利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
【專利摘要】利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，以沒食子酸為原料，通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)制備焦性沒食子酸。包括培養(yǎng)基配制、菌種培養(yǎng)、發(fā)酵制酶、發(fā)酵脫羧、產(chǎn)物分離等步驟。在發(fā)酵溫度37℃、底物濃度10 mM，發(fā)酵液起始pH 6.5，發(fā)酵24 h后植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)焦性沒食子酸收率大于80%。本發(fā)明所述微生物發(fā)酵法制備焦性沒食子酸與傳統(tǒng)法高溫脫羧工藝相比，反應(yīng)條件溫和、污染少、得率高、對設(shè)備要求不高。
【專利說明】
利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性 沒食子酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 焦性沒食子酸(pyrogallol)，又稱連苯三酚或焦倍酚，是一種重要的具有多種用 途的化學試劑和化工原料，廣泛用于醫(yī)藥合成、紡織印染、食品、化妝品、農(nóng)藥及電子產(chǎn)品等 領(lǐng)域。此外，它還可作為顯影劑、熱敏劑、高分子材料的助劑以及化學分析試劑等。在工業(yè) 上，生產(chǎn)焦性沒食子酸的主要原料是沒食子酸。在我國制備焦性沒食子酸傳統(tǒng)工藝是對沒 食子酸加熱高溫脫羧;該工藝需要在高溫下進行人工翻炒，不僅勞動強度大，產(chǎn)品得率較 低。
[0003] 利用生物體系(各種細胞和酶)作催化劑實現(xiàn)有機物的生物轉(zhuǎn)化和生物合成，是當 今合成化學的研究熱點。微生物轉(zhuǎn)化是某種微生物將一種物質(zhì)(底物)轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì) (產(chǎn)物)的過程，由其所產(chǎn)生的一種或幾種特殊的胞外或胞內(nèi)酶作為生物催化劑進行的化學 反應(yīng)。相比化學法，生物催化劑進行反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少、成本低、后處理簡 單、污染少和專一性高以及環(huán)境友好等優(yōu)點，成為合成光學純的醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體和其它一 些復雜功能化合物的環(huán)境友好綠色化學過程。對環(huán)境及社會發(fā)展，對綠色化工產(chǎn)業(yè)的建立 都有極其重要的應(yīng)用意義和前景。因此，開發(fā)研究高效且環(huán)境友好的綠色生物催化制取焦 性沒食子酸的過程，具有重要的理論和應(yīng)用價值。
[0004] 在微生物體內(nèi)，沒食子酸在沒食子酸脫羧酶(gallate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.59)的作用下，生成焦性沒食子酸。目前國內(nèi)利用GAD法制備焦性沒食子酸處于起步 階段。將高效脫羧的菌株與培養(yǎng)工藝進行匹配，提高產(chǎn)品收率是本發(fā)明的目的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的目的在于提供一種利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備 焦性沒食子酸的方法。
[0007] 技術(shù)方案:一種利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，包括如 下步驟:菌種培養(yǎng):配制試管斜面保藏培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，將降解沒食子酸的菌株進行劃 線分離，挑選生長旺盛的典型菌落在試管斜面保藏培養(yǎng)基上培養(yǎng);將培養(yǎng)好的斜面菌種以 無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速180r/ min，培養(yǎng)時間10~20h;發(fā)酵脫羧:配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子液按照5 %接種量，轉(zhuǎn) 接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床發(fā)酵;發(fā)酵條件:轉(zhuǎn)速180r/min，底物濃度5-30mM，發(fā)酵溫度30-40 °C、發(fā)酵液起始pH值5.0-7.0，發(fā)酵時間20-28h;產(chǎn)物分離:將含有焦性沒食子酸的發(fā)酵液于 1 OOOOr/min條件下離心1 Omin，取上清液，加入上清液1 /2體積的乙酸乙酯，充分混勻后萃取 兩次，乙酸乙酯相于40°C下經(jīng)減壓蒸發(fā)除去溶劑得到焦性沒食子酸。
[0008] 上述降解沒食子酸的菌株為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。
[0009] 上述試管斜面保藏培養(yǎng)基的配制:稱取酵母粉10.0g，葡萄糖15.0g、碳酸鈣15.0g、 吐溫80 l.Og、瓊脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°〇 下滅菌20min，冷卻后即為試管保藏培養(yǎng)基。
[0010] 上述種子培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物10.0g、葡萄 糖20.0g、吐溫80 l.Og、檸檬酸胺2.0g、醋酸鈉5.0g、碳酸鈣20.0g、硫酸鎂O.lg、硫酸錳 0.05g、磷酸氫二鉀2.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°〇 下滅菌15min，冷卻后為種子培養(yǎng)基。
[0011] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物5.0g、葡萄 糖20.0g、吐溫80 l.Og、檸檬酸胺2.0g、醋酸鈉5.0g、硫酸鎂O.lg、硫酸錳0.05g、磷酸氫二鉀 2.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°(：下滅菌1511^11，冷卻 后為發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0012] 有益效果:本發(fā)明利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸降解生成焦性沒食子酸。在發(fā)酵 液起始pH值6.5，沒食子酸底物濃度10mM，發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵時間24h條件下，產(chǎn)焦性沒食 子酸的得率大于80%。本發(fā)明所述微生物發(fā)酵法制備焦性沒食子酸與傳統(tǒng)法高溫脫羧工藝 相比，采用微生物(酶)作為催化劑，實驗條件溫和、污染少、得率高、對設(shè)備要求不高。
