Cpt1a在aml組織樣品中表達水平的檢測方法及其應(yīng)用
【專利摘要】CPT1A在AML組織樣品中表達水平的檢測方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A基因的引物對，其中之一引物對的序列是gagagacagcaagcacatcg(SEQ ID NO：2)和cgtccaaaataggcctgacg(SEQ ID NO：3)或者它們的互補序列，本發(fā)明引物對用于檢測肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A的表達高低，可進一步對急性髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估。本發(fā)明還提供了包含所述引物對的基因芯片和試劑盒。
【專利說明】
CPT1A在AML組織樣品中表達水平的檢測方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及急性髓系白血病基因的檢測、危險度分層和臨床 預(yù)后評估，特別是涉及急性髓系白血病基因的檢測引物、基因芯片和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種異質(zhì)性極強的惡性血液 病，占成人急性白血病的80%左右（參見MROZEK K，HEEREMA N A，BL00MFIELD C D.， Cytogenetics in acute leukemia[J].Blood reviews,2004，18(2):115_36)，它包括許多 具有不同遺傳異常狀況和臨床特征的實體，預(yù)后具有高度的異質(zhì)性。在NCCN(National Comprehensive Cancer Network)危險度分層指南中，約有一半以上的AML被分在中危組 (包括全部的正常核型急性髓系白血病Cytogenetically Normal AML，CN_AML)，現(xiàn)有技術(shù) 缺乏用于危險度分層和臨床預(yù)后評估的有效標(biāo)志物，因此，目前臨床上AML的分層診斷及個 體化治療非常困難，亟待找到有效的預(yù)后標(biāo)志物來確認此類患者治療的強度，以實現(xiàn)精準(zhǔn) 的個體化治療，避免一部分預(yù)后良好的患者治療強度過大，帶來眾多不必要的并發(fā)癥，同樣 也避免另一部分預(yù)后不良的患者治療強度不足，最終導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)。
[0003] 有一部分AML內(nèi)部存在致病的基因突變，這些基因突變具有對AML患者進行危險度 分層和臨床判斷預(yù)后的價值，例如攜帶FLT3-ITD(參見WHITMAN S P，MAHARRY K，RADMACHER M D,et al.FLT3internal tandem duplication associates with adverse outcome and gene-and microRNA-expression signatures in patients 60years of age or older with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia: a Cancer and Leukemia Group B study[J] .Blood,2010,116(18) :3622-6)的正常核型AML患者屬于高危 組，而攜帶 NPM1 突變（參見 D0HNER K，SCHLENK R F，HABDANK M, et al .Mutant nucleophosmin(NPMl)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics: interaction with other gene mutation [J] .Blood,2005,106(12) :3740-6)、CEBPA雙突變（參見PAST0RE F，KLING D，H0STER E，et al.Long-term follow-up of cytogenetically normal CEBPA-mutated AML[J].Journal of hemato logy&onco logy，2014，7 )的患者具有相對較低的危險度和較好預(yù)后。 CN104508143A公開了用于診斷、預(yù)測、治療和處理急性髓系白血病的方法，該方法涉及預(yù)測 患有急性髓系白血病患者的生存率，包括:分析從所述患者分離的遺傳樣品是否存在細胞 遺傳學(xué)異常，以及在基因 Ρ?Τ3、ΝΡΜΙ、·ΜΤ3Α、ΝΚΑ5ΧΕΒΡΑ、ΤΕΤ2、Π?、Ι0ΗΙ、Ι0Η2、ΚΙΤ、 RUNXI、MLL-PTD、ASXLI、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種敏感性高，通用性好，特異性強的標(biāo)志物，來檢測AML細 胞或組織樣品，來幫助判斷AML患者的危險度分層或臨床預(yù)后，是基于以下的考慮：（1)基因 突變不能覆蓋所有的AML，而基因表達可以覆蓋所有的AML患者；（2)AML發(fā)生、發(fā)展的分子機 理目前仍不清楚，尋求新的臨床預(yù)后標(biāo)志物有助于理解AML的發(fā)病機理，并且能為AML的精 準(zhǔn)靶向治療奠定基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CPTlA(carnitine palmitoyltransferase 1A,肉毒喊棕櫚?