使用鎖式探針的基于rca的局部擴(kuò)增方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于進(jìn)行包括至少兩輪RCA的局部RCA反應(yīng)的方法，其中第二RCA反應(yīng)的產(chǎn)物附著并從而局限于第一RCA反應(yīng)的產(chǎn)物，所述方法包括：(a)提供包含重復(fù)單體的多聯(lián)體第一RCA產(chǎn)物；(b)將包含靶互補(bǔ)3’和5’末端區(qū)的可環(huán)化的寡核苷酸與所述第一RCA產(chǎn)物的單體直接或間接雜交，以便所述寡核苷酸的3’和5’末端并置地雜交以彼此直接或間接地連接，其中所述靶為所述第一RCA產(chǎn)物的單體或與其雜交的中間分子中的序列，并且其中所述可環(huán)化的寡核苷酸的靶互補(bǔ)末端區(qū)的長度為6個至16個核苷酸；(c)將所述可環(huán)化的寡核苷酸的末端直接或間接連接以環(huán)化寡核苷酸，從而提供用于第二RCA反應(yīng)的模板，其中當(dāng)所述末端間接連接時，(i)提供在可環(huán)化的寡核苷酸的3’與5’末端之間與第一RCA產(chǎn)物的單體雜交，以便其可連接于各自末端的間隙寡核苷酸，或通過聚合酶延伸可環(huán)化的寡核苷酸的雜交的3’末端以便延伸的3’末端可連接于雜交的5’末端，并且(ii)與單體直接或間接雜交的第二RCA模板的區(qū)域的總長度不長于32個核苷酸；和(d)使用(c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物進(jìn)行第二RCA反應(yīng)，以形成第二RCA產(chǎn)物，其中在所述第二RCA反應(yīng)中，所述第二RCA模板保持附著于第一RCA產(chǎn)物，從而第二RCA產(chǎn)物附著于所述第一RCA產(chǎn)物。
【專利說明】
使用鎖式探針的基于RCA的局部擴(kuò)増方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明總體上屬于利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的核酸擴(kuò)增領(lǐng)域，具體屬于在至少兩輪擴(kuò) 增中產(chǎn)生基于RCA的局部高度線性擴(kuò)增的構(gòu)思。第二(或進(jìn)一輪)RCA反應(yīng)的產(chǎn)物并非以物理 方式源自第一(或更早的)RCA產(chǎn)物，并且第二輪或進(jìn)一輪的RCA擴(kuò)增提供了用于放大可從滾 環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)獲得的信號的方式。本發(fā)明的方法包括通過第二單獨(dú)的RCA模板的RCA產(chǎn)生第二 RCA產(chǎn)物。第二RCA模板由所謂的鎖式探針提供，所述鎖式探針是可環(huán)化寡核苷酸，其以使所 述寡核苷酸的末端可直接或間接相互連接以形成與第一 RCA產(chǎn)物拓?fù)溥B接(成鏈或"連鎖"） 的環(huán)化寡核苷酸的方式與第一 RCA產(chǎn)物雜交。與預(yù)期相反，發(fā)現(xiàn)可能實現(xiàn)與第一 RCA產(chǎn)物拓 撲連接的此類鎖式探針的高效RCA，即有用水平上的RCA。由于第二RCA模板物理附著于第一 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物，并且被延伸以形成第二RCA產(chǎn)物的用于第二RCA的引物附著(雜交)于和保 持附著(雜交)于第二RCA模板，因此可獲得其中第二RCA反應(yīng)的產(chǎn)物附著于第一反應(yīng)的產(chǎn)物 的局部擴(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明提供了此類方法，并且在來自基于檢測RCA產(chǎn)物的檢測測定的信號 的放大中特別有用。
【背景技術(shù)】
[0002] 滾環(huán)復(fù)制(RCR)是實質(zhì)上用于環(huán)狀DNA分子諸如質(zhì)?；虿《镜膹?fù)制的機(jī)制。該反應(yīng) 已被采用作為用于擴(kuò)增環(huán)狀分子的實驗室方法的基礎(chǔ)，并且已被證實可用于多種使用或產(chǎn) 生環(huán)狀核酸分子作為報告分子的測定中，其中通過RCA擴(kuò)增(復(fù)制)環(huán)狀分子，并且檢測復(fù)制 或擴(kuò)增的環(huán)狀核酸分子。在其它方法中，可通過RCA來環(huán)化并擴(kuò)增所需分子或靶分子。因此， 滾環(huán)復(fù)制(RCR)現(xiàn)在通常被稱為滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，并且這些術(shù)語在本文中可互換使用。
[0003] RCA涉及使用環(huán)狀單鏈核酸分子例如寡核苷酸作為滾環(huán)模板，并使用鏈置換聚合 酶延伸與所述環(huán)狀模板雜交的引物(所述鏈置換活性置換引物并有效地使環(huán)"滾動"）進(jìn)行 的核酸分子的合成。引物在某些典型測定中可由靶核酸(RNA或DNA)分子提供。聚合酶和核 苷酸的添加啟動合成反應(yīng)，即聚合。由于滾環(huán)模板是無盡的，因此所得產(chǎn)物是由與滾環(huán)模板 互補(bǔ)的串聯(lián)重復(fù)組成的長單鏈核酸分子(即多聯(lián)體）。
[0004] 實際上，RCA反應(yīng)通常利用線性核酸分子，例如寡核苷酸諸如在下文中更詳細(xì)描述 的鎖式探針，通常通過例如使用連接酶將所述核酸分子的末端連接在一起來操縱所述核酸 分子以產(chǎn)生環(huán)狀核酸模板分子。例如，可通過與用作連接模板的祀核酸分子上的相鄰序列 雜交來將核酸分子的末端彼此接近。環(huán)狀核酸分子的形成使得其在RCA反應(yīng)中能夠被拷貝。 該反應(yīng)可通過向封閉環(huán)添加引物來引發(fā)，或可從靶核酸分子即連接模板產(chǎn)生引物。初始引 物從而形成RCA產(chǎn)物的部分。這可以是特別有利的，因為其可允許對靶核酸進(jìn)行局部檢測， 即在其中固定用于引發(fā)RCA的核酸分子的實施方式中，所述RCA產(chǎn)物也將被固定。
[0005] 因此，RCA產(chǎn)物可保留作為核酸環(huán)的一串串聯(lián)重復(fù)互補(bǔ)拷貝（多聯(lián)體），其對于原位 檢測是特別有用的，但也可在均相（"溶液中"）測定中被檢測到。例如，RCA反應(yīng)可在僅1小時 內(nèi)導(dǎo)致環(huán)的1000倍擴(kuò)增(基于由約100個核苷酸組成的環(huán)）。因此，環(huán)狀寡核苷酸的RCA可產(chǎn) 生形成直徑可為約Ιμπι的DNA束或"串滴(blob)"的RCA產(chǎn)物。所述產(chǎn)物（即串滴)可通過綴合 于熒光標(biāo)記的核酸探針的雜交來檢測，所述雜交允許通過熒光顯微鏡術(shù)或流式細(xì)胞術(shù)使串 滴可視化。在其它實施方式中，可通過用限制性內(nèi)切酶或核酶進(jìn)行消化來將RCA產(chǎn)物還原成 單體，隨后檢測所述單體。
[0006] 由于RCA反應(yīng)產(chǎn)生可容易檢測的信號的能力，因此其用作用于檢測樣品中的任何 核酸分子的報告系統(tǒng)，所述核酸分子可以是革G核酸分子(即待檢測的核酸分子，或其中所述 核酸分子是測定的"分析物"），或其可以是待檢測作為靶分析物存在的標(biāo)志物(或替代物） 的核酸分子。因此，RCA反應(yīng)已被用于直接檢測細(xì)胞和組織樣品中的靶核酸，例如核酸分子 的原位（即局部)檢測，這對于研究和診斷目的具有重大意義。然而，RCA測定不限于用于非 均相形式，而且還可用于均相測定(參見例如W0 2009/037659)。
[0007] RCA也已被用于用于檢測其它分析物，即除核酸分子外的分析物諸如蛋白質(zhì)、肽等 的方法。在這方面，已開發(fā)了多種測定法，其中核酸分子可用于直接或間接標(biāo)識或標(biāo)記樣品 中的靶分析物，并且所述核酸分子的檢測用于指示分析物在樣品中的存在。在一些方法中， 當(dāng)一種或多種分子與靶分析物相互作用(例如，結(jié)合)時，可在樣品中產(chǎn)生新的核酸分子(即 不存在于原始樣品中并且不是添加至樣品的組分之一的核酸分子）。所產(chǎn)生的核酸分子的 檢測指示樣品中的所述分析物。
[0008] 在本領(lǐng)域中詳盡描述了基于使用RCA反應(yīng)作為檢測策略的部分來檢測此類替代物 或標(biāo)志核酸分子的各種方法，包括例如免疫-RCA、使用鎖式探針的測定和產(chǎn)生環(huán)狀核酸分 子的接近式探針的測定。在所有這些情況下，所述方法依賴于提供或產(chǎn)生隨后可用作RCA反 應(yīng)的底物(模板）的環(huán)狀核酸分子，并且RCA產(chǎn)物隨后可被檢測作為用于直接檢測靶分析物 的替代物。
[0009] 免疫-RCA包括利用核酸分子標(biāo)記特定靶分析物的抗體。通常，靶分析物例如被第 一抗體捕獲在底物上，并與抗體:核酸復(fù)合物接觸。將環(huán)狀(或可環(huán)化的)寡核苷酸與綴合于 所述抗體的核酸分子雜交(可預(yù)先雜交所述寡核苷酸，或在已使抗體與靶分析物相互作用 后添加所述寡核苷酸）。可在將樣品經(jīng)歷RCA以擴(kuò)增環(huán)狀/環(huán)化的寡核苷酸之前洗掉過量的 抗體。綴合于抗體的核酸分子用作RCA的引物。因此，RCA產(chǎn)物被系連于與靶分析物相互作用 的抗體，從而允許局部檢測樣品中（例如細(xì)胞或組織樣品中）的分析物。
[0010] 接近式測定依賴于〃接近探測〃的原理，其中通過多個（即2個或更多個，通常2個或 3個)探針的結(jié)合來檢測分析物，所述探針，當(dāng)通過結(jié)合于分析物而被拉近(從而稱為"接近 式探針"）時，允許信號產(chǎn)生。通常，接近式探針的至少一個包含連接于探針的分析物結(jié)合域 的核酸域，并且信號的產(chǎn)生牽涉核酸部分和/或由其它（多個)探針攜帶的其它功能性部分 之間的相互作用。因此信號的產(chǎn)生取決于探針之間的相互作用（更具體地講是通過核酸或 由它們攜帶的其它功能性部分/域進(jìn)行），并因而僅當(dāng)探針已結(jié)合于分析物時才發(fā)生，從而 賦予檢測系統(tǒng)提高的特異性。近年來接近探測的構(gòu)思已得到發(fā)展，并且許多基于該原理的 測定現(xiàn)在本領(lǐng)域中是公知的。例如，接近式連接測定(PLA)依賴于接近式探針與分析物的靠 近結(jié)合，以從牽涉接近式探針的核酸域的或由所述核酸域(例如在其之間和/或以其為模 板)介導(dǎo)的連接反應(yīng)產(chǎn)生信號。
[0011]接近式探針的核酸域在接近時，基于所謂的鎖式探針原理(如例如由Landegren等 人在W0 99/49079中描述的），可作為一個或多個添加的寡核苷酸的彼此連接(包括分子內(nèi) 連接)的模板來環(huán)化一個或多個添加的線性寡核苷酸，從而形成核酸環(huán)。在此類方法中，通 過與由一個或多個接近式探針的核酸域提供的一個或多個環(huán)化模板雜交使（多個)添加的 線性寡核苷酸的末端并置以便連接。各種此類測定式描述于W0 01/61037中。
[0012]因此明顯的是，RCA可在樣品中任何核酸分子的特異性檢測中具有效用，無論其為 樣品中的"原始"靶分析物，還是其為通過特定檢測分子(例如接近式探針）與靶分析物(例 如蛋白質(zhì)）的相互作用產(chǎn)生的"替代"靶分析物。RCA還可用于檢測擴(kuò)增的核酸分子。例如，在 其中靶核酸分子以低量存在的樣品（例如稀有轉(zhuǎn)錄物）中，RCA可用于通過增加可用于被檢 測的核酸的量來"增強(qiáng)"檢測。
[0013]已提出基本RCA反應(yīng)的各種改進(jìn)，包括提供尚度線性擴(kuò)增，例如以提尚基于檢測 RCA產(chǎn)物的測定的靈敏度。
[0014] 這些方法中的許多方法包括進(jìn)一步擴(kuò)增在第一RCA反應(yīng)中產(chǎn)生的信號，即基于第 一 RCA產(chǎn)物的擴(kuò)增。一般地這些方法集中在使用第一 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物作為引物延伸的模板的 技術(shù)上。例如，在超分支RCA反應(yīng)(HBRCA)中，引物與通過第一RCA反應(yīng)產(chǎn)生的多聯(lián)體RCA產(chǎn)物 中的每一個串聯(lián)重復(fù)雜交。隨后使用第一 RCA產(chǎn)物作為模板延伸引物。隨著每一個引物被延 長，其遇到下游引物的產(chǎn)物并置換其以產(chǎn)生原始第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)物的序列的單鏈串聯(lián)重復(fù)。 此外，第一 RCA反應(yīng)的引物可隨后與產(chǎn)生的(被置換的)單鏈中的串聯(lián)重復(fù)雜交，并延伸以形 成另外的置換鏈，依此類推。因此，交替的鏈拷貝和鏈置換過程產(chǎn)生DNA分支的連續(xù)擴(kuò)展模 式，并且依靠鏈置換，還產(chǎn)生一組離散的包含具有環(huán)的單位長度及其多倍長度的雙鏈小片 段的游離DNA片段。這由Lizardi在Nature Genetics 1998,19,225-2323和W0 97/19193中 進(jìn)行了描述。
[0015] 類似方法是DNA級聯(lián)反應(yīng)，如由Koch在W0 97/20948中描述的，但在該情況下引物 延伸時間受到控制，以使鏈的拷貝不進(jìn)行至末端，并且被置換的鏈仍然附著于模板(RCA產(chǎn) 物)。
[0016] 在W0 03/012199中，描述了基于重復(fù)RCA反應(yīng)的稱為環(huán)對環(huán)（circle-to-circle) (C2C)法的方法，該方法還可用于擴(kuò)增從第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)生的信號。同樣，第一代RCA產(chǎn)物用 作用于延伸與所述產(chǎn)物雜交的引物的模板。然而，在該方法中，第一代RCA產(chǎn)物被切割成單 體(每一個單體對應(yīng)于多聯(lián)體產(chǎn)物中的一個串聯(lián)重復(fù)），所述單體被環(huán)化，并隨后在進(jìn)一輪 RCA中用作RCA模板。由于在該方法中第一RCA產(chǎn)物被切割，因此第二RCA產(chǎn)物不可能局限至 第一產(chǎn)物。
[0017] 雖然已描述了基于進(jìn)行初始RCA產(chǎn)物的二次擴(kuò)增的用于信號放大的方法，但存在 對開發(fā)具有增強(qiáng)的靈敏度和/或性能，例如具有更強(qiáng)的信號、更快的信號產(chǎn)生和/或提高的 信噪比的測定的持續(xù)需要。特別地，存在對開發(fā)其中第二信號可被局限于第一信號的測定 (例如(但不僅僅)在原位檢測方法的情況下）的需要。在某些情況下將基于初始檢測產(chǎn)物的 信號檢測偶聯(lián)和共局限于基于二次檢測產(chǎn)物的信號檢測可以是有用的或需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明涉及解決此需求，并且基于進(jìn)行第二RCA反應(yīng)的構(gòu)思，所述第二RCA反應(yīng)取 決于第一 RCA反應(yīng)，但不擴(kuò)增第一 RCA產(chǎn)物，以放大可通過第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)生的信號（換句話 說，以通過第二RCA產(chǎn)生更多的可被檢測到以產(chǎn)生信號的〃信號產(chǎn)物〃）。本發(fā)明的方法的重 要特征是第二RCA產(chǎn)物物理附著于第一RCA產(chǎn)物并且保持所述附著，以使來自第二RCA產(chǎn)物 的信號被局限于第一RCA產(chǎn)物。
[0019] 在US 5,854,033中，Lizardi描述了稱為巢式連接介導(dǎo)的RCA(巢式LM-RCA)的方 法。LM-RCA包括基于與鎖式探測類似的原理產(chǎn)生RCA產(chǎn)物，其中可環(huán)化的寡核苷酸(稱為〃開 環(huán)探針"，但實質(zhì)上為鎖式探針)與靶核酸序列（如果存在的話)雜交，隨后被連接以形成環(huán)。 連接后，引物與所述環(huán)雜交，并且進(jìn)行RCA反應(yīng)以產(chǎn)生包含環(huán)的串聯(lián)重復(fù)的互補(bǔ)拷貝的線性 RCA產(chǎn)物(稱為"串聯(lián)序列DNA; TS-DNA)。在巢式LM-RCA反應(yīng)中，建議的是，為了放大信號，可 將另外的可環(huán)化的寡核苷酸與TS-DNA雜交，連接，隨后經(jīng)歷第二輪RCA。然而，此類反應(yīng)的實 際性能未被證明，此外，建議在此類方法中，在RCA反應(yīng)過程中，環(huán)化的寡核苷酸可被置換， 從而與其靶(與所述環(huán)化寡核苷酸雜交的）分離。因此，對于其中期望局限化信號的原位方 法，US 5,854,033提出了其中連接第一可環(huán)化的寡核苷酸(00?)但不進(jìn)行擴(kuò)增，并且將第二 可環(huán)化的寡核苷酸與所述第一環(huán)化的寡核苷酸(OCP)雜交的替代方法。因此，迄今還不相信 結(jié)合于第一 RCA產(chǎn)物的鎖式探針(TS-DNA)的RCA會導(dǎo)致局部第二RCA反應(yīng)。
[0020] 此外，迄今已相信，在其靶分子上的環(huán)化的鎖式探針的拓?fù)渎?lián)接可抑制RCA，（見 Baner等，1998Nucleic Acids Research 26(22) ,5073-5078)。此類拓?fù)湟种瓶赏ㄟ^切割革巴 分子以生成靠近環(huán)化的且成鏈的鎖式探針的靶3'末端來減弱，這允許RCA繼續(xù)。因此，被認(rèn) 為不可能的是可進(jìn)行基于結(jié)合于第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)物的鎖式探針的局部第二RCA反應(yīng)。
[0021] 基于該信念，本發(fā)明的發(fā)明人轉(zhuǎn)而開發(fā)了稱為超級RCA(sRCA)的局部第二RCA法， 其中將引物與第一 RCA產(chǎn)物雜交，并用于擴(kuò)增本身不結(jié)合或雜交于第一反應(yīng)產(chǎn)物的第二RCA 模板環(huán)（分別于2012年11月14日和2013年5月23日提交的英國專利第1220503.5和 1309327.3號，對應(yīng)于W0 2014/076209 A1)。
[0022] 然而，與預(yù)期相反，通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)設(shè)計，發(fā)現(xiàn)實際上可能開發(fā)使用鎖式探針的基 于局部第二RCA的擴(kuò)增法。具體地，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)通過減小鎖式探針的靶雜交部分(區(qū)域） (即探針的靶互補(bǔ)末端區(qū)，g卩3 '和5 '末端序列）的大小，可能對第一RCA產(chǎn)物上的結(jié)合并成鏈 的（即"連鎖的"）的鎖式探針進(jìn)行RCA反應(yīng)。此外，如將在下面實施例中更詳細(xì)描述的，可獲 得的結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的量和/或速率足以表明沿著第一 RCA產(chǎn)物的長度結(jié)合的多個 鎖正被復(fù)制(經(jīng)歷RCA)。因此，據(jù)信，通過使用具有特定大小范圍的靶結(jié)合位點（靶互補(bǔ)區(qū)） 的鎖進(jìn)行第二RCA反應(yīng)，可獲得沿第一 RCA產(chǎn)物的長度結(jié)合的多個鎖的第二RCA，并且不只是 結(jié)合于第一 RCA產(chǎn)物的游離末端上的一個鎖的第二RCA。
