馬齒莧中新骨架生物堿化合物及其提取分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其涉及從馬齒莧中提取、分離和鑒別出的新骨架生物堿化合物及其提取分離方法。所述的新骨架生物堿化合物，分子依次式為C18H26N2O，C18H24N2O2，C18H28N2O2，命名為Oleracimine，Oleracimine A和Oleracone A。還提供上述新化合物的提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、ODS中壓柱、及Sephadex LH?20，成功的提取分離出骨架獨(dú)特的新生物堿化合物，新化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤作用，本發(fā)明新化合物及其鹽或衍生物可以作為其他化合物合成先導(dǎo)物，以及新藥開發(fā)和藥理活性研究的原料，用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【專利說明】
馬齒莧中新骨架生物堿化合物及其提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及中藥提取、分離領(lǐng)域，尤其涉及從馬齒莧藥材中提取、分離和鑒別出的 新骨架生物堿化合物及其提取分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，又名長(zhǎng)命菜、馬莧菜，為馬齒莧科植物。馬齒莧 耐旱耐澇，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關(guān)注，2015版 《中華人民共和國(guó)藥典》中收載馬齒莧的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止痢 等功效，用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等。
[0003] 馬齒莧現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧 化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調(diào)節(jié)免疫功能等作用。研究表明馬齒莧眾多化學(xué)成分為其 多樣的藥理作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，馬齒莧主要化學(xué)成分包括黃酮類、香豆素、萜類、留類、生 物堿、氨基酸、各種色素類和礦物質(zhì)類等。其中生物堿是馬齒莧中一類主要的化學(xué)成分，目 前已報(bào)道的生物堿類成分有去甲腎上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N_ 二環(huán)己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺;還有環(huán)二肽生物堿和酰胺類生物堿:馬齒莧酰 胺A-I、K、L、N-S 〇
[0004] 目前從馬齒莧中分離出的化學(xué)成分大多數(shù)是已知的，且結(jié)構(gòu)新穎性較低，因此，對(duì) 馬齒莧中新化合物的開發(fā)和分離是亟待需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供從馬齒莧中提取的新骨架生物堿化合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) 本發(fā)明的新骨架生物堿具有抗炎鎮(zhèn)痛抗腫瘤的作用，同時(shí)提供一種針對(duì)本發(fā)明新化合物的 簡(jiǎn)便、快速、環(huán)保、純度高的提取分離方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供新骨架生物堿化合物，分子式分別為 〇181126他0，〇181124他〇2，〇181128~〇2，命名依次為〇16瓜(3；[111；[116,016抑(3；[111；[116八，016瓜(30116八，化 學(xué)結(jié)構(gòu)式依次為：
[0007]
[0008] 為買現(xiàn)本友明的上還目的，本友明邊提供一種馬齒莧中新骨架生物堿化合物的提 取分離方法，具體步驟為。
[0009] 步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃 縮，放涼至室溫，得藥液備用；
[0010]步驟2、將步驟1中藥液用乙酸乙酯反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸 乙酯萃取物；
[0011] 步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離，依次用石油醚-丙酮梯度洗 脫得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫 部位經(jīng)減壓濃縮至干，得到濃縮物備用；
[0012] 步驟4、將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的0DS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵 合硅膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯 色，將各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得到濃縮物備用；
[0013] 步驟5、將步驟4中所得各濃縮物經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠） 層析分離，分別以甲醇-水梯度洗脫，得到來源于馬齒莧的新骨架生物堿化合物。