；D(zhuǎn) 移酶1A)高表達可提示急性髓系白血病細胞的存在，并且可提示急性髓系白血病的不良預(yù) 后。CPT1A是長鏈脂肪酸由胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體氧化供能的關(guān)鍵限速酶，位于線粒體外膜，催 化長鏈脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)移到肉毒堿上進而從胞漿進入線粒體內(nèi)部，并且進一步在位 于線粒體內(nèi)膜上的肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2催化下進行β氧化。人類CPT1A基因定位于llql3.1 ~ql3.5區(qū)，主要表達于肝、腎、肺組織。CPT1A基因全長約60kb，包括18個編碼外顯子。因此， 本發(fā)明提供CPT1A作為AML標(biāo)志物，其敏感性高，通用性好，特異性強，能用來幫助判斷AML患 者的危險度分層或臨床預(yù)后。
[0006] -方面，本發(fā)明提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中CPT1A表達高低的方 法，特征在于，使用CPT1A基因的引物對或者探針。所述檢測包括體外檢測，包括非診斷目的 檢測?；谂c正常對照細胞相比差異表達的CPT1A的急性髓系白血病癌癥特異性特征 (signature)的鑒定及其應(yīng)用，設(shè)計特定CPT1A基因引物對或探針，來檢測急性髓系白血病 細胞或組織中CPT1A的表達高低，通過檢測CPT1A的表達高低來對AML患者進行危險度分層 并分析臨床預(yù)后。CPT1A高表達的AML樣品具有較高的危險度分層和較差的臨床預(yù)后。CPT1A 低表達的AML樣品具有較低的危險度分層和較好的臨床預(yù)后。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中CPT1A表達高 低的試劑盒，特征在于，其中包含CPT1A基因的引物對或者探針。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中CPT1A表達高 低的基因芯片，特征在于，其中包括固相載體和CPT1A基因的引物對或者探針。
[0009] 進一步地，本發(fā)明提供了CPT1A基因的引物對或者探針在制備通過檢測CPT1A的表 達高低而對急性髓系白血病進行危險度分層或預(yù)后評估的基因芯片或試劑盒中的用途。
[0010] 更進一步地，由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病與CPT1A基因差異表達相關(guān)，因此 本發(fā)明提供CPT1A基因在設(shè)計或制備用于急性髓系白血病檢測、危險度分層或預(yù)后評估的 試劑或試劑盒中的用途。
[0011] 本發(fā)明還提供了 CPT1A在篩選或制備用于治療急性髓系白血病的藥物中的用途。
[0012] 在AML細胞或正常細胞中CPT1A差異表達的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同預(yù)后結(jié)果的 差異表達允許以許多方法使用該信息。例如，可評估特定的治療方案(例如，確定化療藥物 是否改善特定患者的長期預(yù)后）。此外，CPT1A基因表達譜(或個體基因）允許篩選抑制AML表 達譜或?qū)⒉涣碱A(yù)后譜轉(zhuǎn)變成更好的預(yù)后譜的藥物候選物。
[0013] 本發(fā)明也提供了測定AML受試者的預(yù)后的方法，其包括，測量來自受試者的受試樣 品中CPT1A基因產(chǎn)物的水平(其與AML的特定預(yù)后例如好的或積極的預(yù)后、差的或不利的預(yù) 后相關(guān)）。根據(jù)這些方法，與對照樣品中相應(yīng)的CPT1A基因產(chǎn)物的水平相比，受試樣品中與特 定預(yù)后相關(guān)的CPT1A基因產(chǎn)物水平的改變，指示受試者患有具有特定預(yù)后的AMLXPT1A基因 產(chǎn)物表達高與不利（即，差)預(yù)后相關(guān)。不利預(yù)后的實例包括、但不限于，低存活率和疾病快 速進展。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中 CPT1A表達高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物對，所述引物對的序列是下面的序 列或者它們的互補序列：
[0017]在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中 CPT1A表達高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物對，所述引物對的序列是下面的序 列或者它們的互補序列：
[0020]在本發(fā)明的又一個具體實施方案中，提供一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中 CPT1A表達高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物對，所述引物對的序列是下面的序 列或者它們的互補序列：
[0023]在本發(fā)明提供的一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中CPT1A表達高低的試劑盒 的一個具體實施方案中，所述試劑盒包含CPT1A基因的引物對，所述引物對的序列是下面任 一組的序列或者它們的互補序列：
