一株亞硝酸鹽降解菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株亞硝酸鹽降解菌，該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏名稱Daldinia sp. HYTC?TB2（以下簡稱HYTC?TB2），保藏編號：CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22日。本發(fā)明的亞硝酸鹽降解菌是從土壤中篩選出的，具有較高亞硝酸鹽耐受性及較高降解活性，高效安全，發(fā)揮其在環(huán)境修復(fù)方面的優(yōu)勢，解決水體修復(fù)等問題。CCTCC NO： M 201606720160222
【專利說明】
一株亞硝酸鹽降解菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種亞硝酸鹽降解sp.HYTC-TB2及其在生產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽降解中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]亞硝酸鹽，是氮循環(huán)中無機結(jié)合氮的一種分子形態(tài)，其氮處于中間價態(tài)，酸性條件下具有較強的氧化性，在血液中可將血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而對高等動物體內(nèi)氧的運輸有抑制作用。在體外，用亞硝酸鈉處理人紅細(xì)胞后，會引發(fā)紅細(xì)胞中酶和非酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血紅蛋白失活聚集，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)被氧化，且紅細(xì)胞內(nèi)的主要代謝途徑亦發(fā)生改變。
[0003]自然界可利用生物類群對被污染的環(huán)境，如亞硝酸鹽污染，進(jìn)行自凈化作用。生物體可利用體內(nèi)的亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase，NiR)把亞硝酸鹽還原為一氧化氮或氨。NiR廣泛存在于植物和微生物中，國內(nèi)外的研究者們已經(jīng)從植物、紅藻、細(xì)菌中分離并提純到亞硝酸鹽還原酶。早在 1960ssp.,Neurospora crassa,Pseudomonas
等亞硝酸鹽降解菌就從污水中被分離出來了。但關(guān)于能降解亞硝酸鹽的真菌的研究起步較晚，1995年，Kobayashi，M等首次從真菌JcYzsaritwz; οχτρο??；中分離出NiR，后有多種真菌的Cu-NiRs被報道。
[0004]目前關(guān)于亞硝酸鹽還原酶及亞硝酸鹽降解菌的應(yīng)用主要在生物傳感器、水體修復(fù)、食品保鮮等方面。其中水體養(yǎng)殖中亞硝酸鹽還原酶及亞硝酸鹽降解菌的應(yīng)用比較廣泛，但已報道的該類酶或菌株的適用條件為弱酸性、溫度大于30°C，限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一株亞硝酸鹽降解菌，從土壤中篩選出具有較高亞硝酸鹽耐受性及較高降解活性的真菌新種，高效安全，發(fā)揮在環(huán)境修復(fù)方面的獨特優(yōu)勢，解決水體修復(fù)等問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏名稱sp.HYTC-TB2，保藏編號:CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22日。
[0007]本發(fā)明的亞硝酸鹽降解菌種S/7.HYTC-TB2是從土壤中篩選出的菌；菌種描述:在I3DA培養(yǎng)基上菌落生長較慢，28°C黑暗條件下5 d菌落直徑50?55 mm，菌落邊緣整齊，孢子很少，有香甜味;該菌株在以亞硝酸鈉為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。
[0008]按照常規(guī)方法從漢鄧.HYTC-TB2的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，運用rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列特定引物ITS1/ITS4，通過PCR和測序得到ITS序列；在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)HYTC-TB2與已知飽Daldinia eschscholzii的ITS序列的相似性為97%;結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定它是一株真菌新種，將其歸入炭棒科(iyiariaceae)，命名為Daldinia sp.HYTC-TB2，該菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏名稱/?Jt/ifiia sp.HYTC-TB2，保藏編號:CCTCC M 2016067，保藏日期2016年2月22曰。
[0009]將本發(fā)明的菌株鄧.HYTC-TB2接種于以亞硝酸鈉為唯一氮源的液體培養(yǎng)基中，研究其對培養(yǎng)基中亞硝酸鈉的利用率，結(jié)果表明'Daldinia S/7.HYTC-TB2在以亞硝酸鈉為氮源的液體培養(yǎng)基(pH 7.4)中，在28°C，120 rpm/min條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，其中亞硝酸鈉濃度為I g/L，每天取樣測試亞硝酸鈉含量變化;生長經(jīng)過48 h的延滯期進(jìn)入對數(shù)生長期，60 h后，處于穩(wěn)定生長期，菌株在O?48 h處于亞硝態(tài)氮降解的延滯期;48 h后亞硝態(tài)氮濃度迅速下降，60 h降解率達(dá)99.8%，表明該菌具有較好的亞硝酸鹽降解活性。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點是:真菌新種sp.HYTC-TB2具有產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶活性，用于生產(chǎn)亞硝酸還原酶，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。