[0014] 所述0DS和Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時(shí)，上柱，用甲醇 洗至滴入水中無混濁，再以初始流動(dòng)相平衡。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0016]本發(fā)明中所述馬齒莧新骨架化合物的分離和藥理活性研究未被現(xiàn)有的論文期刊 所報(bào)道;本發(fā)明提供來源于馬齒莧的新骨架生物堿化合物及一種針對(duì)本發(fā)明新化合物的提 取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱、及Sephadex LH-20，成功提取分離出骨架獨(dú)特的新生物堿化合物，該方法操作步驟僅為五步，操作方法 簡(jiǎn)便及快速，提取分離過程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工藝方法環(huán)保，且經(jīng)該方法分 離得到的化合物純度較高均大于90%，此外經(jīng)研究表明以上各化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗 腫瘤作用，因此本發(fā)明三種新化合物及其鹽和衍生物可以作為其他化合物合成先導(dǎo)物，以 及新藥開發(fā)和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的紫外光譜圖。
[0018]圖2為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的紅外光譜圖。
[0019]圖3為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的高分辨質(zhì)譜圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracimine h-NMR光譜圖。
[0021]圖5為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracimine 13C-NMR光譜圖。
[0022]圖6為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。 [0023]圖7為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Olerac imine的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0024]圖8為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振HMBC光譜圖。
[0025]圖9為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振HSQC光譜圖。
[0026]圖10為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振N0ESY光譜圖。
[0027]圖11為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的紫外光譜圖。
[0028]圖12為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的紅外光譜圖。
[0029]圖13為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的高分辨質(zhì)譜圖。
[0030] 圖14為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracimine A h-NMR光譜圖。
[0031] 圖15為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracimine A 13C-NMR光譜圖。
[0032]圖16為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振碳譜(DEPT)光譜 圖。
[0033]圖17為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0034]圖18為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振HMBC光譜圖。
[0035]圖19為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振HSQC光譜圖。
[0036]圖20為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振N0ESY光譜圖。
[0037]圖21為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的紫外光譜圖。
[0038]圖22為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的紅外光譜圖。
[0039]圖23為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的高分辨質(zhì)譜圖。
[0040] 圖24為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracone A h-NMR光譜圖。
[0041 ] 圖25為本發(fā)明新骨架生物堿化合物的Oleracone A 13C_NMR光譜圖。
[0042]圖26為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。 [0043]圖27為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0044]圖28為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振HMBC光譜圖。
[0045]圖29為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振HSQC光譜圖。
[0046]圖30為本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振N0ESY光譜圖。
【具體實(shí)施方式】 [0047] 實(shí)施例1。
[0048]本發(fā)明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H26N20，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0049]