[0033]在本發(fā)明提供的一種檢測急性髓系白血病細胞或組織中CPT1A表達高低的基因芯 片的一個具體實施方案中，所述基因芯片包括固相載體和CPT1A基因的引物對，所述引物對 的序列是下面任一組的序列或者它們的互補序列：
[0043]因此，優(yōu)選地，本發(fā)明也提供了一組引物對，特征在于，其序列是下面任一組的序 列或者它們的互補序列：
[0053]在本發(fā)明更優(yōu)選的技術(shù)方案中提供了一組引物對，所述引物是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO :3的序列或者它們的互補序列：
[0056]優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種基因芯片，特征在于，其包括固相載體和上述引物對 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列。本發(fā)明也提供了一種試劑盒，其 包含上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列。本發(fā)明上述引物 對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列、其基因芯片或試劑盒用于檢測 細胞或組織中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方案中， 上述引物對、基因芯片、試劑盒用于檢測急性髓系白血病細胞或組織中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn) 移酶1A表達高低。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的具體實施方案中，上述引物對、基因芯片、試劑 盒用于非診斷目的檢測急性髓系白血病細胞或組織中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低。 [0057]優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種檢測細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表 達高低的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或 者它們的互補序列、其基因芯片或試劑盒。在本發(fā)明的一個更優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明 提供了一種檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低的 方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的 互補序列、其基因芯片或試劑盒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種 非診斷目的的檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低 的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們 的互補序列、其基因芯片或試劑盒。所述檢測肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低是對離體 細胞或組織樣品的檢測。
[0058] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補 序列在制備通過檢測肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A的表達高低而對急性髓系白血病患者進行 危險度分層或臨床預(yù)后評估的基因芯片中的用途；以及上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列在制備通過檢測肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A的表達高低而 對急性髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估的試劑盒中的用途。
[0059]更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了用于檢測細胞或組織樣品中CPT1A的表達高低的一組引 物對，其序列是SEQ ID Ν0:2和SEQ ID Ν0:3或者它們的互補序列：

[0062] 在一個具體實施方案中，所述CPT1A的序列是SEQ ID M^UPCR擴增產(chǎn)物大小是 219,產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:4。優(yōu)選地，所述細胞或組織樣品是AML細胞或組織樣品，所述檢 測是非診斷目的的檢測。