[0023] 如上所提及的，通過環(huán)化的鎖的RCA產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物，所述環(huán)化的鎖用作用于第 二RCA反應(yīng)的模板?？商峁㏑CA引物來與鎖式探針預(yù)雜交，或可在鎖式探針已與第一 RCA產(chǎn)物 雜交后，或在鎖式探針環(huán)化(連接)后添加所述RCA引物。通過RCA引物的延伸產(chǎn)生第二RCA產(chǎn) 物，所述RCA產(chǎn)物通過其與用于第二RCA的模板雜交而與第一 RCA產(chǎn)物間接雜交，從而附著于 所述第一 RCA產(chǎn)物。第一 RCA產(chǎn)物是包含第一 RCA反應(yīng)的模板環(huán)(〃第一 RCA環(huán)〃)的串聯(lián)重復(fù)互 補(bǔ)拷貝的多聯(lián)體，并且提供用于第二RCA的RCA模板的鎖式探針被設(shè)計來結(jié)合在整個第一 RCA產(chǎn)物中重復(fù)的其同源探針-結(jié)合序列的重復(fù)拷貝。換句話說，第一RCA產(chǎn)物將包含用于鎖 式探針的重復(fù)結(jié)合位點（每一個串聯(lián)重復(fù)（多聯(lián)體的"單體"）中至少一個）。每一個此類鎖， 當(dāng)環(huán)化時，可作為第二RCA反應(yīng)的模板，從而導(dǎo)致增加的(高度線性)擴(kuò)增。
[0024]本發(fā)明的方法允許第二RCA被局限于第一RCA。如將在下文中進(jìn)一步解釋的，這在 靶分析物的局部(空間)檢測中（例如，在原位檢測方法中）可具有益處。
[0025]由第二RCA反應(yīng)提供的強(qiáng)信號放大可增強(qiáng)方法的靈敏度并且提供容易地檢測RCA 產(chǎn)物或使其可視化(例如在低顯微鏡放大倍數(shù)下，或利用數(shù)字成像掃描法，或可能甚至無需 借助顯微鏡）的能力。來自增加的量的第二RCA產(chǎn)物的強(qiáng)信號還可打開在RCA基檢測測定中 使用其它檢測方式(例如流式細(xì)胞術(shù)）的可能性，從而增加可能用于這些測定的儀器基礎(chǔ)。 可以甚至通過可能的第三代或進(jìn)一代RCA(其全都依靠用于每一代RCA的模板來聯(lián)系，所述 模板，通過結(jié)合先前的RCA反應(yīng)的RCA產(chǎn)物，使先前的RCA產(chǎn)物與下一代RCA產(chǎn)物發(fā)生聯(lián)系)來 進(jìn)一步增強(qiáng)信號放大。
[0026] 此外，由于可在第一RCA反應(yīng)過程中（即當(dāng)?shù)谝籖CA產(chǎn)物形成時，或當(dāng)?shù)谝籖CA反應(yīng) 正在進(jìn)行時）啟動第二RCA反應(yīng)，因此可實現(xiàn)更快的信號產(chǎn)生，從而導(dǎo)致更快速的測定。
[0027] 鑒于該兩代以上RCA的偶聯(lián)產(chǎn)生增強(qiáng)的和更快的信號放大以及使用鎖式探針來提 供用于連續(xù)RCA反應(yīng)的RCA模板，我們已將該新方法稱為鎖式超級RCA(鎖式sRCA)。
[0028] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行包括至少兩輪RCA的局部RCA反應(yīng)的方 法，其中第二RCA反應(yīng)的產(chǎn)物附著并從而局限于第一 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物，所述方法包括：
[0029] (a)提供包含重復(fù)的單體的多聯(lián)體第一 RCA產(chǎn)物；
[0030] (b)將包含靶互補(bǔ)3 '和5 '末端區(qū)的可環(huán)化的寡核苷酸與所述第一 RCA產(chǎn)物直接或 間接雜交，以便所述寡核苷酸的3'和5 '末端并置地雜交以彼此直接或間接地連接，其中所 述靶為所述第一 RCA產(chǎn)物的單體或與其雜交的中間分子中的序列，并且其中所述可環(huán)化的 寡核苷酸的祀互補(bǔ)末端區(qū)的長度為6至16個核苷酸；
[0031] (c)將所述可環(huán)化的寡核苷酸的末端直接或間接連接以環(huán)化寡核苷酸，從而提供 用于第二RCA反應(yīng)的模板，其中當(dāng)所述末端間接連接時，（i)提供在可環(huán)化的寡核苷酸的3' 與5'末端之間與第一RCA產(chǎn)物的單體雜交，以便其可連接于各自末端的間隙寡核苷酸，或通 過聚合酶延伸可環(huán)化的寡核苷酸的雜交的3 '末端以便延伸的3 '末端可連接于雜交的5 '末 端，并且(ii)與單體直接或間接雜交的第二RCA模板的區(qū)域的總長度不長于32個核苷酸。 [0032] (d)使用（c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物進(jìn)行第二RCA反應(yīng)，其 中在所述第二RCA反應(yīng)中，所述第二RCA模板(環(huán)化的寡核苷酸)保持附著于第一RCA產(chǎn)物，從 而第二RCA產(chǎn)物附著于所述第一 RCA產(chǎn)物。
[0033] 因此，在步驟(d)中，第二RCA產(chǎn)物(延伸的第二RCA引物)與第二RCA模板雜交，從而 經(jīng)由或通過第二RCA模板附著于第一RCA產(chǎn)物。換句話說，由于其與第二RCA模板雜交，因此 第二RCA產(chǎn)物間接附著于第一 RCA產(chǎn)物。因此，第二RCA模板在第二RCA反應(yīng)過程中沒有從第 一 RCA產(chǎn)物被置換的事實促使第二RCA產(chǎn)物附著于第一 RCA產(chǎn)物。
[0034] 可同時或相繼地進(jìn)行步驟(a)、（b)、（c)和(d)，但優(yōu)選相繼地進(jìn)行它們。
[0035] 從本發(fā)明的上述定義將認(rèn)識到的是，可環(huán)化的寡核苷酸實際上是鎖式探針。即，可 環(huán)化的寡核苷酸是線性單鏈核酸分子，如例如圖1中所描繪的，其在其3 '和5 '末端包含靶互 補(bǔ)區(qū)。具體地，可環(huán)化的寡核苷酸不具有二級結(jié)構(gòu)，更具體地不包含分子內(nèi)雙鏈區(qū)或莖-環(huán) 結(jié)構(gòu)。使用第一 RCA產(chǎn)物或與其雜交的中間分子作為連接模板直接或間接地將環(huán)化的寡核 苷酸的各自的5 '和3 '末端連接在一起，從而直接形成用于第二RCA反應(yīng)的環(huán)狀模板(即第二 RCA模板通過連接反應(yīng)直接形成）。更具體地，不存在寡核苷酸的切割的間插步驟來形成第 二RCA模板。
[0036]當(dāng)通過連接環(huán)化寡核苷酸(探針)時，其與已與其結(jié)合(雜交）的分子，即與第一 RCA 產(chǎn)物或與其雜交的中間核酸分子拓?fù)涞剡B接或成鏈。在過去，據(jù)信可環(huán)化的鎖式探針的RCA 可導(dǎo)致探針的置換，但我們已觀察到在本發(fā)明的方法中，鎖沒有被置換并且保持附著于它 們的靶(例如，第一 RCA產(chǎn)物）。然而不希望受理論束縛，據(jù)信鎖式探針與靶分子中存在的多 個結(jié)合位點（例如，多聯(lián)體第一 RCA產(chǎn)物(或與其結(jié)合的中間分子)的串聯(lián)重復(fù)單體的每一個 中的至少一個)的串聯(lián)結(jié)合阻止或限制環(huán)化的和結(jié)合的（成鏈的）鎖沿著核酸鏈的擴(kuò)散。此 外，沿靶分子結(jié)合的多個鎖的存在將阻斷（即阻止或抑制)在作為模板的第一 RCA產(chǎn)物上的 任何不需要的延伸）。每一個結(jié)合的鎖式探針實際上將起著置換阻斷的作用，阻止或限制置 換下游鎖式探針的任何不需要的延伸。此類不需要的延伸可以例如從未連接的鎖式探針或 存在于反應(yīng)混合物中的與第一 RCA產(chǎn)物非特異性雜交的其它核酸分子發(fā)生。
[0037]為了保持第二RCA產(chǎn)物至第一 RCA產(chǎn)物的局限化，第二RCA模板(環(huán)化的寡核苷酸） 保持(直接或間接)附著于第一 RCA產(chǎn)物的事實是非常重要的。如上所指出的，因此本發(fā)明的 方法的特征是使用第一 RCA產(chǎn)物作為模板的延伸不能發(fā)生或確實發(fā)生的任何延伸受到限制 以便不存在任何下游環(huán)化的寡核苷酸的置換。更具體地，本發(fā)明的進(jìn)一步特征是使用第一 RCA產(chǎn)物作為模板進(jìn)行的任何未連接的可環(huán)化的寡核苷酸或任何未連接的間隙寡核苷酸 (如果存在的話)的任何延伸受到限制，以避免下游環(huán)化的寡核苷酸的置換。如上所解釋的， 連接的和成鏈的鎖式探針起著阻止任何進(jìn)一步延伸和任何下游探針的置換的阻斷的作用。 成鏈的鎖實際上是延伸和/或置換阻斷。
[0038] 延伸還可能從非特異性雜交的分子，或從被外切核酸酶作用降解的雜交的分子發(fā) 生，從而留下能夠延伸的雜交的3'末端。如將在下文中更詳細(xì)描述的，在一個實施方式中， 此類延伸可通過將"外切核酸酶阻斷區(qū)"并入用于本方法的核酸試劑中，以阻止外切核酸酶 消化產(chǎn)生能夠在第一 RCA模板上引發(fā)的引物，和/或通過確保在反應(yīng)混合物中不存在外切核 酸酶活性(例如，通過使用不具有外切核酸酶活性的聚合酶)來阻止或限制。此外，還如將在 下面更詳細(xì)地描述的，可使用阻斷性基團(tuán)和/或阻斷性寡核苷酸，其本身被阻止延伸和置 換，在鎖式探針之間雜交。這樣，確實發(fā)生的以任何第一 RCA產(chǎn)物為模板的延伸可被限制而 不延伸至任何下游雜交的探針中并置換所述探針。然而，此類外切核酸酶阻斷區(qū)或添加的 置換塊的使用不是必需的，并且在其它實施方式中不使用它們。
[0039] "可環(huán)化的"意指提供第二RCA模板的寡核苷酸以具有可連接的末端的線性分子形 式存在，所述線性分子可通過將末端直接或間接地連接在一起(即彼此連接，或連接于間插 ("間隙")寡核苷酸的各自末端或可環(huán)化的寡核苷酸的延伸的3'末端)來環(huán)化。因而可在兩 個或更多個部分即兩個或更多個分子(例如可環(huán)化的寡核苷酸和間隙寡核苷酸）中提供第 二RCA模板。
[0040] 在RCA之前通過連接將可環(huán)化的寡核苷酸環(huán)化，所述連接以可環(huán)化的寡核苷酸已 與其雜交的分子，即第一RCA產(chǎn)物或已與其雜交的中間分子為模板?？森h(huán)化的寡核苷酸將在 其各自的3'和5'末端區(qū)包含對應(yīng)于靶分子（即用作連接模板的第一 RCA產(chǎn)物或與其雜交的 中間分子）中的同源互補(bǔ)區(qū)（或結(jié)合位點）的互補(bǔ)序列，所述互補(bǔ)序列可以是相鄰的，其中末 端彼此直接連接，或非相鄰的，中間存在間插"間隙"序列，其中將發(fā)生間接連接。
[0041] 第一 RCA產(chǎn)物可以是初始（即最初的)RCA反應(yīng)的產(chǎn)物，或其可以是進(jìn)一輪或隨后的 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物。第二RCA反應(yīng)可以是第二輪或進(jìn)一輪或隨后的RCA反應(yīng)。因此應(yīng)理解，本發(fā) 明的方法可包括多個連續(xù)輪的RCA，例如2、3、4或更多輪，其中在每一輪中，使用與先前輪的 RCA的反應(yīng)產(chǎn)物直接或間接雜交的可環(huán)化的寡核苷酸(鎖式探針）。換句話說，本發(fā)明的方法 可包括重復(fù)步驟(3)、(13)、（(3)和((1)一次或多次。
[0042]本發(fā)明的特征是第一RCA產(chǎn)物在方法中保持完整，即其不被切割(例如其不被切割 成單體）。此外，步驟(a)中的第一RCA產(chǎn)物是單鏈的。更具體地在步驟(a)中，以單鏈形式提 供第一RCA產(chǎn)物。因此，根據(jù)本發(fā)明不需要和不使用"開放子"或用于打開雙鏈核酸的部分以 允許鎖式探針結(jié)合的其它分子。
[0043]由于RCA產(chǎn)物含有多個重復(fù)（或串聯(lián)）拷貝（或單體）的序列（即其為單體的多聯(lián) 體），因而可結(jié)合多個探針(可環(huán)化的寡核苷酸）。每一個單體包含至少一個可環(huán)化的寡核苷 酸的結(jié)合位點。因此，本發(fā)明的方法更具體地包括將多個探針與第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)物(直接或 間接）雜交。如本文中所用，術(shù)語"多個"或"大量"意指兩個或更多個，例如至少2個、3個、4 個、5個、6個、10個、20個、30個、50個、70個或100個或更多個。將探針與存在于第一 RCA產(chǎn)物 的每一個重復(fù)單位或單體(每一個重復(fù)單位或單體是用于產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物的環(huán)狀RCA模板 (〃第一 RCA模板〃）的互補(bǔ)拷貝）中的結(jié)合位點直接或間接雜交。因此，將看到，可環(huán)化的寡核 苷酸可包含與第一RCA模板中存在的序列相同的序列，例如結(jié)合位點或靶互補(bǔ)區(qū)。應(yīng)理解， 雖然第一 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物的每一個重復(fù)單位或單體包含可環(huán)化的寡核苷酸(鎖式探針)的結(jié) 合位點，但實際上，并非所有這些結(jié)合位點都可(或?qū)?在探針雜交后被探針占據(jù)。許多或多 個此類結(jié)合位點被探針結(jié)合就可滿足。因此，在本發(fā)明的方法中，探針可與存在于第一RCA 產(chǎn)物的單體中的探針結(jié)合位點雜交，或與與存在于第一 RCA產(chǎn)物的單體中的互補(bǔ)序列雜交 的中間核酸分子雜交。更具體地，探針與RCA產(chǎn)物的至少一個單體中的探針結(jié)合位點雜交， 或與中間核酸分子雜交，所述中間核酸分子與存在于第一RCA產(chǎn)物的至少一個單體中的，但 優(yōu)選至少2個、3個、4個、5個、6個、8個、10個、12個、15個、20個、50個、80個或100個或更多個 單體或中間分子中的互補(bǔ)序列雜交。單體可包含不止一個不同的鎖式探針(可環(huán)化的寡核 苷酸）的結(jié)合位點（同源靶互補(bǔ)區(qū)）。因此，每一個單體可包含相同或不同探針的多個結(jié)合位 點。
[0044] 探針(可環(huán)化的寡核苷酸)可與第一 RCA產(chǎn)物直接雜交，即其直接結(jié)合于存在于第 一 RCA產(chǎn)物中的與所述探針中的結(jié)合位點互補(bǔ)或"同源"的探針結(jié)合位點?；蛘?，探針可以例 如通過結(jié)合于中間核酸分子來間接雜交，所述中間核酸分子本身與第一 RCA產(chǎn)物(直接或間 接）雜交。在此類實施方式中，探針結(jié)合于存在于中間核酸分子中的互補(bǔ)（或同源)結(jié)合位 點。所述中間核酸分子可通過與存在于第一 RCA產(chǎn)物的每一個重復(fù)單位(或單體）中的互補(bǔ) (或同源)結(jié)合位點雜交而結(jié)合于第一 RCA產(chǎn)物。然而，如上文所示，情況也許是并非每一個 中間分子或并非中間分子中的每一個探針結(jié)合位點都將被探針占據(jù)。
[0045] 在本發(fā)明的方法中，引物是第二RCA反應(yīng)所需的。其可被提供來與可環(huán)化的寡核苷 酸預(yù)雜交或其可被單獨(dú)提供，例如在寡核苷酸的雜交和/或連接后?？稍诳森h(huán)化的寡核苷酸 的區(qū)域中提供第二RCA引物的結(jié)合位點，所述區(qū)域與靶互補(bǔ)區(qū)不同或與其分開。可環(huán)化的寡 核苷酸/鎖式探針可被視為具有通過間插區(qū)或結(jié)構(gòu)域(其可被視為"骨架"結(jié)構(gòu)域或區(qū))連接 的兩個靶互補(bǔ)末端區(qū)(或"臂"）?？稍诠羌軈^(qū)中提供第二RCA引物的結(jié)合位點。
[0046] 說明本發(fā)明的代表性實施方式的示意圖示于圖1中。用于第一RCA的模板通過環(huán)化 (當(dāng)其已經(jīng)與用于第一RCA的引物雜交時，通過連接)第一鎖式探針來產(chǎn)生。隨后啟動第一 RCA反應(yīng)以產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物。在第一 RCA中在利用聚合酶進(jìn)行一定時間的滾動后，用于第二 RCA的鎖式探針被連接在第一 RCA產(chǎn)物上，并且在該連接形成第二RCA模板后，環(huán)化的寡核苷 酸在第二RCA引物(所述引物與第二鎖式探針的骨架部分雜交)存在的情況下開始滾動，以 產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物。如所描述的，根據(jù)重復(fù)和鎖雜交長度的大小，可存在幾個在第一RCA產(chǎn)物 的相同單體(重復(fù)）上連接的第二鎖式探針。在第二RCA后，可通過利用用不同標(biāo)記物（可區(qū) 分的標(biāo)記物，例如不同顏色或熒光的標(biāo)記物等)標(biāo)記的一個或多個不同的檢測探針進(jìn)行標(biāo) 記來檢測第二RCA產(chǎn)物。
[0047] 本發(fā)明的方法可以是均相或非均相的。即，其可在溶液中進(jìn)行而無需固相或載體 (即無需任何反應(yīng)組分的固定)或其可以以固定的形式或基于固相的形式進(jìn)行，特別地其中 固定第一RCA產(chǎn)物。第一RCA產(chǎn)物的固定可以以各種方式來實現(xiàn)。例如在原位測定中，可在使 用靶(分析物)核酸作為第一 RCA引物引發(fā)的第一 RCA反應(yīng)中形成第一 RCA產(chǎn)物。此處，將第一 RCA產(chǎn)物附著于本身被固定于固體載體的靶組織樣品。這可以例如在使用鎖式探針檢測靶 核酸時進(jìn)行。或者，第一 RCA可通過被結(jié)合于固定的（或固置的）分析物靶的免疫RCA或接近 式探針的核酸域來引發(fā)。在其它實施方式中，用于第一RCA反應(yīng)的引物可被簡單地固定于固 體載體。非均相固定的形式的使用使得可容易地進(jìn)行洗滌，從而例如允許容易地除去未結(jié) 合的和/或未連接的探針，和/或未以物理方式附著于表面的其它未反應(yīng)的添加的反應(yīng)組 分，或假的不期望的反應(yīng)。因此可容易地連續(xù)進(jìn)行非均相或基于固相的方法。
[0048] 由于本發(fā)明需要可環(huán)化的寡核苷酸與第一 RCA產(chǎn)物的直接或間接結(jié)合和在其上的 連接來形成第二RCA模板，因而除非可環(huán)化的寡核苷酸已與第一 RCA產(chǎn)物雜交，即除非第一 RCA產(chǎn)物存在，否則第二RCA反應(yīng)不能發(fā)生。因此，第二RCA反應(yīng)取決于第一 RCA產(chǎn)物的存在。 因此，方法的特異度可得以提高。第二RCA反應(yīng)從而可被視為靶依賴性RCA反應(yīng)，其中第二 RCA反應(yīng)的靶是第一 RCA反應(yīng)產(chǎn)物。
[0049] 洗滌步驟也可用于提高特異性，例如通過在探針雜交后和/或在連接步驟后包括 一個或多個洗滌步驟。這可容易地在固相或固定的形式中通過洗掉任何未結(jié)合和/或未連 接的反應(yīng)物來實現(xiàn)。因此，在第一RCA產(chǎn)物不存在的情況下，可環(huán)化的寡核苷酸不具有"結(jié)合 靶"（即無第一 RCA產(chǎn)物或中間核酸分子），從而不因結(jié)合于其靶而被固定，并且可被洗掉。因 此，如果第一 RCA產(chǎn)物不存在，則模板不可用于第二RCA。
[0050] 因此，可進(jìn)行本方法，以使得未結(jié)合的探針（即未與第一RCA產(chǎn)物直接或間接雜交 的探針(可環(huán)化的寡核苷酸））在進(jìn)行步驟(d)的RCA反應(yīng)之前被除去。這可以例如通過以固 相形式進(jìn)行所述方法以及在探針添加和雜交的步驟后進(jìn)行洗滌來容易地實現(xiàn)?？蛇x擇地或 此外，可在連接步驟(c)后進(jìn)行洗滌，例如嚴(yán)格洗滌，以除去任何未連接的探針。