[0050]所述新骨架生物堿化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為Oleracimine，表1為該新骨架生物堿化 合物的核磁數(shù)據(jù):^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0051 ]表1:本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁數(shù)據(jù)。
[0052]
[0053]請(qǐng)參閱圖1-10,本發(fā)明一種新骨架生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。
[0054] Oleracimine:黃色粉末，[a]2QD+4.2(c 0 · 38，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(MeOH)A max: 448， 272nm，IRvN-h3354，vc=01666，v c=N1554，δΝ-h1510，vc-Nl〇49cm- 1，HRESI ( + )T0FMS給出m/z : 287.2118[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為286.2045。結(jié)合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)， 推測(cè)該化合物可能的分子式SC 18H26N20，不飽和度為7。13C-匪R譜和DEPT譜顯示18個(gè)碳信 號(hào)，分別為 7個(gè)〇130:14.4,21.2,27.4,28.6,28.8,29.1，32.5)、2個(gè)(：!12(3 :46.8,52.3)、9個(gè) 季碳（一個(gè)羰基碳，δ :206.2;-個(gè)碳氮雙鍵的碳，δ: 169.4;四個(gè)雙鍵碳，δ :11〇. 7,121.3， 141 · 0，143 · 5;三個(gè)脂肪碳，δ: 38 · 9，50 · 6，65 · 7)。
[0055] h-NMR譜顯示一個(gè)活潑Η信號(hào)δ4.07(1H，s)，表明其可能在一個(gè)氨基基團(tuán)。7個(gè)甲基 信號(hào)，分別為 Sl.l6(3H，s)，Sl.29(3H，s)，Sl.30(3H，s)，Sl.34(3H，s)，Sl.45(3H，s)，Sl.82 (3!1，8)』1.88(3!1，8)。2個(gè)亞甲基信號(hào)分別為52.02(1!1，(1，1=13.5)，51.47(1!1，(1，1=13.5) 和32.56(1!1，(1，1=15.3)，52.28(1!1，(1，1=15.3)，根據(jù)!1-!1邙3￥譜可知，7個(gè)甲基中!1譜3 1.88與51.82相耦合，31.45與51.30相耦合，31.16與51.34、31.29相耦合。而51.82與31.88 相對(duì)于其他甲基化學(xué)位移較大，可能與雙鍵相連。
[0056] HMBC 譜相關(guān)峰表明 H2-6 與 C-5，C-7，C-8，C-9，C-4a 和，C-14; H2-9 與 C-6，C-7，C-8，C-10，C-16 和 C-17; H3-14 與 C-6，C-7，C-8，C-9 和 C-10; H3-15 與 C-8 和 C-8a; H3-16 與 C-9，C-10 和 C-17;H3-17與C-9，C-10和C-16有耦合作用，說明存在兩個(gè)六元環(huán)結(jié)構(gòu)，此兩個(gè)六元環(huán)公用 C-7，C-8，C-8a三個(gè)碳原子，且結(jié)合H-H COSY譜可知，兩個(gè)甲基C-16，C-17連接在C-10上，一 個(gè)甲基C-14連接在C-7上。C-8a，C-10和C-2出現(xiàn)在碳譜低場(chǎng)區(qū)（SC-8a: 141.0，δ〇10:50.6，δ C-2:65.7)，說明此三個(gè)碳原子與Ν相連。由HMBC相關(guān)譜顯示H3-l 1與C-2，C-3和C-12; H3-l 2與 C-2，C-3和C-l 1; Η3-13與C-3，C-4和C-4a的耦合關(guān)系可知，另有一六元環(huán)片段與上述兩個(gè)六 元環(huán)共用C_4a，C-8a和N三個(gè)原子，一個(gè)甲基C-13連接在C-4上，且結(jié)合H-H COSY譜可知兩個(gè) 甲基C-l 1，C-12均連接在C-2上。此外，季碳原子C-5出現(xiàn)在碳譜低場(chǎng)區(qū)（δ(：-5:169.4)，可推 測(cè)得知亞胺基團(tuán)與C-5相連。根據(jù)以上信息，此新骨架生物堿為上述結(jié)構(gòu)。
[0057]本發(fā)明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H24N2O2,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0058]
[0059]所述新骨架生物堿化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為Oleracimine Α，表2為該新骨架生物堿 化合物的核磁數(shù)據(jù):^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0000]表2:本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁數(shù)據(jù)。
[0061]
[0063] 請(qǐng)參閱圖11-20,本發(fā)明一種新骨架生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。
[0064] Oleracimine A:黃色粉末，[a]2QD-13(c 0· 1，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(MeOH)A max: 446， 268nm,IRvN-H 3470,3290,ν〇=〇 1712,1668,5n-h 1628,v〇=n 1578,vc=c 1531,v〇-n 1312cm-l, HRESI( + )T0FMS 給出 111/2:301.1912[]\1+!1]+的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為300.1833。結(jié)合1!1-匪1? ， 13C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測(cè)該化合物可能的分子式為C18H24N 2〇2，不飽和度為8。13C-NMR譜 和 DEPT 譜顯示 18 個(gè)碳信號(hào)，分別為 6 個(gè)(?3(δ:14·7,25·5,27·6,27·8,28·4,28·7)、?Αα?2(δ: 43.3)、1個(gè)ΟΚδ: 22.1)、10個(gè)季碳(兩個(gè)羰基碳，206.6，212.1; -個(gè)碳氮雙鍵的碳，166.8;四 個(gè)雙鍵碳，δ :110.6,122.2,140.3,142.0;三個(gè)脂肪碳，δ :49.3,60.2,65.9)。