[0063] 更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種用于檢測CPT1A的表達高低的基因芯片，特征在 于，其包括固相載體和上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補序列。本發(fā) 明也提供了一種用于檢測CPT1A的表達高低的試劑盒，其包含上述引物對SEQ ID N0:2和 SEQ ID N0:3或者它們的互補序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施方案中，上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補序列、基因芯片、試劑盒用于檢測急性髓系白血病 細胞或組織中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體實施方案 中，上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補序列、基因芯片、試劑盒用于非 診斷目的檢測急性髓系白血病細胞或組織中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低。
[0064] 更優(yōu)選地，本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的檢測細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚 ?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低的方法，特征在于，使用本發(fā)明的上述引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列、其基因芯片或試劑盒。更優(yōu)選地，其中所述細胞或組織樣 品是急性髓系白血病細胞或組織樣品。所述檢測肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高低是非診 斷目的的，是對離體細胞或組織樣品的檢測。
[0065] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了用于通過檢測CPT1A的表達高低而對急 性髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估的一組引物對，其序列是SEQ ID N0:2 和SEQ ID NO :3或者它們的互補序列：
[0068]在一個具體實施方案中，所述CPT1A的序列是SEQ ID M^UPCR擴增產(chǎn)物大小是 219,產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:4。
[0069] 在本發(fā)明一個具體實施方案中，提供了用于通過檢測CPT1A的表達高低而對急性 髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估的基因芯片，其包括固相載體和引物，所 述引物是SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的序列或者它們的互補序列。本發(fā)明還提供了序列是 SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3或者它們的互補序列的引物在制備通過檢測CPT1A的表達高低 而對急性髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估的基因芯片中的用途。
[0070] 在本發(fā)明一個具體實施方案中，提供了用于通過檢測CPT1A的表達高低而對急性 髓系白血病患者進行危險度分層或臨床預(yù)后評估的試劑盒，其包含序列是SEQ ID N0:2和 SEQ ID N0:3的引物或者它們的互補序列。本發(fā)明還提供了序列是SEQ ID N0:2和SEQ ID NO: 3或者它們的互補序列的引物在制備通過檢測CPT1A的表達尚低而對急性髓系白血病 患者進行危險度分層或預(yù)后的試劑盒中的用途。
[0071] 在上面的具體實施方案中，使用的引物對可以用SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6代 替，PCR擴增產(chǎn)物大小是203,擴增產(chǎn)物序列是SEQ ID N0:7。使用的引物對還可以是SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9，PCR擴增產(chǎn)物大小是182,擴增產(chǎn)物序列是SEQ ID Nf^KLSEQ ID N0:1 是 CPT1A 的序列，5260bp。
[0072] 進一步地，本發(fā)明還提供了 CPT1A基因在設(shè)計或制備用于急性髓系白血病檢測、危 險度分層或預(yù)后評估的試劑或試劑盒中的用途。
[0073]進一步地，本發(fā)明提供了 CPT1A在篩選或制備用于治療急性髓系白血病的藥物中 的用途。
[0074]本發(fā)明肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因的引物對序列或者它們的互補序列、包含載 體和CPT1A引物對或探針的基因芯片、包含CPT1A引物對或探針的試劑盒、檢測急性髓系白 血病細胞或組織中CPT1A表達高低的方法，可以用于臨床或非臨床檢測CPT1A表達水平，可 以用于診斷或非診斷目的。可以利用本發(fā)明提供的CPT1A基因引物對、芯片、試劑盒，檢測急 性髓系白血病細胞或組織中CPT 1A表達高低的方法，通過對AML患者的細胞或組織樣品檢測 CPT1A的表達高低來對AML患者進行危險度分層并分析臨床預(yù)后。CPT1A高表達的AML患者具 有較高的危險度分層和較差的臨床預(yù)后。CPT1A低表達的AML患者具有較低的危險度分層和 較好的臨床預(yù)后。本發(fā)明提供的CPT1A基因引物、基因芯片、試劑盒還可以用于非臨床或非 診斷目的，包括但不限于實驗室研究，細胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)中CPT1A的檢測，血液制品檢測、 標(biāo)準(zhǔn)控制等等。