【附圖說明】
[0013] 圖1為植物乳桿菌生長曲線及不同發(fā)酵孵育時間沒食子酸脫羧酶(GAD)活性的變 化圖。
【具體實施方式】
[0014] 參考下列實施例將更容易、更全面地理解本發(fā)明，給出實施例是為了闡明本發(fā)明， 而不是以任何方式限制本發(fā)明。
[0015] 實施例1:發(fā)酵制備焦性沒食子酸
[0016] (1)培養(yǎng)基的配制：
[0017] a)試管斜面保藏培養(yǎng)基的配制:稱取酵母粉10.0g、葡萄糖15.0g、碳酸鈣15.0g、吐 溫80 l.Og、瓊脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°(：下 滅菌20min，冷卻后即為試管保藏培養(yǎng)基；
[0018] b)種子培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物10.0g、葡萄糖 20.08、 吐溫80 1.(^、檸檬酸胺2.(^、醋酸鈉5.(^、碳酸鈣20.(^、硫酸鎂0.18、硫酸錳0.058、 磷酸氫二鉀2.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0,在121°C下滅菌 15min，冷卻后為種子培養(yǎng)基；
[0019] c)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:稱取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物5.0g、葡萄糖 20.08、 吐溫80 1.(^、檸檬酸胺2.(^、醋酸鈉5.(^、硫酸鎂0.18、硫酸錳0.058、磷酸氫二鉀 2.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°(：下滅菌1511^11，冷卻 后為發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0020] (2)利用降解沒食子酸的植物乳桿菌菌株進行劃線分離，挑選生長旺盛的典型菌 落經(jīng)斜面培養(yǎng)基反復劃線純化，將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到裝有100mL 種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，搖床培養(yǎng)(溫度:37°C ;轉(zhuǎn)速:180r/min)。
[0021] (3)將培養(yǎng)好的種子液按照5%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床發(fā)酵。發(fā)酵條 件:沒食子酸底物濃度為10mM，發(fā)酵液起始pH值6.5，轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵時 間 24h。
[0022] (4)將含有焦性沒食子酸的發(fā)酵液于lOOOOr/min條件下離心10min，取上清液，加 入上清液1/2體積的乙酸乙酯，充分混勻后萃取兩次，乙酸乙酯相于40°C下經(jīng)減壓蒸發(fā)除去 溶劑得到焦性沒食子酸，采用高效液相色譜(HPLC)法測定焦性沒食子酸的含量，用焦性沒 食子酸標準品繪制標準曲線，計算焦性沒食子酸的收率，植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)焦性 沒食子酸收率為81.6%。
[0023]實施例2:沒食子酸脫羧酶(GAD)活性的測定
[0024]按照實施例1配制斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，對植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)進行培養(yǎng)，采用香蘭素 (vanillin)檢測方法，對GAD活性進行 分光光度法檢測。
[0025]通過檢測植物乳桿菌生長曲線（OD600菌體濃度)及不同發(fā)酵孵育時間沒食子酸脫 羧酶(GAD)活性的變化，見附圖1，可以發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵孵育時間的增加，植物乳桿菌0D_菌 體濃度和GAD酶活性菌呈現(xiàn)出升高的趨勢;但在發(fā)酵后的20h，植物乳桿菌0D 6QQ菌體濃度和 GAD酶活性菌呈現(xiàn)略微下降的趨勢，可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)的消耗有關(guān)。植物乳桿菌生長發(fā)酵 孵育時間20h，0D6Q()菌體濃度1.6，GAD活性0.3U每分鐘每毫克蛋白。
[0026] 實施例3:發(fā)酵制備焦性沒食子酸(發(fā)酵條件變化）
[0027] 培養(yǎng)基配制和發(fā)酵制備焦性沒食子酸的步驟同實施例1，改變發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速 180r/min，沒食子酸底物濃度為60mM，發(fā)酵溫度28 °C，發(fā)酵液起始pH值7.0，發(fā)酵時間20h，植 物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)焦性沒食子酸收率為56.6 %。
[0028] 實施例4:發(fā)酵制備焦性沒食子酸(培養(yǎng)基變化）
[0029] (1)培養(yǎng)基的配制
[0030] a)試管斜面保藏培養(yǎng)基的配制：同實施例1;
[0031] b)種子培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨5. Og、牛肉膏3. Og、氯化鈉15. Og，在1L容量瓶 中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至7.0，在121°C下滅菌15min，冷卻后為種子培養(yǎng)基；
[0032] c)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、酵母浸提物10.0g，氯化鈉 15.0g、在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°(：下滅菌1511^11，冷卻 后為發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0033] (2)按照實施例1中（2)~(4)的方法，進行菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、分離等步驟得到焦性沒 食子酸，植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)焦性沒食子酸收率為50.7 %。