[0065] 匪R譜顯示兩個(gè)活潑Η信號(hào)64.07(1!1，8)、61.62(2!^8)，表明存在兩個(gè)氨基基 團(tuán)。6個(gè)甲基信號(hào)，分別為Sl.31(3H，s)J1.34(3H，s)，Sl.37(3H，s)J1.44(3H，s)J1.49 (3!1，8)』1.95(3!1，8)。1個(gè)亞甲基信號(hào)為52.85(1!1，(1，了=17.1)，52.60(1!1，(1，了=17.1)，1個(gè) 次甲基信號(hào)為S2.〇2(lH，s)。根據(jù)H-H COSY譜可知，6個(gè)甲基中，δ?.37與δ?.49相耦合，δ?.44 與si. 34相耦合，δ?. 31與δ2.85相耦合。而δ?.95相對(duì)于其他甲基化學(xué)位移較大，可能與雙鍵 相連。
[0066]由HMBC譜所示，H2-10/與C-l，C-2，C-7，C-8a，C-9和C-16;Hi-3a與C-8和C-8a;H 3-l 1 與C-2，C-3和C-12;H3-12/與C-2，C-3and和C-l 1; H3-I6與C-l，C-2，C-8a和C-10相互耦合，提 示存在一個(gè)六元環(huán)和一個(gè)五元環(huán)，兩環(huán)公用C-1和C-8a兩個(gè)碳原子，C-1和C-3出現(xiàn)在低場(chǎng)區(qū) (δ〇1:49.3，δ〇3:60.2)，提示C-2所在羰基位于C-1和C-3之間，甲基C-16連接在C-1上，C-8 和C-9出現(xiàn)在碳譜低場(chǎng)區(qū)（δ〇8:142.0，δ(：-9:166.8)，說明雙鍵碳原子C-8與伯胺基團(tuán)相連， 亞胺基團(tuán)位于C-9上。結(jié)合H-H COSY譜推測(cè)可知，兩個(gè)甲基C-l 1，C-12連接在C-3上。此外，根 據(jù) HMBC 譜，可知 Hi-3a/與 C-5; H3-l 3 與 C-4，C-5 和 C-14; H3-14/與 C-4，C-5 和 C-13; H3-15 與 C-5，C-6和C-7的耦合關(guān)系，提示存在另外一個(gè)七元環(huán)結(jié)構(gòu)與上述兩環(huán)共用C-3a，C-7和C-8a三 個(gè)碳原子，提示C-5所在羰基與C-4相連。綜合考慮HMBC譜和H-H COSY譜，可知甲基C-15連接 在C-6上，甲基C-13和C-14均與C-4相連。根據(jù)以上信息描述，可確定此新骨架生物堿結(jié)構(gòu)如 上所述結(jié)構(gòu)。
[0067]本發(fā)明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H28N20 2,化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0068]
[0069]所述新骨架生物堿化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)命名為Oleracone A，表3為該新骨架生物堿化 合物的核磁數(shù)據(jù):^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0070] 表3:本發(fā)明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁數(shù)據(jù)。
[0071]
[0072]
[0073] 請(qǐng)參閱圖21-30,本發(fā)明一種新骨架生物堿化合物的結(jié)構(gòu)鑒定與推導(dǎo)。
[0074] Oleracone A:褐色粉末，[a]2QD+20(c 0.1，Me0H)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微 溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(Me0H)Amax:339， 273nm，IRvN-η 3330,3278，vc=h 3075，vc=〇 1655，1620，vc=c 1506，vc-n 1258，1160cm-l， HRESI ( + )T0FMS給出m/z : 305.2359[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，分子量為304.2280。結(jié)合1H-NMR ，13C-NMR以及DEPT數(shù)據(jù)，推測(cè)該化合物可能的分子式為C18H28N 2〇2，不飽和度為6。13C-NMR譜 和 DEPT 譜顯示 18 個(gè)碳信號(hào)，分別 7 個(gè) CH3(S:20.3,22.0,24.4,24.6,25.2,27.3,29.0)、lfCH2 (δ:42·7)、3 個(gè)〇Κδ:44·0,48·3，112·0)、7 個(gè)季碳(兩個(gè)羰基碳，169·5,200·6;三個(gè)雙鍵碳， δ :101.0,132.0,152.7;兩個(gè)脂肪碳，δ :51.0,58.1)。
[0075] 々-Μ?譜顯示兩個(gè)活潑Η信號(hào)64.61(1!1沁8)、65.40(1!^8)，表明存在兩個(gè)氨基基 團(tuán)。7個(gè)甲基信號(hào)，分別為 δ1·08(3Η，8)，δ1·09(3Η，8)，δ1·09(3Η，(1，7·3)δ1·29(3Η，8)，δ1·39 (3Η，s)J1.90(3H，s)J2.35(3H，shl個(gè)亞甲基信號(hào)為δ2.33(lH，d，J= 13.9)，δ2.19( lH，d， 了=13.9)，3個(gè)次甲基信號(hào)為62.44(3!14，了 = 7.3)，62.92(1!14，了 = 5.2)，65.05(1!1，(1，了 = 6.25)。由!1-!1〇)5￥譜可知，有相互耦合關(guān)系的!1為51.09與52.44,51.08與51.29,51.09與3 1.39,32.92與35.05,32.35與34.61。而31.90和32.35相對(duì)于其他甲基化學(xué)位移較大，可能 與雙鍵相連。