[0075]本發(fā)明CPT1A基因的引物對或探針可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行設(shè) 計，可以通過本領(lǐng)域公知的生物或化學(xué)合成技術(shù)制備本發(fā)明的引物或探針?？墒褂枚喾N本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)測量基因產(chǎn)物的表達水平。例如使用RNA印跡分析，Northern Blot，Southern Blot，Western Blot，或者熒光定量PCR檢測，檢測受試樣品中基因產(chǎn)物的 水平低于對照樣品中相應(yīng)的基因產(chǎn)物的水平，或者受試樣品中基因產(chǎn)物的水平高于對照樣 品中相應(yīng)的基因產(chǎn)物的水平。
[0076]附圖簡要描述
[0077]圖1所示是CPT1A在CN-AML患者和正常人組織樣本中的表達及與其它預(yù)后標(biāo)志物 之間的關(guān)系比較圖。
[0078] 圖1A所示是CN-AML患者骨髓組織樣品VS正常人骨髓組織樣品CPT1A表達增高顯示 圖?？v坐標(biāo)是CPT1A表達水平。
[0079] 圖1B所示是CN-AML患者外周血組織樣品VS正常人外周血組織樣品CPT1A表達增高 顯示圖。
[0080]圖1C所示是已知預(yù)后標(biāo)志物在CPT1A表達高低組分布情況進行比較的結(jié)果圖。預(yù) 后不良標(biāo)志物傾向于在CPT 1A高表達組中出現(xiàn)，預(yù)后良好標(biāo)志物傾向于在CPT 1A低表達組中 出現(xiàn)。
[0081 ] 圖2所示是CPT1A在AML和CN-AML患者組織樣品中的檢測及預(yù)后分析顯示圖。
[0082] 圖2A所不是對全部CN-AML和歐洲白血病協(xié)作組（European Leukemia Network， ELN)分組的中危-I患者組織樣品進行CPT1A表達水平與總生存率(Overall Survival，0S) 分析結(jié)果的顯示圖。CPTlAhigh在全部CN-AML和ELN中危-I組中具有較短的0S(p = 0.042，p = 0.013)。縱坐標(biāo)是總生存率;橫坐標(biāo)是生存時間（月）。
[0083] 圖2B所示是對全部CN-AML和ELN中危-I組患者組織樣品進行CPT1A表達水平和無 事件生存率(EFS)分析結(jié)果的顯示圖。CPTlAhigh在全部CN-AML和ELN中危-I組中具有較短的 EFS(p = 0.037，p = 0.008)。縱坐標(biāo)是無事件生存率;橫坐標(biāo)是生存時間（月）。
[0084] 圖2 C所示是對全部AM L患者和美國國立綜合癌癥協(xié)作組（Na t i ο n a 1 Comprehens i ve Cancer Network，NCCN)中危AML患者組織樣品進行CPT ΙΑ表達水平檢測及 預(yù)后分析的結(jié)果顯示圖，CPTlAhigh在全部AML和NCCN中危AML患者組織樣品中具有較短的OS (p = 0.008，p = 0.021)?？v坐標(biāo)是總生存率;橫坐標(biāo)是生存時間（月）。
[0085] 圖2D所示是對全部AML患者和NCCN中危AML患者組織樣品進行CPT1A表達水平檢測 及預(yù)后分析的結(jié)果顯示圖，CPTlAhigh在全部AML和NCCN中危AML患者組織樣品中具有較短的 EFS(p = 0.002，p = 0.024)?？v坐標(biāo)是無事件生存率;橫坐標(biāo)是生存時間（月）。
【具體實施方式】
[0086] CPT1A引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以實時熒光定量PCR檢測 CPT1A表達高低。實時熒光定量PCR常用的熒光染料有Taqman探針、SYBR Green I等。SYBR Green I是一種熒光染料，可以和任意的雙鏈DNA結(jié)合，通過熒光信號的收集，反映模板拷貝 數(shù)的多少。本發(fā)明主要采用SYBR Green I進行實時熒光定量PCR檢測。
[0087] 實施例1總RNA的提取
[0088]實驗操作中，與RNA提取及檢測有關(guān)的微量移液器、Tip槍尖、EP管等均需經(jīng)過無 RNase處理。
[0089] 1、裂解細胞：向收集的細胞沉淀中加入lml的QIAZ0L試劑，振蕩器震蕩混勻，室溫 作用15分鐘以上使其充分裂解。若加入QIAZ0L試劑后不能立刻提取RNA，可將其放入-20°C 保存，短期內(nèi)可用。
[0090] 2、按照氯仿:QIAZ0L體積比為1:4的比例，加入約300μ1氯仿，上下顛倒混勻1分鐘， 室溫靜置5-10分鐘，低溫離心:4°C，12600rpm離心10分鐘。
[0091] 3、離心完畢后，EP管內(nèi)液體分三層，上層為含有RNA的上清液，中下層為DNA和蛋白 質(zhì)。然后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，并加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，低溫靜置10 分鐘，離心:4°C，12600rpm離心15分鐘。
[0092] 4、棄上清，白色沉淀即為RNA，加入lml的75 %乙醇(DEPC水配制），輕輕顛倒混勻， 常溫離心:8000rpm離心5分鐘。