[0051] 或者，可通過酶促降解從樣品除去未結(jié)合的和/或未連接的可環(huán)化的寡核苷酸(探 針），以在連接步驟后提高特異性。這可通過優(yōu)先降解單鏈線性寡核苷酸的任何方法來實 現(xiàn)。在第一RCA產(chǎn)物不存在的情況下，可環(huán)化的寡核苷酸將不與RCA產(chǎn)物雜交（即寡核苷酸的 3 '和5 '末端將不會并置以進(jìn)行連接，從而寡核苷酸將不會被環(huán)化）。這樣未結(jié)合的（從而未 環(huán)化的)探針將被降解，因此如果第一 RCA產(chǎn)物不存在，則模板不可用于第二RCA。此外，在第 一 RCA產(chǎn)物存在的情況下，可通過除去任何剩余的未雜交的探針來降低背景。因此可作為清 除步驟來進(jìn)行未雜交的探針的酶促降解。這樣，可避免未雜交的探針的任何隨后的擴(kuò)增，包 括未連接的探針的擴(kuò)增和通過在后來可被非特異性連接的探針（即非靶連接的探針）的RCA 的擴(kuò)增。可以以這樣的方式進(jìn)行本方法:在進(jìn)行步驟(d)的RCA反應(yīng)之前除去還未與第一 RCA 產(chǎn)物雜交(從而未被環(huán)化)的未結(jié)合的探針(可環(huán)化的寡核苷酸）。這可通過在步驟(C)之后 添加優(yōu)先降解線性寡核苷酸但不降解環(huán)化的寡核苷酸分子的組分來實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方 式中，可通過具有3 '外切核酸酶活性的組分，優(yōu)選通過具有3 '外切核酸酶活性的DNA聚合酶 來進(jìn)行降解，盡管可以可選擇地或另外地使用單獨(dú)添加的外切核酸酶（例如，3'外切核酸 酶）。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述酶可以是Phi29聚合酶。這可通過在連接步驟(c)之后 并且在添加啟動第二RCA所需的引物之前添加具有3'外切核酸酶活性的組分來進(jìn)行?？蛇x 擇地或另外地，可在dNTP不存在的情況下進(jìn)行該步驟。因此可在可環(huán)化的寡核苷酸連接后 提供具有3 '外切核酸酶活性的組分。
[0052]或者，可在步驟(b)之后并且在步驟(c)之前，即在連接步驟之前添加具有外切核 酸酶活性的組分，以降解任何剩余的未雜交的探針。當(dāng)在連接步驟之前添加具有3'外切核 酸酶活性的組分時，優(yōu)選地可使用具有嚴(yán)格單鏈特異性活性的外切核酸酶。
[0053]然而不希望受理論束縛，據(jù)認(rèn)為，與除去未結(jié)合的和/或未連接的探針分子的3'外 切核酸降解步驟的使用相關(guān)的增強(qiáng)的特異性和靈敏性可通過除去未連接的探針(可環(huán)化的 寡核苷酸)來產(chǎn)生，所述探針可通過至少它們的3 '末端附著于第一 RCA產(chǎn)物，或所述探針在 樣品中可以是游離的。結(jié)合于第一 RCA產(chǎn)物的未連接的探針能夠用作用于使用第一 RCA產(chǎn)物 作為模板的延伸的引物。以這樣的方式通過樣品中的游離未連接的探針或其它DNA分子形 成的第一RCA產(chǎn)物的互補(bǔ)序列的假引發(fā)可導(dǎo)致US 6183960中提及的'超支化的' RCA擴(kuò)增法， 并且這樣產(chǎn)生的任何擴(kuò)增產(chǎn)物可通過用于檢測第二RCA產(chǎn)物的檢測探針來檢測，從而導(dǎo)致 產(chǎn)生的背景信號水平的升高。還預(yù)期，未連接的探針可與第二RCA產(chǎn)物雜交并降低檢測探針 與第二RCA產(chǎn)物的結(jié)合效率，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的信號水平降低。因此，3'外切核酸降解步驟的 使用可提高本發(fā)明的方法的信噪比。
[0054] 設(shè)想了可以以均相和非均相反應(yīng)形式進(jìn)行此類酶促降解，然而此類方法可有利地 允許未結(jié)合的（和從而未環(huán)化的）探針在以其中靶分析物不被固定的均相（即溶液相)形式 進(jìn)行步驟(d)的RCA反應(yīng)之前被除去。
[0055] 還應(yīng)理解，可期望在添加可環(huán)化的寡核苷酸以阻止未結(jié)合的可環(huán)化的寡核苷酸 (探針）的不期望的延伸（以增強(qiáng)本方法的特異性)之前滅活用于產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物的具有聚 合酶活性的組分。如果聚合物在連接步驟中具有活性，則可通過聚合酶的3'外切核酸酶活 性來降解未環(huán)化的寡核苷酸，否則在其被連接之前其可被聚合酶延伸。在某些實施方式中， 這可在添加可環(huán)化的寡核苷酸之前通過熱滅活來實現(xiàn)。
[0056] 因此在一個實施方式中，本發(fā)明的方法可如下來進(jìn)行：
[0057] i)第一鎖式探針與靶DNA的雜交和連接
[0058] ii)第一鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增
[0059] iii)聚合酶的滅活
[0060] iv)第二鎖式核酸(可環(huán)化的寡核苷酸)在第一 RCA產(chǎn)物上的雜交和連接 [0061 ] V)通過外切核酸酶除去未連接的第二鎖式探針
[0062] vi)使用與第二鎖式探針互補(bǔ)的引物的第二RCA，然而鎖仍然附著于第一 RCA產(chǎn)物 [0063]還預(yù)期的是，在另外的實施方式中，可以以這樣的方式滴定用于本發(fā)明的方法的 可環(huán)化的寡核苷酸(探針）的量，以匹配形成的第一 RCA產(chǎn)物的量。這樣，可避免過量的未結(jié) 合的探針。然而，很明顯的是，在此類實施方式中，還可期望除去過量的未結(jié)合的和/或未連 接的探針以進(jìn)一步增強(qiáng)檢測測定的靈敏性。
[0064]因此，以此類方式設(shè)計和可進(jìn)行所述方法，以使得在第一RCA產(chǎn)物不存在的情況下 第二RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生被阻止或降至最低程度。更具體地，在本發(fā)明的方法中，在第一RCA產(chǎn)物 不存在的情況下，第二RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生被阻止或降至隨機(jī)水平。
[0065]應(yīng)理解，當(dāng)設(shè)計或進(jìn)行所述方法，以使得除非第一 RCA產(chǎn)物存在，否則第二RCA反應(yīng) 不應(yīng)發(fā)生時，此類方法的本質(zhì)是非特異性反應(yīng)可發(fā)生，并且不能保證絕對阻止。因此，某些 不期望的非特異性或隨機(jī)反應(yīng)或相互作用可在樣品或反應(yīng)混合物中發(fā)生，并且這些反應(yīng)或 相互作用可導(dǎo)致例如由除探針/引物外的組分或核酸分子引發(fā)的第二RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生。這就 是隨機(jī)水平上的第二RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生的意思。
[0066] 如上文中所指出的，本發(fā)明的方法的特征是可環(huán)化的寡核苷酸(探針)不能引發(fā)使 用第一 RCA產(chǎn)物作為模板的延伸，或限制確實發(fā)生的任何所述延伸以避免與第一 RCA產(chǎn)物雜 交的任何下游探針的置換。當(dāng)然應(yīng)理解，該需要應(yīng)用于與第一 RCA產(chǎn)物雜交的任何方法組分 或反應(yīng)物。這可包括被使用的任何中間寡核苷酸分子。
[0067] 為了獲得該特征，根據(jù)方法的精確性質(zhì)，可單獨(dú)地或組合地使用各種手段和步驟。 例如，在某些實施方式中，可將修飾(例如阻斷基團(tuán)或經(jīng)修飾的殘基)摻入探針(可環(huán)化的寡 核苷酸）中，所述修飾抑制聚合酶和/或外切核酸酶作用（即，其抑制延伸和/或降解），或所 述修飾抑制鏈置換。阻斷性寡核苷酸(例如具有上述修飾)可用于防止與第一 RCA模板(或中 間分子)雜交的3'末端延伸。例如，此類阻斷性寡核苷酸可與第一 RCA模板在本發(fā)明的探針 之間雜交。為了阻止任何雜交的探針的不期望的外切核酸酶消化產(chǎn)生能夠在第一 RCA產(chǎn)物 上引發(fā)的引物/模板構(gòu)建體，在某些實施方式中，可避免任何具有核酸外切活性的試劑的存 在，例如可使用外切核酸酶缺陷性聚合酶?？墒褂孟礈觳襟E。例如，如上文中指出的，已雜交 但未連接的任何探針可通過嚴(yán)格洗滌除去(按照本領(lǐng)域中公知的原理）。這特別適用于基于 非均相或固相的方法的情況?？墒褂么祟惙椒ǖ娜魏谓M合。
[0068] 如上文中所指出的，在其它實施方式中，可使用外切核酸酶活性。與DNA聚合酶或 DNA聚合酶活性結(jié)合的具有3'外切核酸酶活性的組分的添加可阻止已被非特異性環(huán)化(連 接）（例如，在第一 RCA產(chǎn)物不存在的情況下或作為其中連接以另一個分子為模板的非特異 性背景反應(yīng))的任何可環(huán)化的寡核苷酸(探針）的RCA。在利用具有3'外切核酸酶活性的組分 的此類實施方式中，期望可環(huán)化的寡核苷酸(探針)不包含外切核酸酶阻斷區(qū)。
[0069] 可使用如上文所示的所謂的外切核酸酶阻斷區(qū)（即用于阻斷或抑制外切核酸酶活 性，特別是3'核酸外切活性的修飾）。例如，探針可在探針的3'末端與5'雜交的區(qū)之間的區(qū) 中包含此類阻斷區(qū)，例如一段抗核酸酶核苷酸。
[0070] 可選擇地或此外，可在雜交的可連接的5'末端上或其附近修飾探針以包含置換阻 斷區(qū)。在此類情況下，確實從3'末端發(fā)生的任何延伸將不置換雜交的5'末端(探針本身的或 下游雜交的探針的）。
[0071] 用于抑制或阻斷外切核酸酶和/或聚合酶作用（即用于抑制或阻斷降解和/或延 伸）以及抑制或阻斷置換的修飾或阻斷基團(tuán)在本領(lǐng)域中是公知的并且在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描 述，可使用這些修飾或阻斷基團(tuán)中的任何修飾或阻斷基團(tuán)。因此，核苷酸可被修飾來包含或 摻入可抑制酶(例如聚合酶)發(fā)揮功能(例如結(jié)合）的阻斷基團(tuán)。例如，外切核酸酶阻斷區(qū)可 包含抗核酸酶核苷酸殘基的區(qū)。這些外切核酸酶阻斷區(qū)可以例如是2'0-Me-RNA殘基、鎖核 酸(LNA)殘基、肽核酸(PNA)殘基、硫代磷酸(phospho th iate)修飾的核酸或摻入在核苷酸殘 基之間的聚乙烯-接頭骨架部分。還可包含無堿基(無嘌呤或無嘧啶，或AP)位點作為外切核 酸酶阻斷區(qū)。此外，探針或探針組分可包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為外切核酸酶阻斷區(qū)。存在幾種修飾 核酸以便它們是抗外切核酸酶的和/或不用作引物的方法，并且本發(fā)明的方法無意限制于 上文所列的實例。
[0072]類似地，延伸或聚合酶阻斷區(qū)可包括在上文被指示為外切核酸酶阻斷區(qū)的任何經(jīng) 修飾的殘基或阻斷區(qū)?？蓪⒁种凭酆厦傅慕Y(jié)合的任何基團(tuán)或修飾摻入探針的相關(guān)區(qū)。例如， 可使用任何具有嵌入功能的基團(tuán)，例如吖啶基團(tuán)。
[0073]阻斷性寡核苷酸可包含或摻入上文中提及的任何外切核酸酶或延伸/聚合酶阻斷 區(qū)?？梢种撇恍枰难由旆磻?yīng)的阻斷性寡核苷酸在文獻(xiàn)中，例如在Olasagasti等人，2010， Nature Nanotechnology，5,798-806和Senior Thesis of Rashid,at the University of California,Santa Cruz(標(biāo)題為Blocking Oligomer Design(3/10_3/ll))中進(jìn)行了描述。
[0074] 置換阻斷區(qū)在本領(lǐng)域中也是已知的，并且可使用任何報導(dǎo)過的或已知的置換阻斷 區(qū)。置換阻斷區(qū)可包含經(jīng)修飾的核苷酸殘基的任何區(qū)段或區(qū)，相較于未經(jīng)修飾的DNA和/或 RNA，所述區(qū)段或區(qū)與DNA和/或RNA形成更穩(wěn)定的雜交體。此類修飾包括LNA、PNA和2 ' -0-Me RNA殘基。因此，可使用具有足夠的長度或強(qiáng)度以避免置換的此類殘基的區(qū)段或區(qū)。還可使 用無堿基(AP)位點。還可使用如在文獻(xiàn)中報導(dǎo)的DNA夾。
[0075] 因此，在一個可能的實施方式中，本發(fā)明的方法包括可環(huán)化的寡核苷酸(探針）的 使用，所述可環(huán)化的寡核苷酸摻入了（或包含)一個或多個用于抑制降解、延伸和/或鏈置換 的經(jīng)修飾的區(qū)，和/或使用阻斷性寡核苷酸(其本身可摻入此類經(jīng)修飾的區(qū)）。
[0076] 更具體地，在該實施方式中，如上文中所示的經(jīng)修飾的區(qū)用于抑制降解、延伸和/ 或鏈置換。因此，經(jīng)修飾的區(qū)可包含或構(gòu)成外切核酸酸酶阻斷區(qū)、延伸阻斷區(qū)和/或置換阻 斷區(qū)。經(jīng)修飾的區(qū)可包含經(jīng)修飾的核苷酸和/或阻斷基團(tuán)和/或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。經(jīng)修飾的核苷酸 包括無堿基核苷酸?？梢砸源祟惙绞教砑影粋€或多個此類經(jīng)修飾的區(qū)的阻斷性寡核苷 酸以與第一 RCA產(chǎn)物雜交，以使得探針不能使用第一 RCA產(chǎn)物作為模板來進(jìn)行延伸，或限制 任何所述延伸以避免與第一 RCA產(chǎn)物雜交的任何下游探針的置換。例如，阻斷性寡核苷酸可 在多個探針之間與第一 RCA產(chǎn)物雜交，例如以便任意兩個探針之間存在至少一個阻斷性寡 核苷酸。
[0077] 在其它實施方式中，此類隔離阻斷區(qū)的使用不是必需的，并且連接的和成鏈的探 針(環(huán)化的寡核苷酸)本身可用作阻斷區(qū)來避免任何不期望的延伸或置換。
[0078] 如上文中所指出的，本發(fā)明的一個有利方面是可啟動第二RCA，同時第一RCA正在 進(jìn)行，或換句話說，一旦第一 RCA產(chǎn)物已開始形成就可啟動第二RCA。這導(dǎo)致更快的信號產(chǎn)生 的有利方面。因此，相較于其中v為聚合酶的核苷酸摻入速率，相較于單個RCA的v，信號放大 可能最佳地以v 2/2進(jìn)行，從而以多個新的RCA產(chǎn)物產(chǎn)生的速率進(jìn)行。這可加速任何RCA依賴 性方案，并且可具有用于快速檢測測定的特定值。通過進(jìn)一輪的RCA啟動關(guān)閉，信號強(qiáng)度或 速度或兩者的進(jìn)一步增加是可能，并且該增加與第二RCA反應(yīng)產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)，依此類推(例如 第3代、第4代、第5代……代的RCA)。
[0079] 因此，在一個實施方式中，本發(fā)明的方法可包括產(chǎn)生第一RCA產(chǎn)物的步驟作為步驟 (a)(或進(jìn)行第一 RCA反應(yīng)以產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物）。第一 RCA產(chǎn)物一開始形成就可進(jìn)行步驟(b)、 (c)和(d)。因此，步驟(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)可同時或基本上同時進(jìn)行。具體地，步 驟(b)可與步驟(a)同時進(jìn)行。因此，在某些實施方式中，用于第二RCA反應(yīng)的試劑，例如可將 所需的探針和任何另外的反應(yīng)物直接添加至用于第一 RCA反應(yīng)的試劑。
[0080] 在其它實施方式中，可相繼地進(jìn)行本方法的步驟。
[0081] 在另一個實施方式中，可在第一與第二RCA反應(yīng)之間進(jìn)行另外的'清除'步驟。如上 文中提及的，設(shè)想了，這可包括在開始第二RCA反應(yīng)之前添加具有3'外切核酸酶活性的組分 以除去任何未結(jié)合的和/或未環(huán)化的可環(huán)化的寡核苷酸(探針）。在此類實施方式中，預(yù)期在 添加具有3'外切核酸酶活性的組分之前或與之同時不添加啟動第RCA所需的引物。因此，在 第一 RCA步驟后，和在可環(huán)化的寡核苷酸雜交和連接后，可添加具有3 '外切核酸酶活性的聚 合酶(例如phi 29聚合酶）以允許降解未連接的可環(huán)化的寡核苷酸。在該清除步驟后，可添 加用于第二RCA反應(yīng)的引物以啟動第二RCA?？蛇x擇地或另外地，可在dNTP不存在的情況下 進(jìn)行外切核酸酶消化步驟，隨后添加 dNTP以啟動第二RCA。因此，可將用于第二RCA反應(yīng)的某 些試劑直接添加至所述試劑以進(jìn)行第一 RCA反應(yīng)，并且可隨后添加某些試劑?；蛘撸稍陔s 交步驟(b)之后但在連接步驟(c)之前進(jìn)行清除步驟。隨后可進(jìn)行連接步驟(c)。
[0082] 在另外的實施方式中，可使用單獨(dú)的外切核酸酶進(jìn)行清除步驟，可在步驟(b)之后 和/或步驟(c)之后添加所述酶。這可包括在清除步驟后，例如通過加熱滅活外切核酸酶。如 上所指出的，可在連接步驟(c)之前滅活用于第一 RCA反應(yīng)的聚合酶，并且可將此類各種步 驟與方法的不同實施方式組合使用?？梢岳缭诖祟悾ǘ鄠€)滅活步驟之后添加用于第二 RCA反應(yīng)的聚合酶，或聚合酶和引物。
[0083] 雖然適合用于進(jìn)行清除步驟(3'外切核酸降解)的條件在本領(lǐng)域中是已知的，但在 代表性實施方式中，這可使用phi29聚合酶在37°C下進(jìn)行約20分鐘。然而合適的時間可變 化，并且設(shè)想了，可進(jìn)行該步驟5至60分鐘，例如5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘 或15分鐘、或25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘或55分鐘。
[0084] 本發(fā)明的方法依賴于多個能夠與第一 RCA產(chǎn)物雜交的探針。因此，應(yīng)理解，第一 RCA 產(chǎn)物必須可用于探針雜交。該要求是所有RCA基檢測法的特征，其中RCA產(chǎn)物通過將探針例 如檢測探針與產(chǎn)物雜交來檢測，并且在本領(lǐng)域中是公知的。因此，對于第一RCA產(chǎn)物可以有 利的是具有低含量的二級結(jié)構(gòu)。然而，該特征可通過在有利于雜交條件下，按照本領(lǐng)域中公 知的原理進(jìn)行所述方法來補(bǔ)償。因此，例如，可在甲酰胺存在的情況下，例如在含有甲酰胺 的緩沖液中進(jìn)行所述方法。
[0085] 第一 RCA產(chǎn)物可從任何核酸(例如DNA或RNA)環(huán)的RCA產(chǎn)生，或?qū)嶋H上所述環(huán)可具有 任何經(jīng)修飾的核酸，只要其能夠用作RCA反應(yīng)的模板。所述環(huán)(第一 RCA模板)可以例如為報 告DNA環(huán)，即來自任何RCA基檢測測定，所述測定使用或產(chǎn)生核酸環(huán)(環(huán)狀核酸分子)作為所 述測定的報告分子。因此，第一 RCA產(chǎn)物可以是免疫RCA或其中產(chǎn)生環(huán)狀核酸分子的接近式 探針測的產(chǎn)物，例如如上文中所論述的，或其可通過環(huán)化的鎖式探針的RCA獲得。或者，用于 產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物的第一 RCA模板可以是環(huán)化的靶(分析物)核酸分子。使用環(huán)化銜接子(所 謂的"選擇子"）進(jìn)行的靶核酸分子的環(huán)化由我們在W0 99/049079、W0 2003/012119和W0 2005/070630中進(jìn)行了描述。
[0086]如上文中所指出的，鎖式探針(可環(huán)化的寡核苷酸）的靶互補(bǔ)區(qū)的長度，或更具體 地第一 RCA產(chǎn)物或中間分子上的環(huán)化的探針的雜交區(qū)域的長度對于本發(fā)明的方法的運(yùn)行是 非常重要的。探針的每一個末端上的靶互補(bǔ)區(qū)的長度為6~16個核苷酸。選擇至少6個的最 小尺寸來確保結(jié)合的特異性，并且最大尺寸不應(yīng)超過16個以允許環(huán)化的探針的高效RCA，所 述探針與其靶成鏈。優(yōu)選地尺寸范圍為6~15個、6~14個、6~13個或6~12個核苷酸，更具 體地，7~16個、7~15個、7~14個、7~13個、7~12個、8~16個、8~15個、8~14個、8~13個、 8~12個。在【具體實施方式】中，優(yōu)選小于或達(dá)到13個或12個或11個或10個的尺寸。因此在優(yōu) 選的實施方式中，尺寸范圍為6個或7個至8個、9個、10個、11個或12個，例如6~11個、6~10 個、6~9個、6~8個或7~11個、7~10個、7~9個、7~8或8~11個、8~10個、8~9個。探針的 每一個靶互補(bǔ)區(qū)的長度可以相同或不同（只要其在上述范圍內(nèi)）。例如，探針可具有6個+6 個、6個+7個、7個+7個、6個+8個、7個+8個、8個+8個、8個+9個、7個+9個、9個+9個、10個+9個、 10個+10個、10個+11個、11個+11個、11個+12個、12個+12個等，即上述范圍內(nèi)的任何整數(shù)的 任意組合的靶互補(bǔ)區(qū)。
