貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的貝母尼丁的藥物組合物中含有貝母尼丁和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，貝母尼丁、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用；貝母尼丁和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
貝母尼丁的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及貝母尼丁的新用途，具體涉及貝母尼丁的藥物組 合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。 近50年來(lái)許多國(guó)家都報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均 占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完 全明確，大量資料表明，長(zhǎng)期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。已有的研究證明： 長(zhǎng)期大量吸煙者患肺癌的概率是不吸煙者的10~20倍，開始吸煙的年齡越小，患肺癌的幾 率越高。此外，吸煙不僅直接影響本人的身體健康，還對(duì)周圍人群的健康產(chǎn)生不良影響，導(dǎo) 致被動(dòng)吸煙者肺癌患病率明顯增加。
[0003] 迄今為止，尚未見貝母尼丁及其藥物組合物與肺癌的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種貝母尼丁的藥物組合物，該藥物組合物中含有貝母尼 丁和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，貝母尼丁和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療肺癌。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007]
[0008] -種貝母尼丁的藥物組合物，包括貝母尼丁、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥 學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0010] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將夏枯草粉碎，用65~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用6 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 上述貝母尼丁的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明提供的貝母尼丁的藥物組合物中含有貝母尼丁和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn) 物，貝母尼丁和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的 治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019] 分離方法：（a)將夏枯草(3kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(20L X 3次），合并提取 液，濃縮至無(wú)醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體 積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 343.0945，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H18O9，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，acetone_d6，500MHz):H_3a(2 · 17，m)，H-3b(2.35，br，dd，J=14.0,6.4Hz)，H-4a(l .89，m)，H-4b(2.26,dd，J= 13.6，6·0Ηζ)，H-6 (4.24，s)，H-7(4.96，s)，H-10a(1.42，br，d，J=13.6Hz)，H-10b(2.76，br，d，J=13.6Hz)，H-13(1.82，s)，H-14(1.31，s)，OH-9 (6 · 89，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) 5C( ppm，pyridi ne-d5， 125MHz):75.3(Ca-C)，221.9(C，2-C)，25.4(CH2,3-C)，23.7(CH2,4-C)，63.2(C，5-C)，66.5 (CH，6-C)，77.9(CH，7-C)，156.7(C，8-C)，106.8(C，9-C)，52.5(CH2，10_C)，135.7(C，n-C)， 168.9(C，12-C)，9.9(CH 3，13-C)，17.3(CH3，14-C)，172.9(C，15-C)。紅外光譜表明該化合物 含有羥基(3579CHT 1)和內(nèi)酯羰基（1737(31^1)結(jié)構(gòu)。氫譜和碳譜顯示該化合物含有一個(gè)內(nèi)酯 結(jié)構(gòu)[δΗ4.24(lH，s，H-6)，4.96( lH，s，H-7);Sc63.2(C-5)，66.5(C-6)，77.9(C-7)，172.9(C-15)]，一個(gè)〇，0-不飽和丫-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[5。156.7(08)，106.8((：-9)，135.7((：-11)，168.9((：-12)]，一個(gè)縮醛碳^106.8(〇9)]，一個(gè)乙烯基甲基^1.82(3!1，8，!1-13)]以及一個(gè)甲基[6 h1.31(3H，s，H-14)]。綜合高分辨以及核磁共振譜數(shù)據(jù)，可以推斷出該化合物可能是一個(gè)倍 半萜類化合物。查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該化合物和已知化合物Villosine具有相似的結(jié)構(gòu)。比較兩 者核磁數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)化合物只是在C-1和C-2以及C-5和C-6位存在一定的區(qū)別。在該化 合物的HMBC譜中，可以通過H 2-3與C-1，H2-10與C-2以及H3-14與C-2的相關(guān)性證明該化合物 的C-1連有羥基，而C-2位是一個(gè)羰基。此外，H-6與C-5，H 2-4與C-5和C-6之間的相關(guān)信號(hào)說 明在化合物Villosine中C-5和C-6的三元氧環(huán)開環(huán)。至此我們將該化合物的平面結(jié)構(gòu)解析 出來(lái)。N0ESY譜中缺少H-6與H-7的相關(guān)性，以及在 1H-匪R譜中兩者沒有耦合常數(shù)，表明兩者 不在同一側(cè)。通過單晶X射線衍射法可知該化合物的相對(duì)構(gòu)型為1S，5R，6R，7R，9S。綜合氫 譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所 示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過E⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值一致。
[0021] 該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0022]
[0023] 實(shí)施例2:藥理作用
[0024] 本實(shí)施例使用右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞建立lewis肺癌小鼠模型，測(cè)定各組的 抑瘤率和Bcl-2及Bax表達(dá)水平，觀察藥物上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái) 抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤作用。
[0025] 1、材料與方法
[0026] 1.1動(dòng)物
[0027] C57BL/6純系小鼠，雄性6~8周，（20±2)g，北京維通利華公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
[0028] 1.2試劑與樣品