[0093] 5、溶解RNA:去上清，并將EP管倒扣于吸水紙上，吸干管口。再于離心機上空甩幾 秒，用加樣槍將剩余的酒精全部吸出，風(fēng)干3 - 5分鐘。加入一定體積的無核酸酶的水溶解 RNA〇
[0094] 6、紫外分光光度計檢測RNA濃度。提取得到的RNA放-20 °C保存，一個月內(nèi)可用；置 于-80°C則可保存相對較長時間。
[0095] 實施例2RNA反轉(zhuǎn)錄
[0096] 1、按照表1配制反轉(zhuǎn)錄體系，總反應(yīng)體積為25μ1 (總RNA量為lyg)。以下操作均在冰 上進行：
[0097]表1反轉(zhuǎn)錄體系的配制
[0099] 2、將以上各反應(yīng)組分配制到0.2ml的PCR反應(yīng)管中后，放入PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)，程序為37°C，2h; 4°C，forever。反應(yīng)結(jié)束后得到的產(chǎn)物即為cDNA，將反應(yīng)產(chǎn)物取出后放 于-20 °C保存待用。
[0100] 實施例3實時熒光定量PCR檢測
[0101] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0102] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXII混合物，混勻后分裝至兩個0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因肉毒堿棕 櫚?；D(zhuǎn)移酶1A的引物對SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3和內(nèi)參GAPDH的引物(甘油醛-3-磷酸 脫氛酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，輕輕混勾。
[0103] 3、將反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，反應(yīng)程序為95°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:4。
[0104] 4、將獲得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0105]表2real time PCR mix的配制
[0107] 實施例4實時熒光定量PCR檢測
[0108] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0109] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXII混合物，混勻后分裝至兩個0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因肉毒堿棕 櫚?；D(zhuǎn)移酶1A的引物對SEQ ID N0:5和SEQ ID從):6和內(nèi)參6六?0油勺引物，輕輕混勻。
[0110] 3、將反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，反應(yīng)程序為95°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:7。
[0111] 4、將獲得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0112]表2real time PCR mix的配制
[0115] 實施例5實時熒光定量PCR檢測
[0116] 1、按照表2配制real time PCR mix。
[0117] 2、反應(yīng)管中先配制2倍體積的2 X SYBR GreenI，Nuclease_free water，模板cDNA 以及ROXII混合物，混勻后分裝至兩個0.2ml的PCR反應(yīng)管中，再分別加入目的基因肉毒堿棕 櫚?；D(zhuǎn)移酶1A的引物對SEQ ID N0:8和SEQ ID從):9和內(nèi)參6六?0油勺引物，輕輕混勻。
[0118] 3、將反應(yīng)管放入實時熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，反應(yīng)程序為95°C，1分鐘;95 °C，5s; 60°C，20s; -共40個循環(huán)。然后95°C，1分鐘;60°C，1分鐘，95°C，30s。熒光收集點在60 。(：，反應(yīng)結(jié)束后取出PCR產(chǎn)物SEQ ID N0:10。
[0119] 4、將獲得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以GAPDH作為內(nèi)參照。
[0120]表2real time PCR mix的配制
[0122] 實施例6CPT1A在CN-AML患者和正常人骨髓或外周血樣品中的表達檢測與比較及 與其它AML預(yù)后標(biāo)志物之間的比較
[0123] 對原始細胞在70-97 %的CN-AML患者骨髓樣品115例和正常人骨髓樣品5例進行基 因芯片檢測以獲得CPT1A基因的表達水平，試驗條件與實施例1 一2相同，得到圖1A，表明 GSE1159(GSE1159是http://www.ncbi .nlm.ηih.gov/geo中樣本集的索引號）中 115例AML· 者骨髓組織樣品（原始細胞在70-97% )VS 5例正常人骨髓組織樣品CPT1A表達增高（p = 0.017)(圖1A)。以原始細胞在70-97%的AML患者外周血樣品7例，正常人外周血樣品10例進 行CPT1A表達檢測，得到圖1B，表明GSE9476中7例CN-AML患者外周血樣品（原始細胞在70-97%)VS 10例正常人外周血樣品CPT1A表達增高(p = 0)(圖1B)。