[0087] 雜交區(qū)的總長度可以為12~32個，更具體地12~30個、12~28個、12~26個、12~ 24個、12~23個、12~22個、12~21個、12~20個、12~19個、12~18個、12~17個、12~16個、 13~30個、13~28個、13~26個、13~24個、13~23個、13~22個、13~21個、13~20個、13~ 19個、13~18個、13~17個、13~16個、14~30個、14~28個、14~26個、14~24個、12~23個、 14~22個、14~21個、14~20個、12~19個、14~18個、14~17個、14~16個、15~30個、15~ 28個、15~26個、15~24個、15~23個、15~22個、15~21個、15~20個、15~19個、15~18個、 15~17個或15~16個。
[0088] 更具體地，雜交區(qū)的總長度不超過30個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、 21個、20個、19個、18個、17個或16個核苷酸。
[0089] 如上所解釋的，雜交區(qū)在一些實施方式中不僅可由探針的靶互補(bǔ)區(qū)組成，而且還 可包括間隙寡核苷酸或其它間隙填充的序列(例如通過探針的3'末端的延伸產(chǎn)生的間隙序 列）。因此當(dāng)探針末端的連接是間接的時候，游離末端與靶雜交，游離末端之間的間隔通過 "間隙"寡核苷酸來填充，以使每一個游離末端被連接于所述間隙寡核苷酸的一個末端?；?者，游離末端之間的間隔可通過例如在聚合酶反應(yīng)中，使用連接模板作為延伸模板延伸游 離3 '末端來"充滿"。一旦游離3 '末端已延伸至與游離5 '末端相鄰，就可通過連接反應(yīng)連接 兩個末端。因此，上文中提及的總的雜交區(qū)可由探針靶互補(bǔ)區(qū)和可選地間隙填充序列組成。 [0090]因此應(yīng)理解，在其中探針末端彼此間接連接的本發(fā)明的間隙填充實施方式中，間 隙的長度可為1至20個核苷酸，例如1~19個、1~18個、1~15個、1~12個、1~10個、1~8個、 1~7個、1~6個、1~5個、1~4個或從2個、3個、4個、5個或6個至上述范圍的任何上限。
[0091]如在下面實施例中顯示的，已用具有長度為12個、10個和8個核苷酸的靶互補(bǔ)區(qū)的 鎖式探針特別地獲得了良好結(jié)果，因此，優(yōu)選的是，靶互補(bǔ)區(qū)的長度達(dá)到12個、11個、10個、9 個或8個核苷酸，或雜交區(qū)的長度達(dá)到24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個或16個 核苷酸長。
[0092]如上文中大體上論述的，本發(fā)明的方法允許第一RCA的進(jìn)一輪局部RCA擴(kuò)增，其中 第二輪或進(jìn)一輪RCA擴(kuò)增產(chǎn)物被局限于第一 RCA擴(kuò)增產(chǎn)物。這可具有許多應(yīng)用，最為明顯地 用于信號放大，并因此用于許多基于檢測RCA產(chǎn)物的檢測方法或測定。因此，在此類實施方 式中，如上所定義的本發(fā)明的方法可包括檢測所述附著的第二RCA產(chǎn)物，從而檢測所述第一 RCA產(chǎn)物的額外或附加步驟，其中檢測被局限于第一 RCA產(chǎn)物。
[0093] 或者認(rèn)為，可看到此類實施方式提供本發(fā)明的其它方面，所述方面可被定義為用 于檢測RCA反應(yīng)的第一產(chǎn)物的方法，所述方法包括進(jìn)行如本文中所定義的局部RCA反應(yīng)和檢 測如上所定義的所述第二RCA產(chǎn)物。在某些實施方式中，可允許進(jìn)行局部檢測（例如空間檢 測），例如當(dāng)?shù)谝?RCA產(chǎn)物被原位固定或固置時。
[0094] 如上文中所指出的，此類方法的優(yōu)點包括更強(qiáng)和/或更快的信號放大。所述方法從 而在檢測任何需要的測定靶或分析物中具有特別的效用，所述靶或分析物可以是本身可通 過RCA擴(kuò)增以形成第一 RCA產(chǎn)物的靶/分析物核酸分子，或可通過使用或產(chǎn)生環(huán)狀核酸分子 作為測定靶/分析物的測定報告分子或標(biāo)志物的測定檢測的靶/分析物核酸分子或任何其 它分子(參見上文）。此類環(huán)可以是用于產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物的第一 RCA模板。
[0095] 因此本發(fā)明的方法和探針可用于檢測樣品中的核酸分子。所述核酸分子可以是待 檢測的靶分析物或可指示靶分析物在樣品中的存在。例如，所述核酸分子可附著于靶，例如 直接或間接結(jié)合于靶例如蛋白質(zhì)分子的抗體:核酸綴合物的核酸域。類似地，待檢測的核酸 分子可以是從接近式探針之間的相互作用產(chǎn)生的核酸分子，其結(jié)合于靶分析物例如蛋白 質(zhì)。
[0096] 因此，可看到本發(fā)明提供用于檢測樣品中的分析物的方法，其中使用或產(chǎn)生(例如 從核酸分析物產(chǎn)生，或用作或產(chǎn)生為所述分析物的標(biāo)志物)第一環(huán)狀RCA模板，使用所述第 一 RCA模板進(jìn)行第一 RCA反應(yīng)以產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物，如本文中所述進(jìn)行局部第二RCA反應(yīng)以產(chǎn) 生被局限于所述第一 RCA產(chǎn)物的第二RCA產(chǎn)物，并檢測所述第二RCA產(chǎn)物。
[0097] 因此，可使用如本文中所描述的探針(可環(huán)化的寡核苷酸），所述探針與第一 RCA產(chǎn) 物直接或間接雜交。第一RCA產(chǎn)物可使用第一RCA模板通過第一RCA反應(yīng)來產(chǎn)生，所述第一 RCA模板本身可以是如下物質(zhì)或來源于所述物質(zhì)或從所述物質(zhì)產(chǎn)生：
[0098] (i)分析物；
[0099] (ii)直接或間接附著于分析物的核酸分子(例如探針）；或
[0100] (iii)指示樣品中的分析物，或樣品中所述分析物的替代物(即，其的標(biāo)志物）。
[0101] RCA模板，即環(huán)狀或可環(huán)化的核酸分子(例如寡核苷酸），在本領(lǐng)域中是公知的。RCA 模板通?？砂s20~1000個核苷酸，例如26~1000個、30~1000個、30~900個、60~900 個、40~800個、50~700個、60~600個、70~500個、80~400個、90~300個或100~200個核 苷酸，例如至少20個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、50個、60個、70個、80 個、90個、100個、120個、150個、200個或250個核苷酸。更具體地，在本發(fā)明的方法中，探針可 以是20~150個，例如20~120個、20~100個、25~150個、25~120個、30~150個、30~120 個、30~100個、40~150個、40~120個、40~100個核苷酸。
[0102] 第一和/或第二RCA模板可包含報告域，其為可用于檢測和/或鑒定RCA產(chǎn)物（即以 RCA模板為模板的引物延伸產(chǎn)物）的序列。這在本發(fā)明的多重實施方式(其中將不止一種不 同的第一 RCA產(chǎn)物經(jīng)歷例如其中在單個測定中檢測不止一種分析物(例如核酸分析物)的方 法）中是特別有利的。第二RCA模板（即，從鎖式探針產(chǎn)生的RCA模板）（例如對于從靶分析物 衍生的或指示靶分析物的第一 RCA產(chǎn)物是特異性的每一種探針），可包含獨(dú)特的〃標(biāo)志物〃或 標(biāo)識序列（例如條碼序列，諸如包含特定檢測探針的序列的位點，即RCA產(chǎn)物與RCA模板互 補(bǔ)，并且因此與RCA產(chǎn)物雜交的檢測探針將包含與RCA模板的部分相同的序列）以允許單獨(dú) 檢測和/或定量樣品中的每一種分析物。因此，在多重測定中，每一種探針(或第二RCA模板） 可包含不同的報告域，并且可以例如使用可與報告域的互補(bǔ)序列雜交的標(biāo)記有不同熒光基 團(tuán)的寡核苷酸來平行（即同時)檢測探針與靶分析物之間的相互作用的檢測，即每一種分析 物的檢測?；蛘?，每一種標(biāo)志物(和從而每一種分析物)可使用連續(xù)可視化反應(yīng)來檢測，其中 每一個反應(yīng)以例如剝離或漂白步驟相間隔。適合于使用本發(fā)明的方法的連續(xù)可視化反應(yīng)的 方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如.G0ranss〇:n等人，2009(Asingle molecule array for digital targeted molecular analyses .Nucleic Acids Res·2009年1月；37(1):e7)， Wahlby^A^2002(Sequential immunofluorescence staining and image analysis for detection of large numbers of antigens in individual cell nuclei.Cytometry，47( 1):32-41，2002)，所述文獻(xiàn)在此通過引用并入。在本發(fā)明的一些代 表性實施方式中，可平行檢測多種分析物。在本發(fā)明的其它代表性實施方式中，可相繼地檢 測多種分析物。
[0103] 使用不同標(biāo)記物的不同組合和/或比例的標(biāo)記的組合方法(例如比例標(biāo)記)在本領(lǐng) 域中是已知的，并且可用于增加可一次檢測的或在相同反應(yīng)中檢測的不同分子并從而不同 分析物的數(shù)目。例如，可使用利用不同彩色標(biāo)記物和/或熒光標(biāo)記物和/或不同比例的不同 彩色標(biāo)記物和/或熒光標(biāo)記物的組合。例如，此類具有彩色標(biāo)記物和/或熒光標(biāo)記物的不同 組合的"顏色"編碼可用于基于利用流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡進(jìn)行的檢測的多重測定?；蛘?，通 過使用鑭系元素同位素標(biāo)記物，可使用cyToF檢測。例如，可將7個不同的熒光基團(tuán)分成4種 不同的類型。如果僅用一種顏色標(biāo)記，則存在7種不同組合，如果用2種顏色標(biāo)記，則存在21 種不同組合，如果用3種和4種標(biāo)記，則存在35種不同組合，依此類推。
[0104] 用于第二RCA的引物包含與第二RCA模板的部分互補(bǔ)的區(qū)（在下文中進(jìn)一步定義）， 所述區(qū)在有利于引物的RCA模板依賴性延伸的測定的條件下形成充分穩(wěn)定的雙鏈體。引物 的長度通常為至少5個核苷酸，通常為至少6個、8個或10個，通常為至少15個或16個核苷酸， 并且在長度上可長至30個核苷酸或更長，其中引物的長度范圍通常為5個至50個核苷酸，例 如6個、8個或10個至50個、40個、30個或20個，通常為約10個至35個核苷酸。
[0105] 如上文中所指出的，可使用一種或多種中間分子，例如中間分子可包含多個探針 的結(jié)合位點，或中間分子可包含一個探針的結(jié)合位點，并且對于每一種探針可使用一種中 間分子(例如當(dāng)中間分子結(jié)合于存在于每一個單體中的位點時）。為簡便起見，本發(fā)明主要 是針對探針與第一RCA產(chǎn)物之間的直接相互作用來定義的，但當(dāng)在探針結(jié)合的上下文中或 針對使用第一 RCA產(chǎn)物作為模板的不需要的延伸參考該定義時，應(yīng)理解這將類似地應(yīng)用于 對中間分子的結(jié)合或在其上的延伸。此外，在檢測測定法的上下文中，探針與其相互作用的 第一RCA產(chǎn)物或中間分子可被視為針對探針的靶核酸分子，即使本方法的目的可為探針不 與其直接相互作用的核酸分子或其它分析物的檢測。
[0106] 與其靶核酸分子互補(bǔ)的區(qū)是指能夠與靶核酸分子的至少一個區(qū)形成中間分子雙 鏈體的探針的部份。遵從上述指定的大小范圍，與靶核酸分子互補(bǔ)的區(qū)將足以在其中探針 具有實用性的測定條件下形成穩(wěn)定的雙鏈體。
[0107] 〃互補(bǔ)〃核苷酸序列將在適當(dāng)?shù)碾s交條件下特異性組合以形成穩(wěn)定的雙鏈體。例 如，當(dāng)?shù)谝恍蛄械囊徊糠挚稍诜聪蚱叫械囊饬x上(其中每一個序列的3'末端結(jié)合于另一個 序列的5'末端，并且一個序列的每一個A、T(U)、G和C從而分別與另一個序列的T(U)、A、C和G 對齊)結(jié)合于第二序列的一部分時，則兩個序列是互補(bǔ)。RNA序列還可包括互補(bǔ)G = U或U = G 堿基對。因此，兩個序列在本發(fā)明下不必具有完全的同源性來"互補(bǔ)"。通常當(dāng)至少約85% (優(yōu)選地至少約90%，最優(yōu)選至少約95%)的核苷酸在確定長度的分子上共享堿基對組織 時，兩個序列充分互補(bǔ)。
[0108] 探針/可環(huán)化的寡核苷酸可由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸以及能夠參與沃 爾森-克里克(Watson-Crick)類型或類似類型的堿基對相互作用的合成核苷酸殘基。因此， 核酸域可以是DNA和/或RNA或其任何修飾，例如PNA或含有非核苷酸骨架的其它衍生物。在 一些實施方式中，探針可包含外切核酸酶阻斷區(qū)，以便其在以靶為模板的核酸延伸反應(yīng)中 不能用作引物，即不能被聚合酶識別為引物和/或不能被降解以產(chǎn)生能夠引發(fā)靶核酸分子 的延伸的核酸分子。
[0109] 如上文中所描述的，本發(fā)明的方法和探針可用于檢測任何靶分析物，其中如果靶 分析物不是核酸分子，則第一 RCA模板(或?qū)嶋H上第一 RCA產(chǎn)物)可被視為分析物的標(biāo)志物。
[0110] 〃分析物"或最終的檢測測定靶或目標(biāo)，可以是期望檢測出的任何物質(zhì)(例如分子） 或?qū)嶓w。分析物因而是本發(fā)明的檢測方法或用途的"靶"。分析物可相應(yīng)地是可能期望檢測 出的任何生物分子或化合物，例如肽或蛋白質(zhì)，或核酸分子或小分子，包括有機(jī)和無機(jī)分 子。分析物可以是細(xì)胞或微生物，包括病毒或其片段或其產(chǎn)物。分析物可以是可針對其開發(fā) 特異性結(jié)合伴侶(例如親和結(jié)合伴侶）的任何物質(zhì)或?qū)嶓w。此類特異性結(jié)合伴侶可以是核酸 探針(對于核酸分析物而言），并且可直接導(dǎo)致第一 RCA模板(例如鎖式探針）的產(chǎn)生?；蛘?， 如上文中所論述的，可將特異性結(jié)合伴侶偶聯(lián)于核酸，其可以例如在使用或生成可為第一 RCA模板的環(huán)狀核酸分子的測定中使用RCA策略來檢測。因而特定目標(biāo)分析物可包括核酸分 子諸如DNA (例如基因組DNA、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒DNA等）和RNA (例如mRNA、微小RNA、 rRNA、snRNA、病毒RNA等）以及合成和/或經(jīng)修飾的核酸分子(例如包括包含合成或經(jīng)修飾核 苷酸或由其組成的核酸域，諸如LNA、PNA、嗎啉等）、蛋白質(zhì)性質(zhì)分子諸如肽、多肽、蛋白質(zhì)或 朊病毒或包含蛋白質(zhì)或多肽組分等或其片段的任何分子。分析物可為單個分子或含有兩個 或更多個分子亞單位的復(fù)合物，例如包括但不限于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，其可以或不可以彼 此共價結(jié)合，并且可以相同或不同。因此除了細(xì)胞或微生物以外，此類復(fù)合物分析物也可為 蛋白質(zhì)復(fù)合物或蛋白質(zhì)相互作用。此類復(fù)合物或相互作用從而可為同多聚體或異多聚體。 分子(例如蛋白質(zhì)）的聚集體也可為靶分析物，例如相同蛋白質(zhì)或不同蛋白質(zhì)的聚集體。分 析物還可為蛋白質(zhì)或肽與核酸分子(例如DNA或RNA)之間的復(fù)合物，例如蛋白質(zhì)與核酸之 間，例如調(diào)控因子(諸如轉(zhuǎn)錄因子）與DNA或RNA的相互作用。有利地，當(dāng)分析物為核酸分子 時，可原位檢測核酸，即無需從細(xì)胞取出或提取核酸。然而，分離和擴(kuò)增的核酸分子也代表 適當(dāng)?shù)陌蟹治鑫铩?br>[0111] 包括所有生物和臨床樣品，例如生物體的任何細(xì)胞或組織樣品，或來源于其的任 何體液或制劑，以及樣品諸如細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞制劑、細(xì)胞裂解物等。還包括環(huán)境樣品，例如 土壤和水樣品或食物樣品。樣品可以是新鮮制備的或它們可以以任何便利的方式進(jìn)行預(yù)處 理例如以便貯存。
[0112] 代表性樣品從而包括可含有生物分子或任何其它需要的分析物或靶分析物的任 何材料，包括例如食物和關(guān)聯(lián)產(chǎn)品、臨床和環(huán)境樣品。所述樣品可以是生物樣品，其可含有 任何病毒或細(xì)胞材料，包括所有原核或真核細(xì)胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質(zhì)體和細(xì)胞 器。此類生物材料從而可包含所有類型的哺乳動物和非哺乳動物的細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類 (包括藍(lán)綠藻）、真菌、細(xì)菌、原生動物等。代表性樣品從而包括全血和血衍生產(chǎn)品諸如血漿、 血清和血沉棕黃層、血細(xì)胞、尿、糞便、腦脊液或任何其它體液(例如呼吸道分泌物、唾液、奶 等）、組織、活檢組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞懸液、條件培養(yǎng)基或具有細(xì)胞培養(yǎng)成分的其它樣品 等?？梢砸匀魏伪憷幕蛐枰姆绞?例如通過細(xì)胞裂解或分析物的純化、分離等)預(yù)處理 樣品，以準(zhǔn)備用于本發(fā)明的方法和用途。
[0113] 靶分析物的檢測取決于分析物在樣品中的存在，所述分析物導(dǎo)致第一 RCA產(chǎn)物的 產(chǎn)生。隨后按照本發(fā)明產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物，可檢測所述第二RCA產(chǎn)物以檢測分析物。如上文中 所論述的，第二RCA產(chǎn)物可導(dǎo)致強(qiáng)得多的和/或更快的信號。在一些實施方式中，第一和第二 RCA產(chǎn)物可有利地例如使用針對每一種所述產(chǎn)物的單獨(dú)的經(jīng)標(biāo)記的檢測探針來檢測。從而 檢測具有更強(qiáng)的信號的第二產(chǎn)物可使得能夠例如在低放大倍數(shù)下進(jìn)行檢測。在更高的放大 倍數(shù)下的更精確定位可進(jìn)一步通過檢測第一產(chǎn)物來獲得。
[0114] 因此，在添加適當(dāng)?shù)木酆厦负瓦B接酶時，可通過第二RCA模板的滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)，即 通過檢測第二RCA產(chǎn)物和可選地第一 RCA產(chǎn)物來檢測分析物在樣品中的存在。多聯(lián)體RCA產(chǎn) 物提供用于檢測分析物的"信號"。所述信號可通過本領(lǐng)域已知的(關(guān)于其它實例參見下文） 和如US 7，320,860中教導(dǎo)的任何適當(dāng)方法，例如通過將經(jīng)標(biāo)記的探針與報告域序列雜交來 檢測，所述報告域序列在整個多聯(lián)體RCA產(chǎn)物中重復(fù)。
[0115] 當(dāng)形成第二RCA模板的探針的連接利用間隙寡核苷酸時，這可單獨(dú)提供。因此，在 本發(fā)明的方法中，可將間隙寡核苷酸在探針之前、之后或與之同時添加至樣品。在一些實施 方式中，可添加幾種不同的間隙寡核苷酸，其中以不同的濃度添加每一種類型的間隙寡核 苷酸。每一種類型的間隙寡核苷酸可在5'和3'末端包含與連接模板域(在可環(huán)化的寡核苷 酸的末端之間)互補(bǔ)的共同序列和不同的間插序列，其可用作如上定義的報告分子。所得的 RCA產(chǎn)物可包含不同的報告域序列，這取決于哪個間隙寡核苷酸被連接至RCA模板中并且可 被單獨(dú)地檢測到。這可用于擴(kuò)大本文中描述的測定方法的動態(tài)范圍，如W02012/049316中描 述的。
