夜培養(yǎng)；
[0024] (3)將培養(yǎng)的菌液按體積比1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，添加30ug/mL卡 那霉素，37°C，220rpm培養(yǎng)，當(dāng)0D值達(dá)到0.6左右時(shí)，添加終濃度為0.2mM的IPTG，37°C， 220rpm，5h，離心收集細(xì)胞菌體；
[0025] (4)收集菌體并用PBS緩沖液懸??；
[0026] (5)SDS-PAGE 電泳檢測(cè)；
[0027] (6)將收集的細(xì)菌菌體用破碎Buffer溶解，破碎Buffer配方為50mM Tris，300mM NaCl，0.1%Triton 乂-114 4!1 = 8.0，冰浴中超聲破碎菌體，功率5001，25111丨11，超聲28，暫停 6s為一個(gè)循環(huán);超聲完畢，12000rpm/min，4°C離心20min，棄上清，沉淀再用加尿素的破碎 Buffer溶解（8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，0.1%Triton Χ-114，ρΗ = 8·0)，冰浴中超聲 破碎菌體，功率500W，25min，超聲2s，暫停6s為一個(gè)循環(huán);超聲完畢，12000rpm/min，4°C離心 20min，上清用于親和層析；
[0028] (7)取10mL Ni-NTA，用10倍柱床體積的Binding Buffer清洗平衡柱子，流速5mL/ min，Binding Buffer配方為：8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，pH=8.0;
[0029] (8)樣品上柱，流速為2mL/min;
[0030] (9)上樣結(jié)束后，用10倍柱體積的去內(nèi)毒素 buffer沖洗柱子，去內(nèi)毒素 buffer配 方:8M尿素，50mM Tris，300mM NaCl，l%Triton Χ-114，ρΗ=8·0;
[0031 ] (10)用 10倍體積的Wash Buffer清洗柱子，流速2mL/min;Wash Buffer配方為：8Μ 尿素，50mM Tris，300mM NaCl，20/50咪唑，ρΗ=8·0;
[0032] (ll)Elution Buffer洗脫，流速2mL/min，收集洗脫液；Elution Buffer配方為：8M 尿素，50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，ρΗ=8·0。
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例中嘗試將兩種蛋白分別與氫氧化鋁佐劑混合后免疫小鼠，收集免疫 后小鼠血清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌SmpA和PLD抗體滴度，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SmpA和PLD免疫后體 內(nèi)均產(chǎn)生了較高的抗體水平。然后將兩種蛋白一起與氫氧化鋁佐劑混合后免疫小鼠，小鼠 霧化吸入臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，觀察72h，在小鼠肺組織中細(xì)菌負(fù)荷在聯(lián)合免疫組較對(duì) 照組降低1〇 2倍，優(yōu)于單用PLD免疫組（10倍)和單用SmpA免疫組(幾乎無(wú)變化），且在血清中 炎癥因子水平顯著降低，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。顯示了該聯(lián)合疫苗具有更高的免 疫原性。而且將SmpA和PLD免疫后小鼠抗血清通過(guò)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，在以臨床分離 的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染，發(fā)