[0124] 實施例7CPT1A表達水平的測定及與其它已知CN-AML預(yù)后標(biāo)志物之間的比較
[0125] 根據(jù)實施例1 一 2的試驗條件，利用高通量基因芯片獲取基因表達水平，對CN-AML 患者組織樣品中CPT1A和其它預(yù)后標(biāo)志物的表達水平進行了檢測和比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已知預(yù) 后不良標(biāo)記物傾向于在CPT1A高表達患者中出現(xiàn)，預(yù)后良好標(biāo)志物傾向于在CPT1A低表達組 中出現(xiàn)(圖1C)。
[0126] 實施例8CPT1A的表達水平檢測及與CN-AML其它指標(biāo)的單因素和多因素分析
[0127] 根據(jù)實施例1 一 2的試驗條件，利用高通量基因芯片獲取基因表達水平，基于156例 初治CN-AML患者骨髓樣本對CPT1A的表達水平和CN-AML其它指標(biāo)進行單因素和多因素分 析。
[0128] 單因素檢測及分析結(jié)果證實：在CPTlAhlgh組，1)更多的CN-AML患者屬于沁（？= 0·03) ;2)攜帶FLT3-ITD的比例更高（p = 0·05);3)具有較高的ERG、BAALC、WTl、 MT3B、 DNMT3A、MAPKBP1、ITPR2、ATP 1B1、RUNX1、TCF4 和 CXXC5 的表達（均 ρ<0·05)(表 3)。
[0129] 多因素分析中同樣證實：與其它預(yù)后不良因素比較，不管是在全部的CN-AML中還 是CN-AML的ELN Intermediate-I分組中，CPTlAhigh均為0S和EFS的高風(fēng)險因子(表4)。
[0130] 表3: CPT1A的表達水平與CN-AML相關(guān)指標(biāo)的單因素分析

[0132] FAB,French-American-British classification；ITD, internal tandem dupl ication；TKD,tyrosine kinase domain.
[0133] 表4:CPT1A的表達水平在整體CN-AML和ELN中危-I組CN-AML中預(yù)后評估的多因素 分析
[0135] 實施例9CPT1A高表達是AML及CN-AML患者的不良預(yù)后標(biāo)志物
[0136] 根據(jù)實施例1 一2的試驗條件，利用高通量基因芯片獲取基因表達水平，對334例 AML患者的組織樣品進行表達水平檢測，并進行預(yù)后分析。圖2所示是CPT1A在AML或CN-AML 患者組織樣品中的預(yù)后分析顯示圖。在全部AML(334例）中，有較短0S(p = 0.008)和EFS(p = 0.002)(圖2C、D)。在NCCN指南中危組AML中，CPTlAhigh同樣具有較短的0S (p = 0.0021)和 EFS(p = 0.0024)(圖 2C、D)。
[0137] 利用高通量基因芯片獲取CPT1A基因的表達水平，基于CPT1A表達水平對156例CN-AML組織樣品進行預(yù)后分析，在全部CN-AML患者中（156例）中，CPT1 Ahigh具有較短的OS (p = 0.042)和EFS(p = 0.037)(圖1A、B)。圖2A所示是對全部CN-AML和歐洲白血病協(xié)作組 (European Leukemia Network，ELN)分組的中危-I患者組織樣品進行CPT1A表達水平與總 生存率(Overall Survival，0S)分析結(jié)果的顯示圖。CPTlAhigh在全部CN-AML和ELN中危-I組 中具有較短的 0S(p = 0.042，p = 0.013)。
[0138] 圖2B所示是對全部CN-AML和ELN分類中中危-I組患者組織樣品進行CPT1A表達水 平和無事件生存率分析結(jié)果的顯示圖。CPTlAhigh在全部CN-AML和ELN中危-I組中具有較短 的已？3(? = 0.037，？ = 0.008)。圖2(：所示是對全部41^患者和美國國立綜合癌癥協(xié)作組 (National Comprehensive Cancer Network，NCCN)中危AML患者組織樣品進行預(yù)后分析的 結(jié)果顯示圖，CPTlAhigh在全部AML和NCCN中危AML患者組織樣品中具有較短的0S(p = 0.008， p = 0.021)。圖2D所示是對全部AML患者和NCCN中危AML患者組織樣品進行預(yù)后分析的結(jié)果 顯示圖，CPTlAhigh在全部AML和NCCN中危AML患者組織樣品中具有較短的EFS (p = 0.002，p = 0.024)〇
[0139] 結(jié)論：1)CPT1A高表達是AML患者的預(yù)后不良標(biāo)志物;2)CPT1A高表達是CN-AML患者 的預(yù)后不良產(chǎn)物;3)CPT1A高表達在AML的NCCN中危組和CN-AML的ELN中危-I組中均是預(yù)后 不良標(biāo)志物，因此CPT1A高表達可以作為預(yù)后標(biāo)志物進一步細化AML患者危險度分層和預(yù)后 評估。CPT1A高表達的AML樣品具有較高的危險度分層和較差的臨床預(yù)后。CPT1A低表達的 AML樣品具有較低的危險度分層和較好的臨床預(yù)后。
[0140] 上述實施例只是為了詳細說明本發(fā)明，而不是在任何方面限制本發(fā)明的保護范 圍。