[0116] 術(shù)語"檢測"在本文中被廣泛地用于包括確定分析物或分析物的任何測量形式的 存在（即，其存在還是不存在）的任何方法。因此"檢測"可包括以任何方式確定、測量、評估 或測定分析物的存在或不存在或量或定位。包括定量和定性測定、測量或評估，包括半定 量。此類測定、測量或評估可以是相對的，例如當(dāng)將檢測樣品中的兩種或更多種不同分析物 時，或可以是絕對的。因此，當(dāng)在定量樣品中的（多種)靶分析物的上下文中使用時，術(shù)語"定 量〃可指絕對或相對定量。絕對定量可通過包括已知濃度的一種或多種對照分析物和/或?qū)?檢測水平的靶分析物與已知對照分析物相對照（例如通過產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線）來實現(xiàn)?；蛘?，相 對定量可通過比較兩種或更多種不同靶分析物之間的檢測水平或量（以提供所述兩種或更 多種不同分析物的每一種的相對量，即彼此相對地)來實現(xiàn)。
[0117] 可針對探針和其靶核酸分子的序列來選擇或挑選探針的序列。因此，雖然針對它 們結(jié)合的靶分子選擇靶互補(bǔ)區(qū)，但其余的探針的序列不是至關(guān)重要的，但當(dāng)然必須包括第 二RCA引物的結(jié)合位點。然而，應(yīng)選擇序列以避免發(fā)生分子內(nèi)雜交。一旦序列被選擇或鑒定， 就可使用任何便利的方法來合成探針。
[0118] 如本文中所用，術(shù)語〃雜交〃或〃使雜交〃是指充分互補(bǔ)以通過沃爾森-克里克堿基 配對形成雙鏈體的核苷酸序列之間的雙鏈體的形成。當(dāng)兩個核苷酸序列共享堿基對組織同 源性時，這些分子是彼此〃互補(bǔ)的〃。因此，探針的域中的互補(bǔ)性區(qū)是指該域的能夠形成分子 內(nèi)或分子間雙鏈體(即相同分子內(nèi)的雙鏈體(發(fā)夾結(jié)構(gòu))或與探針構(gòu)建體的不同分子或不同 鏈的雙鏈體）的部分。這些術(shù)語還用于指與沃爾森-克里克堿基配對類似的堿基對相互作 用，包括Hoogsteen堿基配對(其為還允許第三鏈纏繞以沃爾森-克里克模式裝配的雙螺旋 以形成三鏈體的堿基配對的罕見變型）。
[0119] 可選擇被添加至樣品的探針的量以在反應(yīng)混合物中提供充分低的濃度的探針，以 使非靶特異性相互作用最小化，即以確保探針不隨機(jī)結(jié)合于樣品中的非靶分子達(dá)到任何大 的或顯著的程度。例如，期望只有當(dāng)探針結(jié)合其靶核酸分子（即僅在第一RCA產(chǎn)物存在的情 況下)時，第二RCA模板才產(chǎn)生，從而允許產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物。在代表性實施方式中，在與含有 第一 RCA產(chǎn)物的樣品組合后，反應(yīng)混合物中的每一種探針的濃度范圍為約lfM至ΙμΜ，例如約 ΙρΜ 至約 InM，包括約 ΙρΜ 至約 ΙΟΟηΜ，例如 1ηΜ、2ηΜ、5ηΜ、10ηΜ、20ηΜ、50ηΜ。
[0120] 可將許多不同的探針添加至樣品以進(jìn)行多重測定(例如其中已產(chǎn)生或添加多種不 同的第一RCA產(chǎn)物或第一RCA模板的情況下），以平行檢測多種分析物。多重測定可包括檢測 樣品中的數(shù)十、數(shù)百、數(shù)千或甚至數(shù)萬種分析物。因此，多重測定可包含至少2種不同的探 針，即能夠與不同的第一RCA產(chǎn)物(直接或間接)雜交，從而例如檢測不同分析物的探針。例 如，多重測定可利用至少3種、4種、5種、10種、20種、30種、40種或50種探針，諸如100種、200 種、500種、1000種、10000種或更多種探針。
[0121] 在含有第一 RCA產(chǎn)物的樣品（或反應(yīng)混合物)和（多個)探針組合后，可將反應(yīng)混合 物孵育足以使(多個)探針結(jié)合于樣品中的其靶(第一 RCA產(chǎn)物或中間分子）（如果存在的話） 的一段時間。如上文中所描述的，一旦探針已（直接或間接)結(jié)合于第一RCA產(chǎn)物，探針就被 連接以產(chǎn)生第二RCA模板，并且在一些實施方式中，隨后添加第二RCA引物并使其與第二RCA 模板相互作用以形成用于第二RCA的引物/RCA模板復(fù)合物。一旦引物/RCA模板復(fù)合物已形 成，就使用第二RCA模板作為用于聚合的模板來延伸引物。在一些代表性實施方式，例如原 位測定或其中將第一RCA產(chǎn)物固定的其它測定中，可在探針的添加與RCA產(chǎn)物的檢測之間包 括洗滌步驟，例如可將第一 RCA產(chǎn)物捕獲或固定在固體載體或底物上，可洗滌所述產(chǎn)物以除 去未附著于第一 RCA產(chǎn)物的未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的探針或RCA產(chǎn)物。在一些實施方式 中，可在連接探針與第二RCA產(chǎn)物的檢測之間包括洗滌步驟，以除去未連接的探針。在其它 代表性實施方式中，可在RCA產(chǎn)物檢測之前包括清除步驟。例如，可在連接探針與添加用于 第二RCA反應(yīng)的引物之間將具有3'外切核酸酶活性的組分添加至樣品，以除去（消化或降 解)未被環(huán)化的可環(huán)化的寡核苷酸(未連接的探針）。
[0122] 在代表性實施方式中，可在添加另外的探針之前，預(yù)孵育探針和樣品，持續(xù)范圍在 5分鐘至約24小時內(nèi)的一段時間。優(yōu)選地，所述預(yù)孵育為在范圍為4°C至約50°C (例如10°C~ 40 °C或20°C~37°C)的溫度下進(jìn)行約20分鐘至12小時。應(yīng)優(yōu)化在其下維持反應(yīng)混合物的條 件以促進(jìn)探針對其靶核酸分子的特異性結(jié)合，同時抑制非特異性相互作用。
[0123] 在樣品與探針組合后，可添加（多種）間隙寡核苷酸（如果使用的話），隨后使其雜 交。可選擇地或此外，可將一種或多種間隙寡核苷酸與探針一起添加。
[0124] -般地，能夠檢測RCA產(chǎn)物的存在的任何便利方案可用于檢測第二RCA產(chǎn)物和可選 地第一 RCA產(chǎn)物。檢測方案可以需要或可以不需要分離步驟。
[0125] 如本領(lǐng)域中已知的，在模板指導(dǎo)的連接中，當(dāng)兩個緊密相鄰的核酸與與它們互補(bǔ) 的第三核酸序列（即連接模板)退火或雜交時，連接酶催化它們的并置的3'-羥基與5'-磷酸 末端之間的磷酸二酯鍵的形成?？墒褂萌魏魏线m的連接酶，其中代表性的感興趣的連接酶 包括，但不限于:溫度敏感連接酶和熱穩(wěn)定連接酶。溫度敏感連接酶包括，但不限于，噬菌體 T4 DNA連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌(E. col i)連接酶。熱穩(wěn)定連接酶包括，但不限 于，Taq連接酶、Tth連接酶、Ampligase_?和卩作連接酶。熱穩(wěn)定連接酶可獲自嗜熱或極端嗜 熱生物，包括但不限于，原核生物體、真核生物體或古細(xì)菌(archae 1)生物體。某些RNA連接 酶也可用于本發(fā)明的方法。
[0126] 可將合適的連接酶和必需的和/或需要的任何試劑與反應(yīng)混合物組合，并將其在 足以使雜交的寡核苷酸的連接發(fā)生的條件下維持。連接反應(yīng)條件對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 來說是公知的。在連接過程中，在某些實施方式中，可將反應(yīng)混合物在范圍為約4°C至約105 。(：、約4°C至約80 °C諸如約10°C至約70°C、約15°C至約60°C，通常地諸如約20°C至約37°C的 溫度下維持范圍為約5秒至約16小時，諸如約1分鐘至約1小時的一段時間。在其它實施方式 中，將反應(yīng)混合物在范圍為約35°C至約45°C諸如約37°C至約42°C的溫度下，例如在或約38 °C、39 °C、40 °C或41°C的溫度下維持范圍為約5秒至約16小時，諸如約1分鐘至約1小時，包括 約2分鐘至約8小時的一段時間。在代表性實施方式中，連接反應(yīng)混合物包含50mM Tris pH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、lmM ATP、25mg/ml BSA、0.25個單位/ml RNA酶抑制劑和 0.125個單位/ml的T4 DNA連接酶。在另一個代表性實施方式中，使用2.125mM鎂離子、0.2個 單位/ml RNA酶抑制劑和0.125個單位/ml DNA連接酶。
[0127] 將明顯的是，連接條件可取決于用于本發(fā)明的方法的連接酶。因此，上述連接條件 僅僅是代表性實例并且參數(shù)可按照公知的方案來改變。例如，可在高于50°C的溫度下使用 可用于本發(fā)明的方法的連接酶即Ainpligase?..然而，還應(yīng)理解，一個參數(shù)(例如溫度）的改 變可能需要其它條件的改變來確保測定的其它步驟(例如探針與靶核酸分子的結(jié)合)不被 抑制或破壞。RCA測定法的這種操作在本領(lǐng)域中是常規(guī)的。
[0128] 連接步驟后的方法的下一個步驟是產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物，即在聚合反應(yīng)中使用第二 RCA模板延伸第二RCA引物。滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)在本領(lǐng)域中是公知的，在Dean等人，2001 (Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification,Genome Research，11，第1095-1099 頁）（其公開內(nèi)容通過引用并入本文）中進(jìn)行了描述。將RCA引物用于引物延伸反應(yīng)中，即在 第二RCA模板上延伸RCA引物以產(chǎn)生第二RCA產(chǎn)物，其為單多聯(lián)體產(chǎn)物。RCA引物將具有足夠 的長度(如上文中所描述的），以提供在退火條件(在下文中更詳細(xì)描述的）下與RCA模板的 雜交。
[0129] 除了上述核酸組分以外，主題方法中產(chǎn)生的反應(yīng)混合物通常包含聚合酶，例如 phi29DNA聚合酶和如下文中所述的進(jìn)行DNA聚合酶反應(yīng)所需的其它組分。所需聚合酶活性 通?？捎梢环N或多種不同的聚合酶提供。在一些實施方式中，所述聚合酶具有外切核酸酶 活性，例如5 '和/或3 '外切核酸酶活性。
[0130] 在制備主題方法的該步驟的反應(yīng)混合物中，可以以任何便利的順序組合各種組成 成分。例如，可同時組合所有各種組成成分以產(chǎn)生反應(yīng)混合物。
[0131] 可使用任何便利的方案檢測RCA反應(yīng)（即第二RCA反應(yīng)，還有可選地第一 RCA產(chǎn)物） 的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所使用的特定方案可非特異性或特異性地檢測RCA產(chǎn)物，如在下文中更詳 細(xì)地描述的。例如，可直接檢測第二RCA產(chǎn)物，例如可將多聯(lián)體切割以產(chǎn)生單體，所述單體可 使用凝膠電泳，或更優(yōu)選地通過與經(jīng)標(biāo)記的檢測寡核苷酸(其與RCA產(chǎn)物中的報告域雜交） 雜交來檢測?；蛘撸砷g接檢測RCA產(chǎn)物，例如可通過PCR擴(kuò)增所述產(chǎn)物，隨后可檢測所述擴(kuò) 增產(chǎn)物。
[0132] 代表性的感興趣的非特異性檢測方案包括使用信號產(chǎn)生系統(tǒng)的方案，所述信號產(chǎn) 生系統(tǒng)例如通過嵌入來選擇性檢測單鏈DNA產(chǎn)物或雙鏈DNA產(chǎn)物。用于此類實施方式的代表 性可檢測分子包括熒光核酸染色(stain)，諸如菲啶鑰染料，包括其單體或同二聚體或異二 聚體，當(dāng)與核酸復(fù)合時其產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光。菲啶鑰染料的實例包括乙錠同二聚體、溴化乙 錠、碘化丙啶和其它烷基取代的菲啶鑰染料。在本發(fā)明的另一個實施方式中，核酸染色是吖 啶類染料，或其同二聚體或異二聚體，諸如吖啶橙、吖啶同二聚體、乙錠-叮啶異二聚體或9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶或摻入所述染料。在本發(fā)明的另一個實施方式中，核酸染色是吲 哚或咪唑染料，諸如Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580(BI0PR0BES 34， Molecular Probes，Inc .Eugene，0reg.，（2000年5月））、DAPI (4,，6-二脒基-2_苯基吲噪）或 DIPI(4'，6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚）。其它允許的核酸染色包括，但不限于，7-氨基 放線菌素 D、羥芪巴脒、LDS 751、選定的補(bǔ)骨脂素(呋喃香豆素）、苯乙烯基染料、金屬復(fù)合物 諸如釕復(fù)合物和過渡金屬復(fù)合物(例如，摻入Tb3+和Eu 3+)。在本發(fā)明的某些實施方式中，所 述核酸染色是當(dāng)與核酸結(jié)合時產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光的花青染料或花青染料的同二聚體或異二 聚體?？墒褂迷趯儆贚ee(1989)的美國第4,883,867號、屬于Yue等人（1996)的美國專利第5， 582,977號、屬于￥此等人（1994)的美國專利第5,321，130號以及屬于￥116等人（1995)的美國 專利第5，410，030號（所有4個專利通過引用并入）中描述的任何染料，包括可在商標(biāo)Τ0Τ0、 Β0Β0、Ρ0Ρ0、YOYO、T0-PR0、B0-PR0、P0-PR0和Y0-PR0下從Molecular Probes，Inc.，Eugene, Oreg商購獲得的核酸染色?？墒褂迷趯儆贖augland等人（1995)的美國專利第5,436,134號、 屬于Yue等人（1997)的美國專利第5,658,751號和屬于Haugland等人（1999)的美國專利第 5,863,753號（所有3個專利通過引用并入）中描述的任何染料，包括可在商標(biāo)3￥81?6代611、 EvaGreen、SYT0、SYT0X、PIC0GREEN、0LIGREEr^PRIB0GREErffWMolecularProbes，Inc·, Eugene,Oreg商購獲得的核酸染色。在本發(fā)明的其它實施方式中，所述核酸染色是摻入氮 雜-或聚氮雜苯并唑類(polyazabenzazolium)雜環(huán)(例如氮雜苯并嚼挫、氮雜苯并咪唑或氮 雜苯并噻唑）的單體、同二聚體或異二聚體花青染料，當(dāng)與核酸結(jié)合時其產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光， 包括可在商標(biāo)SYT0、SYT0X、J0J0、J0-PR0、L0L0、L0-PR0下從Mo 1 ecular Probes，Inc ·， Eugene，Oreg商購獲得的核酸染色。
[0133] 在其它實施方式中，與對于一般的核酸分子相反，對于RCA產(chǎn)物是特異性的信號產(chǎn) 生系統(tǒng)可被用于檢測擴(kuò)增。在這些實施方式中，信號產(chǎn)生系統(tǒng)可包括特異性結(jié)合于在RCA產(chǎn) 物中發(fā)現(xiàn)的序列（即報告域序列）的探針核酸或寡核苷酸，其中可用可直接或間接檢測的標(biāo) 記物來標(biāo)記探針核酸/寡核苷酸?？芍苯訖z測的標(biāo)記物是可直接檢測而無需使用額外試劑 的標(biāo)記物，而可間接檢測的標(biāo)記物是可通過使用一種或多種額外的試劑來檢測的標(biāo)記物， 例如當(dāng)標(biāo)記物是由兩種或更多種組分組成的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員時。在許多實施方式中， 所述標(biāo)記物是可直接檢測的標(biāo)記物，其中可直接檢測的感興趣的標(biāo)記物包括，但不限于：熒 光標(biāo)記物、放射性同位素標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物等。在許多實施方式中，所述標(biāo)記物是熒 光標(biāo)記物，其中在此類實施方式中使用的標(biāo)記試劑為焚光標(biāo)記的（多種)核苷酸，例如焚光 標(biāo)記的CTP(諸如Cy3-CTP、Cy5-CTP)等?？捎糜跇?biāo)記核苷酸以產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的探針核酸（即檢 測探針）的熒光部分包括，但不限于：熒光素、花青染料諸如Cy3、Cy5、Alexa 555、Bodipy 630/650等。還可使用其它標(biāo)記物，諸如上述那些標(biāo)記物，這在本領(lǐng)域中是已知的。
[0134] 在某些實施方式中，用"能量轉(zhuǎn)移"標(biāo)記物標(biāo)記特殊標(biāo)記的探針核酸(檢測探針）。 如本文中所用，"能量轉(zhuǎn)移"是指通過利用熒光修飾基團(tuán)改變熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射的方法。 能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記在本領(lǐng)域中是公知的，此類經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針包括TaqMan?型探針，如 美國專利第6,248,526號（其公開內(nèi)容通過引用并入本文）（以及Held等人，Genome Res. (1996)6:986-994 ;Holland等人，Proc ·Natl Acad · Sci ·USA( 1991 )88:7276-7280;和Lee等 人，Nuc.Acids Res. (1993)21:3761-3766)中描述的。檢測探針的其它實例包括:蝎型探針 (如在Whitcombe等人，Nature Biotechnology(1999)17:804_807;美國專利第6,326,145號 (其公開內(nèi)容通過引用并入本文）中描述的）、日出探針（Sunrise probes)(如Nazarenko等 人，Nuc.Acids Res. (1997)25:2516-2521;美國專利第6,117,635號（其公開內(nèi)容通過引用 并入本文）中描述的）、分子信標(biāo)(Tyagi 等人，Nature Bio techno logy (1996) 14:303-308;美 國專利第5,989,823號，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)和構(gòu)象輔助探針(如在臨時申請系 列第60/138,376號(其公開內(nèi)容通過引用并入本文）中描述的）。
[0135] 因此，確定第二和可選地第一 RCA產(chǎn)物的存在可使用任何方便的方案來實現(xiàn)?？珊Y 選(即，測定、評估、評價、測試等)反應(yīng)混合物的任何所得的第二和可選地第一RCA產(chǎn)物的存 在，以檢測靶分析物在待測定的樣品中的存在。根據(jù)所需靈敏度和其中正在實踐所述方法 的應(yīng)用，具體檢測方案可變化。
[0136] 可以以許多不同的方式檢測RCA產(chǎn)物。例如，摻入RCA產(chǎn)物的核苷酸可被直接標(biāo)記， 例如被熒光標(biāo)記地或另外地被可通過分光光度計檢測的方式標(biāo)記或被放射性同位素標(biāo)記， 或用任何發(fā)信號的標(biāo)記物標(biāo)記，以便RCA產(chǎn)物被直接標(biāo)記。在一些實施方式中，如上文中論 述的檢測探針，例如熒光標(biāo)記的探針、分子信標(biāo)(如上文中所述的)等可被用于檢測RCA產(chǎn)物 的存在，其中這些探針針對在RCA多聯(lián)體中重復(fù)并且從而只以其整體存在于RCA產(chǎn)物中的序 列(報告域序列，即與RCA模板中的報告域序列相同的序列）。