[0076] HMBC譜所示相關(guān)峰如下所述，H3-2與C-1，活潑HS5.40(lH，b S)與C-1和C-2相互耦 合，說明存在一個(gè)乙?；巍３?2'與(：-3'，(：-4'，(：-9'3，(：-10'和(：-15'；!1 2-4'與(：-3'，(：-5'，C-6'，C-10'和C-ΙΓ ;Ηι-6'與C-4'，C-6'a和C-9'a;Hi-6'a與C-5'和C-6' ；H3-10'與C-3'， C-4 '，和C-l Γ ;H3-l Γ 與C-3 '，C-4 ' 和C-10 ' ；H3-15 ' 和C-Γ 和C-9 'a相互耦合，考慮到C-Γ 和 C-3 '的化學(xué)位移偏大，推測(cè)與仲胺基團(tuán)相連，如此可斷定一個(gè)八元環(huán)片段的存在，甲基C-15'位于C-Γ上，因 C-5'出現(xiàn)在碳譜低場(chǎng)區(qū)〇(：-5'：132.0)，推斷其與上述酰胺基團(tuán)的仲氨 基相連，結(jié)合H-H COSY譜可知兩個(gè)甲基C-10 '，C-1Γ均連接在C-3 '上。此外，根據(jù)HMBC譜可 知Hi-6'a/與C-7'，C-8'，C-9'，C-9'a，C-12'和C-13' ；Ηι-9'與C-6'，C-6'a，C-7'，C-8'，C-9'a 和C-14' ；H3-12'與C-6'a，C-7'和C-13' ；H3-137與C-6'a，C-7'和C-12' ；H3-14'與C-8'和C-9 '相互耦合，證明一個(gè)五元環(huán)片段的存在，甲基C-14 '與C-9 '相連，根據(jù)ft-9 '與C-8 '的耦合 關(guān)系和C-7 '較大的化學(xué)位移可推斷C-8 '所在的羰基連在出-7 '與C-9 '之間，并且該五元環(huán) 與上述八元環(huán)共用C_6'a和C_9'a兩個(gè)碳原子，結(jié)合H-H COSY譜所示δ1.〇9與δ?.39的相互耦 合可斷定兩個(gè)甲基C-12'和C-13'均連在C-7'上。綜合以上信息推斷，可確定此新骨架生物 堿結(jié)構(gòu)如上所述。
[0077]本發(fā)明還提供上述新骨架生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。
[0078]步驟1:稱取馬齒莧干燥藥材150kg，采用水煎煮提取，水用量為藥材的8~16倍，煎 煮提取兩次，每次煎煮2小時(shí)，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備 用。
[0079]步驟2:將步驟1中所得藥液，用乙酸乙酯反復(fù)萃取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積 比例為1:1(^4,40°(：以下減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
[0080] 步驟3:將步驟2中所得乙酸乙酯萃取物干法上樣，經(jīng)硅膠柱層析分離，其中硅膠為 200~300目，依次用石油醚-丙酮（1:1、1 :2、1:3、1:5，￥:￥)梯度洗脫，共得到150個(gè)部位（即 共得到150個(gè)瓶，每瓶400mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的90~130洗脫部位（即 合并顯色的90~130瓶，棄去1~89瓶與131~150瓶），將合并后的90~130部位經(jīng)40 °C以下 減壓濃縮至干，備用。
[0081] 步驟4:將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的0DS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20~ 40μL?，用甲醇-水（10/90，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脫（加壓，使流速為lml/ min，溫度為室溫），得到10個(gè)部位（即梯度洗脫得10個(gè)瓶，每瓶200mL)，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢 測(cè)，顯色，將顯色的部位分別合并，50°C以下減壓濃縮至干，備用。所述0DS的預(yù)處理過程為 甲醇浸泡過24小時(shí)，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動(dòng)相平衡。
[0082] 步驟5:將步驟4中所得各顯色部位經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20柱層析，分別以甲 醇-水(70/30，v/v)等度洗脫，得到新骨架生物堿化合物。經(jīng)超高效液相色譜，歸一法測(cè)定純 度均為90~99%。所述Sephadex LH-20凝膠的預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時(shí)，上柱，用甲 醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動(dòng)相平衡。
[0083]本發(fā)明新骨架生物堿化合物的抗炎作用。
[0084] 1、主要材料。
[0085] 1.1、藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó) Hyc 1 one公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）；LPS (美國(guó)Si gma公司）；IL-6、TNF-α、PGE2 的EL ISA試劑盒(美國(guó)Cayman公司）；細(xì)胞裂解液、Gr i e s s試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司）
[0086] 1 · 2細(xì)胞株:RAW264 · 7巨噬細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）
[0087] 1.3分組:分為對(duì)照組、LPS組和實(shí)驗(yàn)組，各一組。
[0088] 2實(shí)驗(yàn)方法。
