一種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用，提取分離方法包括以下步驟：（1）將山油柑根粉碎，加入乙醇水溶液，進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取，得到萃取液，萃取液回收試劑得總生物堿浸膏；（2）總生物堿浸膏加入大孔樹(shù)脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品；（3）將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化得山油柑堿。本發(fā)明方法具有所得產(chǎn)品含量高，操作簡(jiǎn)單，提率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明方法所制化合物為開(kāi)發(fā)應(yīng)用新一代天然來(lái)源的抗腫瘤藥物開(kāi)拓了新徑。
【專利說(shuō)明】—種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用，具體是涉及一種應(yīng)用高速逆流色譜技術(shù)從山油柑根中分離純化山油柑堿的方法，還涉及山油柑堿在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]山油柑堿(Acronycine),分子式C2tlH19NO3,分子量32L 36,難溶于水，可溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。
[0003]山油甜堿是從蕓香科棺物山油甜Acronychia pedunculata (L.)Miq.根中提取分離的一種生物堿類(lèi)化合物。實(shí)驗(yàn)研究表明，山油柑堿具有能抑制細(xì)胞的有絲分裂和降低吉田腹水瘤細(xì)胞分裂指數(shù)。能影響癌細(xì)胞核酸的生成，顯著降低L615小顯脾中RNA的含量，而對(duì)正常動(dòng)物組織中RNA和DNA的含量無(wú)顯著影響?？箘?dòng)物癌譜較廣，在17種瘤譜中，對(duì)其中12種瘤譜有顯著抑制作用，對(duì)目前臨床使用的化療藥物不敏感的髓性白血病C-1498，漿細(xì)胞骨髓瘤X_5563(接近人體腫瘤)和Shingi癌-115均有抑制作用。
[0004]現(xiàn)有提取山油柑堿的報(bào)道并不多見(jiàn)，市場(chǎng)上也尚未有山油柑堿對(duì)照品的出售，因此提供一種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用則很有必要，可以為其后續(xù)研究提供支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種山油柑堿的提取分離方法與應(yīng)用，本發(fā)明方法制得的山油柑堿質(zhì)量好，純度高。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種山油柑堿的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟:
Cl)提取:將山油柑根粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸20-40min,進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1_2次,得到萃取液；
(2)大孔樹(shù)脂富集:萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹(shù)脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品；
(3)純化:將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系統(tǒng)，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
[0007]步驟(1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
[0008]步驟(1)所述混懸時(shí)間為30min，萃取2次。
[0009]步驟(2)所述萃取液濃縮至密度1.1-1.2g/ml。
[0010]步驟(2)所述大孔樹(shù)脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
[0011]步驟(3)所述氯仿-甲醇-水體積比為(5-9): (15-17): (6_8)。
[0012]本發(fā)明提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提取分離方法制得的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明:該化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，在天然新藥開(kāi)發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0014]本發(fā)明提取分離方法制得的山油柑堿采用MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試。
[0015]試驗(yàn)用細(xì)胞株:
HeLa:人子宮頸癌細(xì)胞株；HEC_1:人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株；T_98和U251-SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；HLE:人肝癌細(xì)胞株和HMV-1:人黑色素瘤細(xì)胞株。
[0016]方法:(1)0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，10%NBS的RPMI 1640調(diào)細(xì)胞濃度50000個(gè)/ml。96孔板10ul/孔。設(shè)溶劑對(duì)照，每組3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空氣的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24h，棄上清。
[0017](2)加藥物5個(gè)10倍稀釋的濃度(溶劑為有二甲亞砜和水)，為10 _4 mol/L。
[0018](3)細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液(以無(wú)血清培養(yǎng)基配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0019](4)吸去上清。加入200μ1 DMS0，輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。
[0020](5)計(jì)算抑制率(%)=(對(duì)照OD-藥物0D) /對(duì)照0D*100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:本發(fā)明化合物的抑制率以相對(duì)于對(duì)照(添加DMS0)的結(jié)果如下表1:
表1山油柑堿的腫瘤細(xì)胞增值抑制率％_ __

【權(quán)利要求】
1.一種山油柑堿的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟: (1)提取:將山油柑根粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸20-40min,進(jìn)行負(fù)壓空化混懸固液萃取1_2次,得到萃取液； (2)大孔樹(shù)脂富集:萃取液回收乙醇得總生物堿浸膏，加入大孔樹(shù)脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集山油柑堿流分，濃縮得山油柑堿粗品； (3)純化:將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系統(tǒng)，ELSD檢測(cè)器監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)流分，回收試劑，真空干燥得產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
3.如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(1)所述混懸時(shí)間為30min，萃取2次。
4.如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(2)所述萃取液濃縮至密度.1.1-1.2g/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(2)所述大孔樹(shù)脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
6.如權(quán)利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟(3)所述氯仿-甲醇-水體積比為(5-9): (15-17): (6-8)。
7.如權(quán)利要求1飛所述提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/4741GK104072503SQ201410266748
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】劉東鋒, 楊成東 申請(qǐng)人:南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司