[0137] 在主題方法的該檢測步驟中制備的反應(yīng)混合物還可包含含水緩沖介質(zhì)，所述緩沖 介質(zhì)包含單價離子源、二價陽離子源和緩沖劑。可使用任何便利的單價離子源，諸如KC1、醋 酸鉀、醋酸銨、谷氨酸鉀、NH 4C1、硫酸銨等。二價陽離子可為鎂、錳、鋅等，其中所述陽離子通 常為鎂。可使用任何便利的鎂陽離子源，包括M g C12、醋酸鎂等。存在于緩沖液中的M g2+的量 可在0.5mM至10mM的范圍內(nèi)，但根據(jù)反應(yīng)的類型，可使用更高或更低的量。例如，對于PCR，存 在于緩沖液中的Mg 2+的量可為約1.5mM，然而對于RCA，存在于緩沖液中的Mg2+的量可為約 10mM。可存在于緩沖液中的代表性緩沖劑或鹽包括Tris、Tricine、HEPES、MOPS等，其中緩沖 劑的量通常在約5mM至150mM，通常約10mM至100mM，和更常見地約20mM至50mM的范圍內(nèi)，其 中在某些優(yōu)選實施方式中，緩沖劑以足以提供范圍為約6.0至9.5的pH(其中最優(yōu)選為72°C， pH 7.3)的量存在?？纱嬖谟诰彌_介質(zhì)中的其它試劑包括螯合劑，例如EDTA、EGTA等。
[0138] 主題方法中的下一步驟是從經(jīng)標(biāo)記的感興趣的RCA產(chǎn)物檢測信號，其中信號檢測 可根據(jù)所使用的具體信號產(chǎn)生系統(tǒng)而變化。在某些實施方式中，在主題測定中僅測定和使 用可檢測信號（例如熒光）的存在或不存在，例如以測定或鑒定第二(和可選地第一)RCA產(chǎn) 物(并從而靶分析物）的存在或不存在。根據(jù)所使用的具體標(biāo)記物，信號的檢測可指示第二 (或第一)RCA產(chǎn)物的存在或不存在。
[0139] 在其中信號產(chǎn)生系統(tǒng)是熒光信號產(chǎn)生系統(tǒng)的實施方式中，信號檢測通常包括檢測 來自反應(yīng)混合物的熒光信號的變化以獲得測定結(jié)果。換句話說，評估由反應(yīng)混合物產(chǎn)生的 熒光信號的任何調(diào)節(jié)。所述變化可以是熒光的增強(qiáng)或減弱(這取決于所使用的標(biāo)記物的性 質(zhì)），但在某些實施方式中，為熒光的增強(qiáng)?？墒褂萌魏伪憷难b置例如合適的熒光計(諸如 熱穩(wěn)定性比色杯或板讀數(shù)熒光計)來篩選樣品的熒光的增強(qiáng)，或例如當(dāng)樣品為在顯微鏡載 玻片上的組織樣品時，可使用熒光顯微鏡來檢測熒光。使用已知的熒光計適當(dāng)?shù)乇O(jiān)控?zé)晒狻?將來自這些設(shè)備的信號（例如以光電倍增電壓的形式存在的）傳送至數(shù)據(jù)處理器板并被轉(zhuǎn) 化成與每一個樣品管相關(guān)的光譜。可同時評估多個管，例如96個管。因此，在一些實施方式 中，可平行檢測多種分析物，然而在其它實施方式中，可相繼地(例如一次一種分析物，或一 次一組分析物)檢測多種分析物。
[0140] 當(dāng)檢測方案是實時方案（例如，如在實時PCR反應(yīng)方案中使用的）時，可以以此方 式:在整個反應(yīng)過程中以頻繁的時間間隔，例如每3分鐘一次收集數(shù)據(jù)。通過監(jiān)控每一個循 環(huán)過程中來自樣品的反應(yīng)性分子的熒光，可以以各種方式監(jiān)控擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)展。例如，可以 例如通過計算熔融峰下的面積來分析由熔融峰提供的數(shù)據(jù)，并將這些數(shù)據(jù)針對循環(huán)數(shù)作 圖。
[0141] 可以例如使用預(yù)選的熒光部分(例如染料)的"擬合"來解析以該方式產(chǎn)生的光譜， 以形成代表每一種發(fā)信號部分（即熒光基團(tuán)）的峰?？蓽y定代表每一個信號的強(qiáng)度值的峰下 的面積，并且如果需要的話，表達(dá)為彼此的商。信號強(qiáng)度和/或比率的差異將允許在整個反 應(yīng)過程中或在不同的反應(yīng)條件(例如溫度)下記錄經(jīng)標(biāo)記的探針的變化。所述變化與寡核苷 酸探針與靶序列之間的結(jié)合現(xiàn)象或結(jié)合于靶序列的寡核苷酸探針的降解相關(guān)。差異峰下的 面積的積分將使標(biāo)記作用的強(qiáng)度值能夠被計算。
[0142] 根據(jù)樣品是在引物延伸反應(yīng)結(jié)束時被篩選一次還是例如在每一輪擴(kuò)增反應(yīng)后被 篩選多次(例如如在實時PCR監(jiān)控中所進(jìn)行的一樣），篩選混合物的熒光的變化提供了一種 或多種測定結(jié)果。
[0143] 可以以各種方式解釋如上文中所述產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。在其最簡單形式中，在擴(kuò)增反應(yīng) 的過程中或結(jié)束時來自樣品的熒光的增強(qiáng)或減弱表示存在于樣品中的靶分析物的量的增 加，例如由于與在反應(yīng)混合物中檢測到的RCA產(chǎn)物的量相關(guān)，從而表明此類事實，即擴(kuò)增反 應(yīng)已進(jìn)行，并從而靶分析物實際上存在于初始樣品中。定量也可能是通過在整個擴(kuò)增過程 中監(jiān)控擴(kuò)增反應(yīng)。定量還可包括測定反應(yīng)混合物中的一種或多種核酸對照，如上文中所述 的。
[0144] 這樣，可容易地篩選(或評估或測定等)反應(yīng)混合物的RCA產(chǎn)物，并從而(多種)靶分 析物(例如核酸分析物）的存在。所述方法適合用于檢測單種靶分析物以及多重分析(其中 測定樣品中的兩種或更多種不同的靶分析物）。在后面的這些多重情況下，可使用的探針的 不同組的數(shù)目通常在約2至約20或更高，例如多至100或更高，1000或更高等的范圍內(nèi)，其中 可平行或相繼地檢測樣品中的多種分析物。
[0145]使用幾種不同探針（多路技術(shù)(multiplexing))在單個反應(yīng)中同時進(jìn)行的許多分 析物的分析可因提高的靈敏度而得以增強(qiáng)，并且在某些實施方式中，也因提高的特異度而 增強(qiáng)，這可使用本發(fā)明的方法和探針來獲得。每一個探針組可被設(shè)計來產(chǎn)生可用于確定最 終被探針詢查的分析物的存在或不存在、量和/或RCA產(chǎn)物的定位?？墒褂靡阎獊碜晕墨I(xiàn)的 用于分析核酸分子的任何已良好建立的方法(包括液相色譜、電泳、質(zhì)譜、顯微鏡、實時PCR、 熒光探針、微陣列、比色分析諸如ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜(CyTOF)等)來檢測RCA產(chǎn)物。
[0146] 本發(fā)明的探針和方法可如上文中所述在均相中（即溶液中）使用，或可選擇地通過 使用固相來在非均相中使用，例如其中第一 RCA產(chǎn)物被固定在固相上，從而允許使用洗滌步 驟。這可由靶分析物的固定所致，例如在原位檢測過程中。固相測定的使用提供了有利方 面，特別是對于困難樣品的檢測:洗滌步驟可幫助除去未結(jié)合的和/或未連接的探針等抑制 組分，以及可從不期望地大的樣品體積富集分析物?？墒褂酶叩臐舛群透罅康奶结?，因 為未結(jié)合的分析物、探針和RCA產(chǎn)物可通過洗滌除去。
[0147] 可以以各種方式實現(xiàn)第一 RCA產(chǎn)物和/或分析物在固相上的固定。因此，設(shè)想了幾 個固相測定的實施方式。在一個此類實施方式中，分析物首先可被固定的（或可固定的）捕 捉探針捕獲，可產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物以使其附著于所述分析物，例如通過用于第一 RCA產(chǎn)物的 引物附著于分析物(例如通過偶聯(lián)于分析物的結(jié)合伴侶），然后第一 RCA產(chǎn)物可被隨后添加 的產(chǎn)生用于第二RCA的模板的（多個)探針結(jié)合?；蛘?，可簡單地將第一 RCA產(chǎn)物固定于固體 載體。例如，可為第一 RCA產(chǎn)物的引物提供可固定基團(tuán)或部分或裝置以便固定，或可在第一 RCA之前固定所述引物。
[0148] 可以以任何便利的方式將固定的捕捉探針或第一RCA引物或第一RCA產(chǎn)物固定，BP 結(jié)合于載體。因此可根據(jù)選擇從許多固定裝置和固體載體(如在本領(lǐng)域中眾所周知的和文 獻(xiàn)中描述的）挑選固定的方式或裝置以及固體載體。因此，捕捉探針或第一 RCA引物或第一 RCA產(chǎn)物可被直接結(jié)合于載體(例如通過化學(xué)交聯(lián)），其可通過連接基團(tuán)，或通過(多個）中間 結(jié)合基團(tuán)（例如通過生物素-鏈霉抗生素(streptavidin)相互作用）間接結(jié)合。因此，可為捕 捉探針或第一 RCA引物或第一 RCA產(chǎn)物提供在載體上提供的用于固定的裝置(例如親和結(jié)合 伴侶，例如生物素或半抗原或核酸分子，其能夠結(jié)合于其結(jié)合伴侶，即同源結(jié)合伴侶，例如 鏈霉抗生素或抗體或核酸分子）?？稍诮Y(jié)合于分析物之前或之后固定捕捉探針。此外，可將 此類"可固定的"捕捉探針與同載體一起的樣品接觸。類似地，可在第一 RCA等之前或之后固 定第一 RCA引物。
[0149] 捕捉探針可以例如是能夠特異性結(jié)合于靶分析物的抗體或核酸分子。換句話說， 捕捉探針可以是固定的（或可固定的)包含分析物結(jié)合域的分析物特異性探針（即分析物捕 捉探針）。因此在此類實施方式中，首先利用固定的或可固定的捕捉探針捕獲分析物，所述 探針僅用于將分析物固定在固相上，隨后將固定的分析物經(jīng)歷使用第一 RCA模板或?qū)е碌?一RCA模板產(chǎn)生的檢測方案，其中用于第一RCA的引物附著于分析物。在此類實施方式中，所 述捕捉探針可以是能夠直接或間接結(jié)合分析物的任何結(jié)合伴侶。更具體地，此類捕捉探針 特異性結(jié)合分析物。
[0150] 固體載體可以是目前被廣泛使用的或被提出用于固定、分離等的任何公知的載體 或基質(zhì)。這些載體可采用顆粒(例如可以是磁性或非磁性的珠粒）、薄片、凝膠、濾紙、膜、纖 維、毛細(xì)管或微量滴定條、管、平板或孔等的形式。
[0151] 所述載體可以由玻璃、硅石、膠乳或聚合物材料制成。呈現(xiàn)高的表面積的用于結(jié)合 分析物的材料是合適的。此類載體可具有不規(guī)則表面，并且可以是例如多孔的或顆粒性的， 例如顆粒、纖維、網(wǎng)、燒結(jié)體或篩子。顆粒材料例如珠粒因它們的更大的結(jié)合能力而為有用 的，特別是聚合物珠粒。
[0152] 便利地，根據(jù)本發(fā)明使用的顆粒固體載體將包括球形珠粒。珠粒的尺寸不是至關(guān) 重要的，但是它們可以例如具有至少Ιμπι、優(yōu)選至少2μπι的直徑的量級，并且具有優(yōu)選不超過 ΙΟμπι，例如不超過6μηι的最大直徑。
[0153] 單分散顆粒，即在尺寸上基本上均一（具有小于5%的直徑標(biāo)準(zhǔn)差的尺寸）的那些 單分散顆粒，具有它們提供非常均一的反應(yīng)再現(xiàn)性的有利方面。代表性單分散聚合物顆粒 可通過在US-A-4336173中描述的技術(shù)來產(chǎn)生。
[0154] 然而，為了幫助操作和分離，磁性珠粒是有利的。如本文中所用，術(shù)語"磁性的"是 指當(dāng)被置于磁場中時載體能夠賦予其磁矩，即順磁的，并因此在該場的作用下是可移動的。 換句話說，包含磁性顆粒的載體可通過磁性聚集而被容易地去除，這提供了快速、簡單和高 效的在分析物結(jié)合步驟后分離顆粒的方式。
[0155] 在其它實施方式中，分析物本身可以例如通過非特異性吸附而被固定(或可固定 的)在固相上。在一個具體的此類實施方式中，分析物可存在于附著(能夠附著)于固體載體 的細(xì)胞(可選地被固定和/或透化）內(nèi)，例如可將包含分析物的組織樣品固定在顯微鏡載玻 片上。
[0156] 上述方法通常導(dǎo)致存在于反應(yīng)混合物中的靶依賴性第一RCA產(chǎn)物（即只在靶分析 物的存在的情況下才產(chǎn)生的第一 RCA產(chǎn)物)的檢測。這導(dǎo)致第二RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生，這反過來提 供了在待測定的樣品中的靶分析物的量的測量。該測量可以是定性的或定量的。
[0157] 因此，用于檢測一種或多種靶分析物在復(fù)雜樣品中的存在的上述探針和方法用于 多種不同的應(yīng)用。
[0158] 主題探針和方法可用于篩選樣品的一種或多種靶分析物在樣品中的存在或不存 在。如上文中所指示的，本發(fā)明提供了用于檢測一種或多種靶分析物在樣品中的存在或定 量所述靶分析物的量的探針和方法。
[0159] 主題探針和方法可用于檢測一種或多種靶分析物在多種不同類型的樣品（包括具 有大量非靶實體的復(fù)雜樣品）中的存在。所述主題方法對于檢測樣品或復(fù)雜樣品中的一種 或多種靶分析物是高度靈敏的。
[0160] 根據(jù)上文中的描述和下文中描述的代表性實例，很明顯，本發(fā)明的方法和探針具 有優(yōu)于現(xiàn)有方法的有利方面。值得注意的是，所述方法允許來自第一 RCA產(chǎn)物的信號的信號 放大(從而提高方法的靈敏度）以及也如上文中所指出的，更快的信號產(chǎn)生。提高的靈敏度 可允許僅以低的量存在的分析物被檢測到?；旧?，所述方法允許從RCA反應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)的信 號。形成更大更顯著的反應(yīng)產(chǎn)物，其可被更迅速和更容易地檢測到。來自第二RCA產(chǎn)物的放 大的信號被局限于第一 RCA產(chǎn)物。這可允許分析物的高度靈敏的局部檢測，例如原位檢測。
[0161] 因此在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以以高度特異性的方式產(chǎn)生第一RCA產(chǎn)物，即第一 RCA產(chǎn)物，或事實上第一 RCA模板的產(chǎn)生可嚴(yán)格取決于分析物的存在(例如在鎖式探針，或使 用接近式探針的測定的情況下，所述探針必須結(jié)合并相互作用以產(chǎn)生環(huán)狀RCA模板）。有利 地，根據(jù)本方法，第二RCA取決于第一RCA產(chǎn)物(如在上文中論述的），但對該第二RCA步驟中 的特異性的要求不太嚴(yán)格(事件上其可以是遠(yuǎn)不嚴(yán)格)并且可耐受第二RCA產(chǎn)物的一定程度 的背景產(chǎn)生，因為在第一 RCA產(chǎn)物不存在的情況下，這將遠(yuǎn)低于其存在的情況(在信號強(qiáng)度 和尺寸方面）。在第一RCA產(chǎn)物存在的情況下，即當(dāng)sRCA反應(yīng)發(fā)生時，產(chǎn)生非常強(qiáng)的信號放 大。這在下列實施例中得以證明。
[0162] 然而不希望受理論束縛，據(jù)信兩代或更多代RCA產(chǎn)物，當(dāng)附著在一起并且被標(biāo)記 (例如，利用例如針對第二RCA產(chǎn)物的檢測探針)時，將作為單個顆粒一起在液體中游動。這 可打開使用用來檢測第二RCA產(chǎn)物(或所述方法的sRCA產(chǎn)物）的其它檢測方式(例如流式細(xì) 胞術(shù)或CyTOF)的可能性，從而拓寬了可用于RCA基測定中的檢測的儀器基礎(chǔ)。
[0163] 由第二RCA反應(yīng)提供的強(qiáng)信號放大可允許信號迅速和容易的可視化(例如通過在 低放大倍數(shù)下的顯微鏡觀察或在數(shù)字掃描圖像上），并從而可允許在臨床情形中對測定結(jié) 果進(jìn)行快速容易地目測觀察，例如用于常規(guī)用途的病理結(jié)果的觀察。因此本發(fā)明的方法特 別適合于臨床分析程序。
[0164] 如上文中所指出的，可檢測第一和第二RCA產(chǎn)物，從而允許第二產(chǎn)物在例如低放大 倍數(shù)下被容易地檢測到，同時通過使用對于第一RCA產(chǎn)物是特異性的檢測探針，保存第一 RCA產(chǎn)物的更精確定位。
[0165] 這可以例如有助于鑒定人組織中的稀有的完整病毒基因組拷貝，或另外地檢測稀 有的RCA產(chǎn)物，例如在組織的無效突變檢測時。當(dāng)稀有事件的容易鑒定可以有幫助時的另一 個實例是當(dāng)在絕大多數(shù)非CTC細(xì)胞當(dāng)中篩選循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的存在時。sRCA反應(yīng)的強(qiáng)信 號允許在低放大倍數(shù)下快速且容易地鑒定事件(CTC的檢測），并且在更高放大倍數(shù)下可視 化的第一 RCA產(chǎn)物的更精確定位允許確認(rèn)信號源于CTC而不是源于相鄰的非CTC細(xì)胞。
[0166] 可通過在第一 RCA繼續(xù)進(jìn)行的同時啟動第二RCA來實現(xiàn)的更快的信號放大也在上 文中進(jìn)行了論述。因此，所述方法允許RCA依賴性檢測測定被加速，這在醫(yī)療點場所(例如醫(yī) 生的辦公室等）中可具有價值。通過在sRCA法中進(jìn)行進(jìn)一輪或進(jìn)一代RCA，速度和/或信號強(qiáng) 度的進(jìn)一步增加是可能的。
[0167] 信號強(qiáng)度/速度的增加可允許其它檢測方法超過常規(guī)基于熒光的方法，例如使用 濁度計計數(shù)、磁性計數(shù)、顆粒計數(shù)、電傳感、表面?zhèn)鞲幸约盎谥亓康臋z測技術(shù)。例如在1小 時的擴(kuò)增后來自第二代RCA的一種單獨(dú)的sRCA產(chǎn)物具有數(shù)飛克的潛在重量。此類重量增加 可通過本領(lǐng)域中已知的方法和裝置(諸如懸臂、表面等離子體方法和微量天平例如石英晶 體微量天平等)來檢測。
[0168] 由于本發(fā)明的方法產(chǎn)生增強(qiáng)的被局限于第一RCA的產(chǎn)物的信號，因此其還賦予使 用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)或被分配在平面等上以進(jìn)行高精度數(shù)字檢測來計數(shù)由個別核酸環(huán)(第一 RCA模板)觸發(fā)的個別反應(yīng)產(chǎn)物(第二RCA產(chǎn)物）的能力。因此，所述方法可允許與數(shù)字PCR等 同的反應(yīng)，但無需乳劑或微加工結(jié)構(gòu)，或找到其中每區(qū)室存在正好1個模板的條件。
[0169] 從本發(fā)明的方法衍生的大量擴(kuò)增產(chǎn)物將進(jìn)一步允許個別DNA環(huán)的克隆，因為獲自 個別環(huán)（例如第一 RCA模板）的產(chǎn)物可以被可視化。個別sRCA產(chǎn)物因而可被鑒定和分離。例 如，利用本發(fā)明的擴(kuò)增方法，可在用于分離的低熔點瓊脂糖中實現(xiàn)可視化而無需放大，并且 隨后可分離產(chǎn)物，例如用牙簽挑出，類似細(xì)菌菌落的分離。
[0170] 本發(fā)明的sRCA法提供鑒定和計數(shù)甚至非常稀有的突變的潛能，包括當(dāng)使用相對易 錯突變檢測方法時。因此，第一 RCA產(chǎn)物可使用含有突變的分析物靶核酸環(huán)作為第一 RCA模 板來產(chǎn)生，并且突變序列在第一 RCA產(chǎn)物中的反復(fù)出現(xiàn)可通過使用用于第二RCA的等位基因 特異性(例如突變特異性)探針（即識別存在于第一 RCA產(chǎn)物的單體重復(fù)中的突變序列的探 針)來檢測。
[0171] 稀有突變的檢測對于臨床診斷是非常重要的。例如，某些基因的突變(例如KRAS突 變)在診斷上可以是非常重要的，并且可用于鑒定對特定療法(例如抗-EGFR療法）的獲得性 抗性的出現(xiàn)。近年來許多努力已集中在開發(fā)用于檢測這類突變的方法上。本發(fā)明的方法可 為這類方法提供有用的添加。
[0172] 使用本發(fā)明的sRCA反應(yīng)檢測稀有突變的方法的實例可包括從靶細(xì)胞分離DNA，片 段化DNA，使用被設(shè)計來具有兩個靶特異性末端(所述末端特異性結(jié)合到感興趣的靶區(qū)并允 許靶片段被環(huán)化）的"選擇者"探針來分離可含有感興趣的靶序列（例如突變）的片段，以及 使用環(huán)化的靶片段作為第一 RCA模板進(jìn)行第一 RCA反應(yīng)?？蓪⒁虼水a(chǎn)生的第一 RCA產(chǎn)物經(jīng)歷 本發(fā)明的sRCA法。用于第二RCA的探針可被設(shè)計來識別（例如結(jié)合，和/或被連接)期望被檢 測到的突變序列。因此，通過分離靶序列來產(chǎn)生第一 RCA模板，提供了產(chǎn)生包含多個(互補(bǔ)） 拷貝的靶序列的第一 RCA產(chǎn)物的機(jī)會。因此，可在多聯(lián)體第一 RCA產(chǎn)物中產(chǎn)生增加的數(shù)目的 "革巴"。這些靶中的每一個靶可被探針(所述探針可被設(shè)計來對于期望被檢測出的突變是特 異性的)結(jié)合，以啟動第二RCA反應(yīng)，隨后可檢測第二RCA產(chǎn)物以檢測所述突變。