[0089] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0090] 2.2MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活力，上述三組分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種 于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1 X 104個(gè)/mL，每孔100yL，溫度37°C，5%C02條件下培養(yǎng)過夜 后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明三種新化合物〇leracimine( 1_50μΜ)或oleracimine A (1-50μΜ)或oleracone Α(1-50μΜ)，孵育lh后向LPS組和實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為lyg/mL的 LPS，另設(shè)調(diào)零組(含DMS0溶媒的培養(yǎng)液），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，考察加入藥物后對(duì)細(xì)胞的影響。 上述各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在各孔細(xì)胞中加入5mg/mL MTT 20yL，溫度37°C，5%C02條件下繼 續(xù)孵育4h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100yL二甲基亞砜(DMS0)，振蕩10min，使細(xì) 胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值。
[0091] 2.3利用格里斯(Griess)法測(cè)定N0的含量，考察本發(fā)明三種新化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的N0產(chǎn)生量的抑制作用。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7傳代后在含10 %胎 牛血清的高糖細(xì)胞培養(yǎng)基D Μ E Μ中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明三種新化合物 oleracimine(l_20yM)或oleracimine Α(1_20μΜ)或oleracone Α(1_20μΜ)，在37°C，5%C〇2 條件下孵育lh后用LPS(終濃度為lyg/mL)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，24h后收集上清液，每組處理重復(fù)3 孔。Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中N0的含量，根據(jù)不同濃度本發(fā)明三種新化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞釋放N0的影響，用以反映 N0水平。
[0092] 2.4ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-6、TNF-a和炎癥介質(zhì)PGE2:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨 噬細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1 X 105個(gè)/mL，每孔lmL，溫度37°C，5%C02條件下培 養(yǎng)過夜，實(shí)驗(yàn)組加入本發(fā)明三種新化合物oleracimine(1_20μΜ)或oleracimine Α(1_20μΜ) 或oleracone Α(1-20μΜ)，培育lh后，在每孔加入LPS(終濃度為lyg/mL)，共孵育24h，每組處 理重復(fù)3孔。ELISA法測(cè)定三種馬齒莧來源新生物堿處理后的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的IL-6、TNF_a和PGE 2的含量。
[0093] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0094]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明三種新化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖無影 響，安全無毒;并可有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7所產(chǎn)生過量炎癥細(xì)胞因子IL-6、 TNF-a和炎癥介質(zhì)NO、PGE2，且呈濃度依賴。
[0095]細(xì)胞相對(duì)存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。
[0096] 表4:本發(fā)明對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞相對(duì)存活率的影響。
[0097]
[0098]
[0099] 注:*P〈0.05與對(duì)照組比較(高濃度組有顯著性差異）。
[0100]利用格里斯(Griess)法測(cè)定N0的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
[0101] 表5:本發(fā)明對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放N0的影響（均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，η = 3)。
[0102]
[0104] 注:*P〈0 · 05與對(duì)照組比較，#P〈0 · 05與LPS組比較。
[0105] ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-6、TNF_a和炎癥介質(zhì)PGE2結(jié)果如表6所示。
[0106] 表6:本發(fā)明對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-a和PGE2含量的影響（均 數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3)。