【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A表達高 低的試劑盒，特征在于，其中包含肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1Α基因的引物對或者探針。2. -種用于檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α表達高 低的基因芯片，特征在于，其中包括固相載體和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α基因的引物對或 者探針。3. -種檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α表達高低的 方法，特征在于，使用肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α基因的引物對或者探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求1的檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α 表達高低的試劑盒，特征在于，其中所述肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1Α基因的引物對是下面任 一組的序列或者它們的互補序列： 第一組引物對： LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3 第二組引物對： LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對： LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID N0：9〇5. 根據(jù)權(quán)利要求2的檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A 表達高低的基因芯片，特征在于，其中所述肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因的引物對是下面 任一組的序列或者它們的互補序列： 第一組引物對： LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3 第二組引物對： LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對： LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID N0：9〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3的檢測急性髓系白血病細胞或組織樣品中肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1A 表達高低的方法，特征在于，其中所述肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因的引物對是下面任一 組的序列或者它們的互補序列： 第一組引物對： LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3 第二組引物對： LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對： LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9〇7. -組引物對，特征在于，其序列是下面任一組的序列或者它們的互補序列： 第一組引物對： 第一組引物對： LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2 RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3 第二組引物對： LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5 RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6 或者 第三組引物對： LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8 RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID N0：9〇8. 肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因的引物對或者探針在制備通過檢測肉毒堿棕櫚?；?轉(zhuǎn)移酶1A的表達高低而對急性髓系白血病進行危險度分層或預(yù)后評估的基因芯片或試劑 盒中的用途。9. 肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因在設(shè)計或制備用于急性髓系白血病檢測、危險度分層 或預(yù)后評估的試劑、試劑盒或基因芯片中的用途。10. 肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因在篩選或制備用于治療急性髓系白血病的藥物中的 用途。
【文檔編號】C12N15/11GK105969867SQ201610343883
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】石金龍, 付林, 付華平, 王衛(wèi)東
【申請人】石金龍