【附圖說明】
[0173] 本發(fā)明將參考下列非限制性實施例和參考下列附圖來進(jìn)一步描述，其中：
[0174]里1描繪了根據(jù)本發(fā)明的代表性鎖式探針sRCA反應(yīng)。
[0175] 圖2示出了顯示連接效率對RCA產(chǎn)物的影響的實驗的結(jié)果。利用dUTP產(chǎn)生第一 RCA 產(chǎn)物，孔1-7具有含dUTP的RCA產(chǎn)物，并且孔1-6具有連接的鎖式探針(第二RCA探針）?？?-2 中的鎖：RCA單體比率為3 : 9，在孔3-4中為3 :1，并且在孔5-6為3 : 0.02。只用UNG或用UNG Exol/111處理來自孔1-6的樣品。UNG只降解RCA產(chǎn)物，而exol/111處理降解所有單鏈或雙鏈 寡核苷酸，并且只有環(huán)化的DNA可保持完整。在孔8中，只存在鎖，并且在Exol/111處理后，其 被完全降解。在孔9-12中，只有不同濃度的鎖作為濃度參照來估計不同鎖:RCA單體比率下 的連接效率。
[0176] _示出了不同溫度下對鎖sRCA反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性測試的結(jié)果:不加熱，65°C持續(xù) 5或10分鐘，95 °C持續(xù)5或10分鐘。
[0177] _示出了來自3輪RCA的結(jié)果。RCA反應(yīng)產(chǎn)物全部用Cy3寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，并且在 相同的曝光時間200ms下拍攝(除100X物鏡圖像外，其在93ms下拍攝）。如下進(jìn)行總體實驗： 1RCA樣品：滾動100分鐘；2RCA樣品：第一次滾動20分鐘，第一次連接20分鐘，并且第二次滾 動60分鐘，3RCA樣品：第一次滾動20分鐘，第一次連接20分鐘，并且第二次滾動20分鐘，第二 次連接20分鐘，并且第三次滾動20分鐘。所有樣品的總體反應(yīng)時間相同（100分鐘）JRCA背 景和3RCA背景是其中不存在第一 RCA模板的對照實驗，并且顯示來自sRCA探針的RCA信號。 [0178] 圖5比較了通過100X EPI顯微鏡或100X SIM獲得的鎖式sRCA反應(yīng)的結(jié)果。并且將 它們在垂直方向上配對。
[0179] _示出了利用接近式連接測定(PLA)，使用鎖式sRCA在Hs578T乳腺癌細(xì)胞系中原 位檢測Lgr5靶抗原的實驗的結(jié)果。原位鎖式探針(第二探針）：兔+/_，針對相同的初級Lgr5 抗體。該第一滾動鎖具有兩個連接位點。在常規(guī)RCA和sRCA圖中，應(yīng)用正和負(fù)PLA探針，但在 sRCA背景圖中，只應(yīng)用正探針。在滾動設(shè)置中，第一RCA步驟花費(fèi)1小時，并且隨后在sRCA和 sRCA背景孔中進(jìn)行30分鐘連接，在連接步驟過程中，只用連接緩沖液孵育常規(guī)RCA孔。在RCA 連接步驟后，使RCA反應(yīng)滾動另外1小時。利用相同的檢測寡核苷酸序列和熒光團(tuán)(Cy3)檢測 常規(guī)RCA和超級RCA。在相同曝光時間下拍攝所有6個圖像，對于DAPI，曝光時間為90ms，對于 Cy3通道，曝光時間為1500ms。上面3個圖像是在20X物鏡下拍攝的，下面3個圖像是在10X物 鏡下拍攝的。在相同位置拍攝兩張來自每一個實驗設(shè)置(常規(guī)RCA、sRCA、sRCA背景）的圖像 (10X和20X)。
[0180] g示出了在載玻片上進(jìn)行的并使用HRP讀出器檢測的鎖式sRCA反應(yīng)的結(jié)果。使用 2.5X物鏡通過亮視野顯微鏡術(shù)拍攝圖像。
[0181] _示出了在載玻片上進(jìn)行的并使用HRP讀出器檢測的鎖式sRCA反應(yīng)的結(jié)果。使用 10X物鏡通過亮視野顯微鏡術(shù)拍攝圖像。
[0182] 圖9呈現(xiàn)出顯示通過流式細(xì)胞術(shù)在不同濃度的第一 RCA鎖lpM、100fM、10fM和lfM下 進(jìn)行的鎖式sRCA產(chǎn)物的檢測的點圖。
[0183] 圖10是顯示來自實施例7中的流式細(xì)胞術(shù)實驗的變異系數(shù)的圖。棱形顯示計算為 來自3個不同計數(shù)的平均數(shù)的不同輸入鎖濃度（以fM顯示)下的事件。正方形顯示基于3個計 數(shù)計算的變異系數(shù)(CV)。
[0184] 圖11是顯示比較鎖式sRCA反應(yīng)(直線曲線）與不同鎖濃度(5nM、lnM、750pM、500pM、 250pM、125pM、75pM和50pM)下的常規(guī)RCA(僅一輪）的RCA生長曲線（熒光對循環(huán)數(shù)）的放大 圖。在37°C將5pM的第一RCA模板滾動60分鐘。第一鎖的尺寸為87bp，并且假定在37°C下 phi29酶的滾動速度為2000個堿基/分鐘，存在約1379個鎖負(fù)鏈的重復(fù)。隨后用ΙΟΟηΜ第二 RCA鎖在37 °C下連接第一 RCA產(chǎn)物，進(jìn)行30分鐘。此后，添加 sybr和滾動混合物，并將其放入 PCR儀以測量每一分鐘的熒光值。
[0185] 圖12是比較結(jié)合至第一RCA產(chǎn)物的具有不同長度的靶互補(bǔ)區(qū)（8個+8個、10個+10 個、12個+12個、14個+14個、16個+16個、18個+18個和20個+20個核苷酸）的鎖的在鎖式sRCA 反應(yīng)中的滾動效率的圖。使用一系列90bp長的鎖，其具有相同的背景和連接位點，鎖之間的 差異為用于雜交的臂長度。最長臂為20個+20個，并且對于較短的臂，將邊界堿基突變成不 匹配的堿基。將第一 RCA產(chǎn)物預(yù)滾動1小時，并且隨后在RCA產(chǎn)物上連接第二RCA鎖，進(jìn)行1小 時。隨后將滾動混合物和sybr金添加至連接混合物中，并將其放入Q-PCR儀以監(jiān)測每一個反 應(yīng)的生長曲線。每1分鐘收集數(shù)據(jù)，持續(xù)4小時。
[0186] 圖13呈現(xiàn)顯示圖12的具有不同長度的靶互補(bǔ)區(qū)（臂長度）的二級鎖在RCA產(chǎn)物上的 連接效率的凝膠圖像。泳道1:20+20;泳道2:18+18;泳道3:16+16;泳道4:14+14;泳道5:12+ 12;泳道6:10+10;泳道7:8+8)。
【具體實施方式】
[0187] 實施例
[0188] 鎖式RCA材料和方法
[0189] 寡核苷酸
[0190] 所有寡核苷酸訂購自Integrated DNA Technologies，Inc，并且所述寡核苷酸序 列列于表1中。如果適用，表中包括特定的5'和3'末端修飾。
[0191] 第1鎖式連接
[0192] 通過添加 ΙΟΟηΜ引物寡核苷酸（SEQ ID N0.1)、100nM sRCA-p-s3bc鎖式寡核苷酸 (SEQ ID NO .10)、IX緩沖液4(New England Biolabs )、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶 (Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)在50yL反應(yīng)中進(jìn)行第1 鎖 式連接。將反應(yīng)在37 °C下30分鐘，隨后在65 °C下加熱滅活20分鐘。
[0193] 第1RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生
[0194] 通過添加0.5μ1的第1鎖式連接混合物至50μ1的滾動混合物（由IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP或ImM含尿啼啶dNTP組、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）來進(jìn)行第一RCA產(chǎn)物的產(chǎn)生。將 反應(yīng)在37°C下孵育75分鐘，隨后在65°C下加熱滅活1分鐘。
[0195] 在實施例1至8中，用于sRCA的鎖中的靶互補(bǔ)區(qū)的長度為10+10個核苷酸。
[0196] 實施例1
[0197] 本實施例研究不同鎖:RCA單體比率的連接以及效率和效果。
[0198] 大致實驗設(shè)置如下:通過使用含dUTP的dNTP組產(chǎn)生第一 RCA。然后添加不同鎖濃度 與連接組分。連接后，用UNG或UNG+外切核酸酶Ι/Ill處理反應(yīng)混合物以降解第一 RCA產(chǎn)物或 第一 RCA產(chǎn)物和所有未連接的線性鎖。然后用6%TBE-尿素凝膠分析樣品。
[0199] 將幾個不同量的預(yù)產(chǎn)生的含尿嘧啶的第1RCA產(chǎn)物添加至50μ1第2鎖式連接混合物 (其由 IX緩沖液4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx鎖式寡核苷酸（SEQ ID No. 11)組成）中以獲得3:9、3:1或3:0.02的第2RCA鎖:第1RCA單體。將反應(yīng)物在37°C下孵 育30分鐘。然后將每一個第二連接混合物分成兩部分，一部分添加0.02U尿嘧啶-DNA糖苷酶 (Thermo-Scientif ic)、0· 2U內(nèi)切核酸酶IV(New England Biolabs)，另一部分添加0 · 02U尿 啼啶-DNA糖基化酶（Thermo-Scientif ic)、0· 2U內(nèi)切核酸酶IV(New England Biolabs)、 0.4U外切核酸酶 I (New England Biolabs)和4U外切核酸酶 III (New England Biolabs)。將 反應(yīng)在37°C下孵育60分鐘。然后將5μ1的每一個樣品與5μ1的2XNovex?TBE-尿素樣品緩沖 液(Invitrogen)混合，隨后在80°C下進(jìn)行變性，并在加熱后立即置于冰上。將10μ1的每一個 樣品裝載至6%ΤΒΕ-尿素凝膠（Invitrogen)的每一個孔中，并用180伏運(yùn)行60分鐘。然后用 IX SYBR金（Invitrogen)lXTEB緩沖液對凝膠進(jìn)行染色，利用Gel DOC EZ系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn) 行成像。結(jié)果示于圖2中。
[0200] 實施例2
[0201] 穩(wěn)定性測試
[0202] 進(jìn)行本實施例以測試鎖式sRCA在高溫ex 65°C和95°C下的穩(wěn)定性。將ΙμL第一RCA 產(chǎn)物添加至50μ1第二鎖式連接混合物（由IX緩沖液4(New England Biolabs)、0.2mM ΑΤΡ、 0.02U T4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)以及 ΙΟΟηΜ p-bx鎖式寡核苷酸（SEQ ID如.11)組成）中。將反應(yīng)在37°(：下孵育30分鐘。然后將 ImM dNTP、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸和200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸以及0.1U phi29 聚合酶(Thermo-Scientific)添加至反應(yīng)混合物中，隨后在37°C下孵育100分鐘。然后將反 應(yīng)混合物分成5部分，并且每一個部分經(jīng)歷不同加熱處理條件。隨后將10μ1的每一個加熱樣 品置于多聚L-賴氨酸載玻片上，并用ΕΡΙ焚光顯微鏡(Carl Zeiss)顯現(xiàn)。結(jié)果示于圖3中，該 圖顯示鎖式sRCA反應(yīng)產(chǎn)物可在于65 °C和95 °C下加熱后被檢測到。
[0203] 實施例3
[0204]實驗比較使用鎖式探針進(jìn)行不同輪的RCA的結(jié)果，并且顯示可通過鎖式sRCA獲得 的信號放大;對于2(2RCA)或3(3RCA)輪的RCA看到較強(qiáng)的信號。
[0205]用涂覆有鏈霉抗生素的載玻片（Surmodics)在37°C下孵育50μ1的ΙρΜ第一鎖式連 接混合物30分鐘，隨后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗滌2次。然后將50μ1的RCA混合物 (由IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加至載玻片，并在37°C下孵 育20分鐘，隨后用50μ1的1XPBS+0.05%Tween 20洗滌2次。之后，將50μ1的連接混合物（由IX 緩沖液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA 連接酶（Thermo-Scientific) 以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx鎖式寡核昔酸（SEQ ID No.11) 組成)施加至載玻片上，并在37 °C下孵育20分鐘，隨后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗滌 2 次。之后，將 50μ1 的 RCA 混合物（由 IX 緩沖液 4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸（SEQ ID N0.6)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加至載玻片上，并于37°C孵育下20分鐘，隨 后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗滌2次。然后將第三輪連接混合物（由IX緩沖液4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bw鎖式寡核昔酸（SEQ ID NO. 14)組成）施加至載玻 片上，并于37 °C下孵育20分鐘，隨后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗滌2次。最后將50μ1 的RCA混合物（由 IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶 (Thermo-Scientific)、300nMsRCA-w-引物寡核苷酸（SEQ·IDN0·7)、200nMsRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸（SEQ ID N0.3)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加至載玻片 上，并在37 °C下孵育20分鐘，隨后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗滌2次。根據(jù)實驗設(shè)置， 一些樣品不具有2個或更多個滾動步驟，隨后在最后的滾動步驟中提供200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸(SEQ ID NO.3)。結(jié)果示于圖4中。
[0206] 實施例4
[0207]本實驗比較通過EPI和S頂顯微鏡進(jìn)行的鎖式sRCA結(jié)果的可視化。
[0208]用涂覆有鏈霉抗生素的載玻片（Surmodics)在37°C下孵育50μ1的ΙρΜ第一鎖式連 接混合物30分鐘，隨后用50μ1的lXroS+0.05 % Tween 20洗滌2次。然后將50μ1的RCA混合物 (由IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加至載玻片上，并于37°C下 孵育60分鐘，隨后用50μ1的lXPBS+0.05%TWeen 20洗滌2次。之后，將50μ1的連接混合物（由 IX 緩沖液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U Τ4 DNA 連接酶（Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和ΙΟΟηΜ p_bx鎖式寡核苷酸（SEQ ID如.11)組成）施加至載玻片上，并于37°(：下孵育30分鐘，隨后用5(^1的1乂?83+0.05% Tween 20洗滌2分鐘。之后，將50μ1的RCA混合物（由IX緩沖液4(New England Biolabs)或IX Olink緩沖液（由Olink Bioscience友好提供）、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸（SEQ ID Ν0·6)、200ηΜ sRCA-d-S3-FITC寡核苷 酸（SEQ ID Ν0·2)、200ηΜ sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸（SEQ ID N0.3)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加至載玻片上，并于37°C下孵育60分鐘，隨后用50μ1的1XTOS+ 0.05%Tween 20洗滌2次。利用EPI焚光顯微鏡（Carl Zeiss)或Structured Illumination 顯微鏡(Carl Zeiss)獲取圖像。結(jié)果示于圖5中。來自S頂和EPI的圖像幾乎相同；1RCA產(chǎn)物 不呈圓形，這在鎖式sRCA樣品中引起拉伸的形態(tài)。RCA緩沖液還可影響串滴的形狀(在EPI中 比較21^緩沖液4與21^01丨1^緩沖液）。
[0209] 實施例5
[0210] 使用鎖式sRCA的原位接近式連接測定(PLA)。
[0211]在本實驗中，PLA是接近式連接測定，進(jìn)行該測定以在如Hs578T乳腺癌細(xì)胞系中原 位檢測Lgr5抗原。通過鎖式sRCA檢測相較于常規(guī)RCA( 1輪)的PLA產(chǎn)物。
[0212] 實驗基本上遵照來自〇1 ink Duolink試劑盒(01 ink Bioscience)的方案。簡言之， 將40μ1的0.3ng/yl LGR5N-末端抗體(Abgent)稀釋物應(yīng)用于細(xì)胞，在2次5分鐘的1XTBS+ 0.05%Tween 20洗滌后，隨后將40μ1的1:250的第二抗兔正和負(fù)探針（Olink Bioscience) 混合物的稀釋物施用于細(xì)胞。然后，將4 0 μ 1的連接混合物（由1X T 4 D N A連接酶緩沖液 (Therm〇-Scientific)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA 連接酶（Thermo-Scientific)以及 0.〇2mg/ml BSA(New England Biolabs)、100nM S3l852Backpiece寡核苷酸（SEQ ID NO·8) 和lOOnM S3夾板寡核苷酸（SEQ ID如.9)組成)施加至載玻片上，并于37°(：下孵育30分鐘， 隨后用1XTBS+0.05 % Tween 20洗滌2次。之后，將40μ1的RCA混合物（由IX 01 ink緩沖液（由 Olink Bioscience友好提供）、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加于載玻片上，并于37°C下孵育60分鐘，隨 后用lXTBS+0.05%Tween 20洗滌2次。然后將第二連接混合物（由IX T4 DNA連接酶緩沖液 (Therm〇-Scientific)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)和0.02mg/ ml BSA(New England Biolabs)、100nM p-S3x padrCk寡核苷酸（SEQ ID N0.12WP100nM p-bx鎖式寡核苷酸(SEQ ID NO. 11)組成)施加至載玻片上，并于37°C下孵育30分鐘，隨后用 1父丁85+0.05%了￥661120洗滌2次。最后將4(^1的1^4混合物（由1乂01丨1^緩沖液、1111]\1(1町？、 0.1U phi29聚合酶（Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-w-引物寡核苷酸（SEQ ID N0.7)、 200nM sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸（SEQ ID Ν0·3)、200ηΜ sRCA-d-S3-Cy3(SEQ ID N0.4)和 0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組成）施加于載玻片上，并于37°C下孵育60分鐘，隨 后用lXTBS+0.05%Tween 20洗滌2次。然后用EPI熒光顯微鏡(Carl Zeiss)獲取圖像。結(jié)果 示于圖6中?？梢?，可在根據(jù)本發(fā)明的sRCA中相較于常規(guī)RCA檢測到較強(qiáng)的信息，而無增強(qiáng)的 背景，從而提供了提高的靈敏度。