[0107]
[0109] 注，P〈0 · 05與對(duì)照組比較，#P〈0 · 05與LPS組比較。
[0110] 本發(fā)明新骨架生物堿化合物的鎮(zhèn)痛作用。
[0111] 1主要藥品和試劑。
[0112] 實(shí)驗(yàn)所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為99%，精密稱取，用生理鹽 水稀釋至下述各劑量組所需溶液。致痛劑為〇 . 6 %乙酸，用生理鹽水配制。鹽酸嗎啡注射液 (沈陽(yáng)第一制藥廠），用生理鹽水稀釋至下述劑量溶液。
[0113] 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0114] 昆明種雄性小鼠，體重為20±2g，清潔級(jí)，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室 溫20~25°C，自由飲食，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周后用于實(shí)驗(yàn)。
[0115] 3實(shí)驗(yàn)方法。
[0116] 取健康小鼠，雌雄各半，共150只小鼠，體重20±2g，隨機(jī)分為三組空白對(duì)照組、九 組實(shí)驗(yàn)組(分別為本發(fā)明三種新骨架生物堿化合物高劑量組(2mg/kg)、本發(fā)三種明新骨架 生物堿化合物中劑量組（lmg/kg)、本發(fā)明三種新骨架生物堿化合物低劑量組(0.5mg/kg)、、 三組陽(yáng)性藥組(5mg/kg)共計(jì)組十五，每組10只。
[0117] 各組小鼠灌胃給予受試藥物，每日兩次，連續(xù)給藥3天?？瞻讓?duì)照組給予等體積的 生理鹽水，陽(yáng)性藥組給予鹽酸嗎啡注射液。末次給藥1小時(shí)后，各組小鼠腹腔注射0.6%乙酸 (0. lmL/10g體重），觀察30分鐘內(nèi)各組小鼠扭體出現(xiàn)時(shí)間、扭體次數(shù)、扭體結(jié)束時(shí)間，與空白 對(duì)照組比較計(jì)算各組鎮(zhèn)痛抑制率。按下式計(jì)算鎮(zhèn)痛抑制率，對(duì)各組小鼠扭體次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，P<〇. 05為有顯著差異。
[0118] 抑制率％ =(空白對(duì)照組平均扭體數(shù)一給藥組平均扭體數(shù))/空白對(duì)照組平均扭體 數(shù) X100%〇
[0119] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0120]空白對(duì)照組小鼠腹腔注射乙酸后表現(xiàn)為顯著的扭體次數(shù)多，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疼痛反 應(yīng);與空白對(duì)照組比較，中、高劑量組及陽(yáng)性藥組扭體次數(shù)及扭體結(jié)束時(shí)間均有減少趨勢(shì)， 本發(fā)明新骨架生物堿化合物高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽(yáng)性藥組潛伏期均有不同程 度延長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果表明本發(fā)明新骨架生物堿化合物對(duì)乙酸致小鼠扭體反應(yīng)有一定的鎮(zhèn)痛作 用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。
[0?21 ]表7:本發(fā)明對(duì)乙酸致扭體反應(yīng)小鼠的鎮(zhèn)痛作用影響(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差，η = 10)。
[0122]
[0123 ] 注:*P〈〇 · 05廣P〈0 · 01廣*P〈0 · 001與空白對(duì)照組比較。
[0124] 本發(fā)明新骨架生物堿化合物的抗腫瘤作用。
[0125] i主要材料。
[0126] 1.1藥品和試劑：實(shí)驗(yàn)所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó) Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）；
[0127] 1.2細(xì)胞株:人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺 腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人類 口腔表皮樣癌細(xì)胞KB (中科院上海細(xì)胞庫(kù)）。
[0128] 1.3分組:分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和調(diào)零組(含DMS0溶媒的培養(yǎng)液）。
[0129] 2實(shí)驗(yàn)方法。
[0130] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0131 ] 2.2MTI法檢測(cè)細(xì)胞增殖，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1 X 104個(gè)/mL，每孔100yL，溫度37°C，5%C02條件下培養(yǎng)過夜后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的本發(fā)明 三種新化合物，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥后置于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將含藥培養(yǎng)液 吸去，加入體積比為4:1的無血清培養(yǎng)液和MTT (終質(zhì)量濃度為5mg/mL)共1 OOmL，繼續(xù)孵育 4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMS0 150yL，放于震蕩器上震蕩以使結(jié)晶完全溶解 (5min)，酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的吸光度(A)值。然后，計(jì)算各濃度化合物對(duì)細(xì)胞生 長(zhǎng)的抑制率，抑制率公式:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-A細(xì)fL/A*ML) X 100%，再應(yīng)用SPSS軟件處理 數(shù)據(jù)，將抑制率對(duì)藥物濃度作曲線，計(jì)算IC5〇值。