[0034] 實施例5:發(fā)酵制備焦性沒食子酸(培養(yǎng)基和發(fā)酵溫度變化）
[0035] (1)培養(yǎng)基的配制：
[0036] a)試管斜面保藏培養(yǎng)基的配制:稱取酵母粉10.0g，葡萄糖15.0g、碳酸鈣15.0g、吐 溫80 l.Og、瓊脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°(：下 滅菌20min，冷卻后即為試管保藏培養(yǎng)基；
[0037] b)種子培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、氯化鈉15.0g，在1L容量瓶 中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至7.0，在121°C下滅菌15min，冷卻后為種子培養(yǎng)基；
[0038] c)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制:稱取酵母浸提物l.Og、磷酸氫二鉀2.0g、磷酸二氫鉀l.Og、 硫酸鎂〇 . 5g，在1L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°C下滅菌 15min，冷卻后為發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0039] (2)利用降解沒食子酸的植物乳桿菌菌株進行劃線分離，挑選生長旺盛的典型菌 落經(jīng)斜面培養(yǎng)基反復劃線純化，將培養(yǎng)好的斜面菌種以無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到裝有100mL 種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，搖床培養(yǎng)(溫度:37°C ;轉(zhuǎn)速:180r/min)。
[0040] (3)將培養(yǎng)好的種子液按照5%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床發(fā)酵。發(fā)酵條 件:轉(zhuǎn)速180r/min，沒食子酸底物濃度為10mM，發(fā)酵溫度30 °C，發(fā)酵液起始pH值6.5，發(fā)酵時 間 24h;
[00411 (4)將含有焦性沒食子酸的發(fā)酵液于lOOOOr/min條件下離心10min，取上清液，加 入上清液1/2體積的乙酸乙酯，充分混勻后萃取兩次，乙酸乙酯相于40°C下經(jīng)減壓蒸發(fā)除去 溶劑得到焦性沒食子酸，采用高效液相色譜(HPLC)法測定焦性沒食子酸的含量，用焦性沒 食子酸標準品繪制標準曲線，計算焦性沒食子酸的收率，植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)焦性 沒食子酸收率為37.7%。
【主權(quán)項】
1. 利用植物乳桿菌發(fā)酵沒食子酸制備焦性沒食子酸的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 菌種培養(yǎng):配制試管斜面保藏培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，將降解沒食子酸的菌株進行劃 線分離，挑選生長旺盛的典型菌落在試管斜面保藏培養(yǎng)基上培養(yǎng);將培養(yǎng)好的斜面菌種以 無菌操作取兩環(huán)，轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速180 r/ min，培養(yǎng)時間10~20 h; (2) 發(fā)酵脫羧:配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子液按照5%接種量，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，搖床發(fā)酵;發(fā)酵條件:轉(zhuǎn)速180 r/min，底物濃度5-30 mM，發(fā)酵溫度30-40 °C、發(fā)酵液起始 pH值6.0-7.0，發(fā)酵時間 20-28 h; (3) 產(chǎn)物分離:將含有焦性沒食子酸的發(fā)酵液于10000 r/min條件下離心10 min，取上 清液，加入上清液1/2體積的乙酸乙酯，充分混勻后萃取兩次，乙酸乙酯相于40°C下經(jīng)減壓 蒸發(fā)除去溶劑得到焦性沒食子酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)所述降解沒食子酸的菌株為植物乳 Lactobacillus plantarum) 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述試管斜面保藏培養(yǎng)基的配制:稱取酵母 粉10.0 g，葡萄糖15.0 g、碳酸鈣15.0 g、吐溫80 1.0 g、瓊脂20.0 g，在1 L容量瓶中，加 蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0,在121°C下滅菌20 min，冷卻后即為試管保藏培養(yǎng) 基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸提物10.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 g、梓檬酸胺2.0 g、醋酸 鈉5.0 g、碳酸鈣20.0 g、硫酸鎂0.1 g、硫酸錳0.05 g、磷酸氫二鉀2.0 g，在1 L容量瓶中， 加蒸餾水定容至刻度，pH值調(diào)至6.5-7.0，在121°C下滅菌15 min，冷卻后為種子培養(yǎng)基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：稱取蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸提物5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 g、梓檬酸胺2.0 g、醋酸鈉 5.0 g、硫酸鎂0.1 g、硫酸錳0.05 g、磷酸氫二鉀2.0 g，在1 L容量瓶中，加蒸餾水定容至刻 度，pH值調(diào)至6.5-7.0,在121°C下滅菌15 min，冷卻后為發(fā)酵培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12P7/22GK105969811SQ201610528042
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】汪詠梅, 張亮亮, 徐曼, 徐晟 , 胡新宇
【申請人】中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所