[0213] 實施例6
[0214] 用涂覆有鏈霉抗生素的載玻片（Surmodics)在37°C下孵育50μ1的100fM/50fM/ 25fM/12.5fM/6.25fM/3.125fM第一鎖式連接混合物30分鐘，隨后用50μ1 的 1XPBS+0.05% Tween 20洗滌2次。然后將50μ1 的RCA混合物（由 IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Therm〇-Scientific)、0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)組 成)施加至載玻片上，并于37 °C下孵育60分鐘，隨后用50μ1的1XPBS+0.05 % Tween 20洗滌2 次。之后，將 50μ1 的連接混合物（由 IX 緩沖液 4(New England Biolabs)、0.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)以及0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)和100nM p-bx鎖式寡核苷酸(SEQ ID NO. 11)組成)施加至載玻片上，并于37°C下孵育30分鐘，隨后用 50μ1的lXPBS+0.05%Tween 20洗滌2次。之后，將50μ1的RCA混合物（由IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-χ-引 物寡核苷酸（SEQIDN0·6)和0·02mg/mlBSA(NewEnglandBiolabs)組成）施加至載玻片 上，并于37°C下孵育60分鐘，隨后用50μ1的lXPBS+0.05%Tween 20洗滌2次。之后，將50μ1的 檢測混合物（由在IX Olink緩沖液（由Olink Bioscience友好提供）中的ΙΟΟηΜ的S3-HRP檢 測寡核苷酸（SEQ ID NO.5)組成)施加至載玻片上，并于37°C下孵育60分鐘，隨后用50μ1的 lXroS+0.05%Tween 20洗滌2次。然后將DAB底物(Olink Bioscience)施加至載玻片上，將 混合物孵育15分鐘，并隨后用MQ水洗掉。利用2.5X物鏡（圖7)或10X物鏡（圖8)通過亮視野顯 微鏡拍攝圖像。利用智能手機(jī)的照相機(jī)或具有額外微距鏡頭的計算機(jī)照相機(jī)可看到信號。
[0215] 實施例7
[0216] 流式細(xì)胞術(shù)檢測
[0217] 將50μ1的第一RCA混合物（由lpM/100fM/10fM/lfM 1RCA連接的模板與IX緩沖液4 (New England Biolabs)、lmM dNTP，0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起組成）于37°C下孵育75分鐘，隨后在65°C下加熱滅活1分 鐘。之后，將〇.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶（Thermo-Scientific)和ΙΟΟηΜ p-bx鎖式寡核 苷酸（SEQIDN0.11)添加在反應(yīng)中，隨后于37°C下孵育30分鐘。然后將300nMsRCA-χ-引物 寡核苷酸（SEQ ID Ν0·6)、200ηΜ sRCA-d-lb-Cy3寡核苷酸（SEQ ID N0.3)和0.1U phi29聚 合酶(Thermo-Scientific)添加至反應(yīng)混合物中，隨后于37°C下孵育100分鐘。然后用500μ1 C2CA緩沖液（由50mM Tris-HCI、20mM EDTA、0.1%Tween 20和 1Μ NaCl組成）稀釋反應(yīng)混合 物，利用LSRII流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)分析樣品。結(jié)果示于圖9和10中。
[0218] 在本實驗中，如圖9中所示，只用FITC寡核苷酸標(biāo)記sRCA串滴，這樣在流式細(xì)胞術(shù) 中應(yīng)當(dāng)只存在FITC陽性事件，這顯示于P2群體中。根據(jù)先前的實驗，所有背景信號將出現(xiàn)在 其中FITC小于1000的區(qū)域，這樣只有具有高于1000的FITC信號值的事件才會被計數(shù)為真實 信號。當(dāng)運(yùn)行樣品時，將流式細(xì)胞儀設(shè)置至"高"流速，并將取樣時間設(shè)置至1分鐘。在該設(shè)置 中，ΙρΜ樣品獲得362，006個事件，100f Μ樣品獲得34，005個事件，1 Of Μ樣品獲得3，778事件， lfM樣品獲得446個事件。對于其中第一RCA鎖被省略的樣品，只存在1個事件。流式細(xì)胞術(shù)中 的劑量反應(yīng)是完全線性的。對于檢測效率，具有50ul的總體積的1 pM濃度的鎖，存在3.01* 1〇7個鎖分子，機(jī)器采集60uL的10倍稀釋的反應(yīng)混合物的樣品，因此有3.612*10 6個分子流過 機(jī)器，我們檢測到的數(shù)目為約362,006個，因此我們的檢測效率為約10%。
[0219] 在圖10顯示的結(jié)果中，所有實驗程序相同，并且流式細(xì)胞儀被設(shè)置至〃慢〃速率，取 樣時間為1分鐘。制備具有不同濃度的3個樣品，并將每一個樣品在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行3次， 記錄數(shù)據(jù)。圖10中用棱形顯示的每一個事件是來自3個不同計數(shù)的平均數(shù)，并且基于3個計 數(shù)來計數(shù)CV值。在所有3個不同濃度下CV均低于5 %。
[0220] 實施例8
[0221] RCA生長曲線
[0222]本實驗呈現(xiàn)以5pM的第一 RCA模板進(jìn)行的鎖式sRCA反應(yīng)相較于以不同鎖濃度進(jìn)行 的"常規(guī)" RCA (即僅1輪)的比較。
[0223] 將50μ1第一RCA混合物（由5pM 1RCA連接的模板與IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起組成的）于37°C下孵育60分鐘，隨后在65°C下加熱滅活1分鐘。之后， 將(h2mM ATP、0.02U T4 DNA連接酶(Thermo-Scientific)、100nM p-S3x鎖式寡核苷酸（SEQ IDN0.12)和100nMp-bx鎖式寡核苷酸（SEQIDN0.11)添加在反應(yīng)物中，隨后于37°C下孵 育30分鐘。然后添加300nM sRCA-x-引物寡核苷酸（SEQ ID Ν0·6)、1Χ SYBR金（Invitrogen) 和0.1U phi29 聚合酶（Thermo-Scientific)。同時，將 100nM p-bx鎖式寡核苷酸（SEQ ID 腸.11)與1父（^1'(：1^8&86 11反應(yīng)緩沖液^卩;^6111^6)、2.5111]\1]\111〇12、51](^1'(31^8&86 11 ssDNA連接酶(Epicentre)混合在一起。將反應(yīng)混合物在60°C下孵育60分鐘，隨后在80 °C下 孵育 60 分鐘。將 5nM/lnM/750pM/500pM/250pM/125pM/75pM/50pM 的自環(huán)化的 p-bx 寡核苷酸 (SEQ ID N0.11)與IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶 (Therm〇-Scientific)、300nM sRCA-x-引物寡核苷酸（SEQ ID Ν0·6)、1Χ SYBR金 (Invitrogen)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)混合在一起。之后，利用MX3000Q-PCR(Stratagene)分析這些樣品。循環(huán)參數(shù)為120個循環(huán)(37°C下持續(xù)1分鐘）。結(jié)果示于圖11 中。
[0224]直線曲線顯示5pM的sRCA聚合速度。另外的曲線顯示在不同鎖濃度下的常規(guī)鎖式 滾動曲線。每一個曲線的斜率代表滾動速度。如果我們假定Phi29聚合酶在所有樣品中以相 同速度滾動，則斜率可代表每一個樣品中有多少鎖發(fā)生滾動。5pM sRCA產(chǎn)生與SnM常規(guī)鎖幾 乎相同的速度，因此兩輪sRCA產(chǎn)生1000倍的信號的增強(qiáng)。
[0226] 實施例9
[0227] 本實驗顯示靶互補(bǔ)區(qū)（RCA產(chǎn)物上的鎖的雜交臂）的長度如何影響第二RCA鎖的滾 動效率。
[0228] 使用一系列90bp長的鎖，其具有相同的骨架和連接位點，但不同在于用于雜交的 臂長度。最長臂為20+20,并且對于較短的臂，使邊界堿基突變成不匹配的堿基。
[0229] 將第一 RCA產(chǎn)物預(yù)滾動1小時，然后使第二RCA臂在RCA產(chǎn)物上連接1小時。然后將滾 動混合物和sybr金添加至連接混合物中，并放置在Q-PCR儀中以監(jiān)測每一個反應(yīng)的生長曲 線。每隔1分鐘收集數(shù)據(jù)，持續(xù)4小時。
[0230] 將50μ1第一RCA混合物（由5pM 1RCA連接的模板與IX緩沖液4(New England Biolabs)、lmM dNTP、0.1U phi29聚合酶（Thermo-Scientific)和0.02mg/ml BSA(New England Biolabs)-起組成的）于37°C下孵育60分鐘，隨后于65°C下加熱滅活1分鐘。之后， 將100nM的sRCA-p-S3x20(SEQ ID N0.15)、sRCA-p-S3xl8(SEQ ID N0.16)、sRCA-p-S3xl6 (SEQIDN0.17)、sRCA-p-S3xl4(SEQIDN0.18)、sRCA-p-S3xl2(SEQIDN0.19)、sRCA-p-S3xlO(SEQ ID N0.20)、sRCA-p-S3x8(SEQ ID N0.21)分別與0.2mM ATP、0.02U T4 DNA連接 酶(Thermo-Scientific)混合，隨后于37°C下孵育30分鐘。獲取等份，用0.02U尿嘧啶-DNA糖 苷酶（（Thermo-Scientif ic)、0· 2U內(nèi)切核酸酶IV(New England Biolabs)在37°C下處理60 分鐘，然后在10 % TBE-尿素凝膠（Invi trogen)中分析反應(yīng)混合物。然后將剩余樣品與300nM sRCA-χ-引物寡核苷酸、IX SYBR 金（Invitrogen)和0.1U phi29 聚合酶（Thermo-Scientific)混合。用MX3000Q-PCR(Stratagene)分析樣品。循環(huán)參數(shù)為120個循環(huán)(37°C，持 續(xù)1分鐘）。
[0231] 結(jié)果示于圖12中。從該圖很清楚的是，臂(靶互補(bǔ)區(qū)）的長度越短，鎖在第二RCA反 應(yīng)中可滾動越快。8+8鎖產(chǎn)生最佳結(jié)果。將10+10鎖與12+12鎖相比較，它們具有幾乎相同量 的連接的鎖，但10+10滾動更快。20+20鎖的曲線幾乎是平的，確實顯示了第二RCA以極低的 幾乎不可察覺的水平發(fā)生。18+18鎖具有略微較高的背景，因此信號似乎比實際情況強(qiáng)。通 常的做法是此時評估圖如該圖以忽略前幾個循環(huán)和測量從其的增加。事實上，為了更好的 結(jié)果評估，不是看如圖12中顯示的終點測量，而是如Nilsson等，2002,30(14) ;e66中描述 的，可制備生長曲線的導(dǎo)數(shù)。然而，結(jié)果顯示了長度與RCA反應(yīng)效率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示對 于使用鎖式探針的成功且高效的RCA，所述探針應(yīng)當(dāng)具有小于20或小于18的臂長(靶互補(bǔ)區(qū) 的長度）?？捎眠_(dá)到16的臂長獲得第二RCA，但利用較短的臂長可提高效率。因此，結(jié)果支持 達(dá)到或小于14，或更具體地達(dá)到12或小于12的臂長可產(chǎn)生較好的結(jié)果。
[0232] 進(jìn)行進(jìn)一步實驗以評估不同鎖的連接效率的結(jié)果示于圖13中。這顯示臂的長度也 影響連接效率，并且較短的鎖具有略微更好的連接效率。
[0233] 實施例10.
[0234] 下面提供用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的方案，其中在可環(huán)化的探針連接后，進(jìn)行除去 未結(jié)合的和/或未連接的探針（可環(huán)化的寡核苷酸）的清除步驟(3'外切核酸酶降解-步驟 IV)。
[0235] I-雜交和連接
[0239] III-第二鎖雜交和擴(kuò)增酶連接

【主權(quán)項】
1. 一種用于進(jìn)行包括至少兩輪RCA的局部RCA反應(yīng)的方法，其中第二RCA反應(yīng)的產(chǎn)物附 著并從而局限于第一 RCA反應(yīng)的產(chǎn)物，所述方法包括： (a) 提供包含重復(fù)單體的多聯(lián)體第一 RCA產(chǎn)物； (b) 將包含靶互補(bǔ)3'和5'末端區(qū)的可環(huán)化的寡核苷酸與所述第一RCA產(chǎn)物的單體直接 或間接雜交，以便所述寡核苷酸的3'和5 '末端并置地雜交以彼此直接或間接地連接，其中 所述靶為所述第一 RCA產(chǎn)物的單體或與其雜交的中間分子中的序列，并且其中所述可環(huán)化 的寡核苷酸的祀互補(bǔ)末端區(qū)的長度為6個至16個核苷酸； (c) 將所述可環(huán)化的寡核苷酸的末端直接或間接連接以環(huán)化所述寡核苷酸，從而提供 用于第二RCA反應(yīng)的模板，其中當(dāng)所述末端間接連接時，（i)提供在所述可環(huán)化的寡核苷酸 的3'與5'末端之間與所述第一RCA產(chǎn)物的單體雜交，以便其可連接于各自末端的間隙寡核 苷酸，或通過聚合酶延伸所述可環(huán)化的寡核苷酸的雜交的3'末端以便延伸的3'末端可連接 于雜交的5'末端，并且（ii)與所述單體直接或間接雜交的第二RCA模板的區(qū)域的總長度不 長于32個核苷酸;和 (d) 使用（c)的所述第二RCA模板和用于所述第二RCA的引物進(jìn)行第二RCA反應(yīng)，以形成 第二RCA產(chǎn)物，其中在所述第二RCA反應(yīng)中，所述第二RCA模板保持附著于所述第一RCA產(chǎn)物， 從而所述第二RCA產(chǎn)物附著于所述第一 RCA產(chǎn)物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可環(huán)化的寡核苷酸與所述第一 RCA產(chǎn)物直接雜 交。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(a)包括產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中重復(fù)步驟(a)、（b)、（c)和(d) -次或多 次。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述可環(huán)化的寡核苷酸的靶互補(bǔ)區(qū)的 長度為6~15個、6~14個、6~13個、6~12個、6~11個或6~10個核昔酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述可環(huán)化的寡核苷酸的靶互補(bǔ)區(qū)的 長度為7~12個、7~11個、7~10個或7~9個核苷酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述第二RCA模板的雜交區(qū)域的總長 度不長于30個、28個、26個、24個、20個、19個、18個、17個或16個核苷酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中在所述可環(huán)化的寡核苷酸的雜交之后 或其連接之后提供用于所述第二RCA反應(yīng)的引物。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述方法是均相的。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中，以基于固相的形式進(jìn)行所述方法。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，固定化所述第一RCA產(chǎn)物。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述方法包括在所述可環(huán)化的寡核 苷酸的雜交之后或其連接之后的一個或多個洗滌步驟。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，在步驟(c)之后但在步驟(d)之前進(jìn)行嚴(yán)格洗滌 的步驟以除去未連接的寡核苷酸。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中，阻斷性寡核苷酸在所述可環(huán)化的 寡核苷酸之間與所述第一 RCA產(chǎn)物雜交。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法，其中，在所述可環(huán)化的寡核苷酸的連接 之后提供具有3'外切核酸酶活性的組分。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，在于步驟(d)中添加所述引物之前提供所述具 有3 '外切核酸酶活性的組分。17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的方法，所述方法進(jìn)一步包括檢測所述附著的第 二RCA產(chǎn)物。18. -種用于檢測樣品中的分析物的方法，其中第一環(huán)狀RCA模板從核酸分析物產(chǎn)生， 或用作或產(chǎn)生為所述分析物的標(biāo)志物，所述方法包括使用所述第一 RCA模板進(jìn)行第一 RCA反 應(yīng)來產(chǎn)生第一 RCA產(chǎn)物，進(jìn)行如根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項中所定義的局部第二RCA反應(yīng)， 以及檢測所述第二RCA產(chǎn)物，和任選的所述第一 RCA產(chǎn)物，從而檢測所述分析物。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一 RCA產(chǎn)物通過免疫RCA或接近式探針測 定產(chǎn)生。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19中任一項所述方法用于檢測樣品中的不止一種分析物，其中 提供不同的可環(huán)化的寡核苷酸用于每一種分析物，并且每一種所述可環(huán)化的寡核苷酸包含 不同的報告域以檢測所述第二RCA產(chǎn)物，或相繼地檢測所述分析物。21. 根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項所述的方法，其中，通過使用核酸染色或通過使用經(jīng) 標(biāo)記的核苷酸以摻入所述RCA產(chǎn)物中，來使用與所述RCA產(chǎn)物特異性雜交的經(jīng)標(biāo)記的檢測寡 核苷酸檢測所述RCA產(chǎn)物。22. 根據(jù)權(quán)利要求17至21中任一項所述的方法，其中，使用液相色譜、電泳、質(zhì)譜、顯微 鏡檢查、實時PCR、焚光探針、微陣列、比色分析諸如ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜(CyTOF)或利用 濁度計計數(shù)、磁性計數(shù)、顆粒計數(shù)、電傳感、表面?zhèn)鞲幸约盎谥亓康臋z測技術(shù)來檢測所述 RCA產(chǎn)物。
【文檔編號】C12Q1/68GK105980579SQ201480073057
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年11月14日
【發(fā)明人】烏爾夫·蘭德格倫, 陳磊
【申請人】歐凌科生物科技公司