[0029]貝母尼丁自制并經(jīng)過結(jié)構(gòu)確證?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。兔抗鼠 Bax 單克隆抗體、兔抗鼠 Be 1-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司）、二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，DAB 顯示劑(北京中杉金橋公司）。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研究所提供 并傳代保種;Lewis肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。
[0030] 1.3小鼠分組及模型制備
[0031] C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別為模型對(duì)照組(NS組）、貝母尼丁組、化合物 (I)組、貝母尼丁與化合物（I)組合物組。每只小鼠右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞，建立lewis 肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組:0.9%生理鹽水 0.2mL，連續(xù)10d;貝母尼丁組:40mg/(kg · d)，連續(xù)給藥10d;化合物（I)組:40mg/(kg · d)，連 續(xù)給藥l〇d;貝母尼丁與化合物（I)組合物組:40mg/(kg · d)貝母尼丁+40mg/(kg · d)化合物 (I)，連續(xù)給藥l〇d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。
[0032] 1.5瘤重測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0033]末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。
[0034] 抑瘤率（％ )=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%。 [0035] 1.6Lewis肺癌Bcl_2、Bax表達(dá)變化的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0036]免疫組化法測(cè)定Bcl-2、Bax表達(dá)。瘤塊以石蠟包埋制成4μπι厚的切片，脫蠟、水化 后，3 %Η202滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測(cè)試 劑盒說明書操作。陰性對(duì)照以0.01mol/LPBS(pH=7.4)代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下觀察鹽水 對(duì)照組和各給藥實(shí)驗(yàn)組樣本的免疫組化切片。
[0037]結(jié)果判定:每張切片在5~10個(gè)高倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100~200 個(gè)細(xì)胞，共1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色 為陽(yáng)性染色。Bax在胞衆(zhòng)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性染色。
[0038] 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0039]數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。
[0040] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0041 ] 2.1對(duì)Lewis肺癌模型小鼠實(shí)體瘤的影響
[0042]與模型對(duì)照組比較，貝母尼丁與化合物（I)組合物組瘤重明顯減小(P<0.01)，抑 瘤率明顯增加（p<〇. 01);與模型對(duì)照組比較，貝母尼丁組、化合物（I)組瘤重減小（p< 0.05)，抑瘤率增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0043] 2.2對(duì)Lewis肺癌模型小鼠 Bcl-2及Bax表達(dá)的影響
[0044] 與模型對(duì)照組比較，貝母尼丁與化合物（I)組合物組Bcl-2表達(dá)明顯降低（P< 0.01)，Bax表達(dá)明顯升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，貝母尼丁組、化合物（I)組Bcl-2表 達(dá)降低(P<〇.〇5)，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0045] 表1對(duì)小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長(zhǎng)及Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響(X土s，n = 10)
[0046]
[0047] 肺癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素多階段的復(fù)雜過程，近年來(lái)研究表明，肺癌的發(fā)生 可能是由于細(xì)胞凋亡與增殖失衡造成的。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身的一種主動(dòng)的、生理性死亡 機(jī)制，細(xì)胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2 同一家族，與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì) 胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡 誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素 C等作用抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過抑制細(xì)胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。 Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當(dāng)Bax蛋白大量表達(dá)，并與Bcl-2蛋白形成異 源二聚體時(shí)加速細(xì)胞死亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)程度對(duì)決定細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后存活與否起 關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2過量表達(dá)，細(xì)胞存 活;Bax蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞死亡。
[0048] 結(jié)果表明，貝母尼丁、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用；貝母尼丁和化 合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
[0049] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:包括貝母尼丁、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體 或潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的貝母尼丁的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將夏 枯草粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫 8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的貝母尼丁的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/365GK106008544SQ201610362895
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】田麗華
【申請(qǐng)人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司