[0132] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0133] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明三種新化合物對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、 人胃癌細(xì)胞BGC-823、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A1、人肝癌細(xì)胞BEL-7402、人宮頸癌細(xì)胞Hela-229、 卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細(xì)胞KB、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大， 抑制率也明顯升高，即呈濃度依賴。本發(fā)明三種新化合物對(duì)上述八種腫瘤細(xì)胞IC 5Q值見表8。
[0134] 表8本發(fā)明三種新化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
[0135]
[0136] 綜上所述，本發(fā)明提供三種新骨架生物堿化合物及其提取分離方法，依次采用水 煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱層析、及Sephadex LH-20柱層析，成功的 提取分離出新骨架生物堿化合物，該方法簡(jiǎn)便，快速，環(huán)保，且經(jīng)該方法分離得到的化合物 純度較高，由于所得三種化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，從常用中藥馬齒莧中提取出來，其具有抗 炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤作用，因此本發(fā)明三種新化合物及其鹽和衍生物可以作為天然產(chǎn)物開發(fā)中 藥新藥，具有廣闊的前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子為C18H26N2O 3,命名為 Oleracimine，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。2. -種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子式為C18H24N2O2，命名為 Oleracimine，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。3. -種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子式為C18H28O2,命名為 Oleracone A，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。4. 如權(quán)利要求1至3所述的化合物的提取分離方法，其特征在于，具體步驟為： 步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液過濾，合并濾液直接加熱濃縮，放 涼至室溫，得藥液備用； 步驟2、將步驟1中濃縮液用乙酸乙酯反復(fù)萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙 脂萃取物； 步驟3、將步驟2中乙酸乙脂萃取物經(jīng)硅膠柱層析分離，依次用石油醚-丙酮梯度洗脫得 到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位 經(jīng)減壓濃縮至干，備用； 步驟4、將步驟3中所得物再經(jīng)預(yù)處理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅 膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經(jīng)薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，顯色，將 各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得濃縮物備用； 步驟5、將步驟5中所得各濃縮物經(jīng)預(yù)處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠），分 別以甲醇-水等度洗脫得到來源于馬齒莧新骨架生物堿化合物。5. 如權(quán)利要求1所述提取分離方法，其特征在于，所述步驟1中水煎煮提取兩次，每次煎 煮2小時(shí)，水用量為藥材的8~16倍。6. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于，所述ODS和Sephadex LH-20凝膠的 預(yù)處理過程為甲醇浸泡過24小時(shí)，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動(dòng)相平 衡。7. 如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟2中濃縮液用乙酸乙酯萃 取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積比為10:1。8. 如權(quán)利要求4所述的化合物用于制備抗炎、鎮(zhèn)痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106008502SQ201610398734
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】英錫相, 英哲銘, 張文潔, 李翠玉
【申請(qǐng)人】遼寧中醫(yī)藥大學(xué)