【附圖說明】
[0011]圖1為菌種純培養(yǎng)照片。
[0012]圖2為菌種在不同濃度亞硝酸鈉平板培養(yǎng)基上生長照片。
【具體實施方式】
[0013]下面給出具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說明，這些實施例不能理解為是對技術(shù)方案的限制。
[0014]實施例1:菌株的分離篩選
從河邊采污泥土樣，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋10—1、10—2、10—3，分別取各梯度稀釋液0.2ml涂布于以亞硝酸鈉為氮源的查氏培養(yǎng)基(葡萄糖30 g/L,NaNO2 2.5 g/L,MgSO4.7H20
0.5 g/L,KCl 0.5 g/L,FeSO4.7H20 0.01 g/L,K2HPO4 I g/L)平板上，28°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng);待菌落長出后，從菌落中間挑取少量菌絲，再次轉(zhuǎn)接到以亞硝酸鈉為氮源的查氏培養(yǎng)基平板上，直至獲得純培養(yǎng)物，命名為印.HYTC-TB2，保存于PDA斜面上。
[0015]實施例2:真菌S/7.HYTC-TB2的鑒定
1、形態(tài)學(xué)鑒定:菌株的形態(tài)學(xué)初步鑒定依據(jù)《真菌鑒定手冊》;如圖1所示，在PDA培養(yǎng)基上菌落生長較慢，280C黑暗條件下5天菌落直徑50?55 mm，菌落邊緣整齊，孢子很少，有香甜味;該菌株在以亞硝酸鈉為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長，對亞硝酸鈉的耐受性及利用率較高，表明其具有較高的亞硝酸鹽降解活性。
[0016]2、菌株分子生物學(xué)鑒定:菌株的DNA提取、PCR擴增及擴增產(chǎn)物的序列分析:將培養(yǎng)4 d的新鮮菌體作為DNA提取材料，采用尿素提取法提取菌株基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度；以上述提取的總DNA為模板，用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR;PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序;測序結(jié)果如下:
Ittaactcagg acatctaact ccaccctatg tgaacttacc gccgttgcct cggcgggccg cgttcgccct gtagtttact
81acctggcggc gcgctacagg cccgccggtg gactgctaaa ctctgttata tatacgtatc tctgaatgct tcaacttaat
161aagttaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt
241gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccattag tattctagtg ggcatgcctg ttcgagcgtc 321 atttcaaccc ttaagcccct gttgcttagc gttgggaatc taggtctcta gggcctagtt ccccaaagtc atcggcggag 401 tcggagcgta ctctcagcgt agtaatacca ttctcgcttt tgcagtagcc ccggcggctt gccgtaaaac ccttatatct 481 ttagtggttg acctcgaatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tcaaaaggc
在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)Daldinia sp.HYTC-TB2與已知的Daldiniaeschscholzii的ITS序列的相似性為97%；結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，確定它是一株真菌新種，將其歸入炭棒科(Zj^/ariaceae)，命名為j9a_/c/i/3ia sp.HYTC-TB2，該菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏名稱sp.HYTC-TB2，保藏編號:CCTCCM 2016067，保藏日期2016年2月22日。
[0017]實施例S/7.HYTC-TB2在平板上對亞硝酸鈉的耐受性測試:將PaWiflia鄧.HYTC-TB2接種在以亞硝酸鈉為唯一氮源的固體平板上，其中亞硝酸鈉濃度分別為I g/L、5 g/L、10 g/L,30 g/L，結(jié)果表明該菌在亞硝酸鈉濃度為30 g/L的培養(yǎng)基上生長，說明該菌的亞硝酸鈉耐受性較高。
[0018]實施例4、液體培養(yǎng)基中亞硝酸鈉的降解率測試:將二塊印.HYTC-TB2菌餅(直徑為5 mm)接種于200 ml發(fā)酵培養(yǎng)基(配方:葡萄糖30 g/L,NaNO2 I g/L,MgSO4.7H20
0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L^K2HPO4 I g/L)中，28°C，120 rpm，搖床培養(yǎng);每天取樣，利用鹽酸萘乙二胺法檢測亞硝酸鈉的含量。
[0019]亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:分別吸取400 μ1、200 μ1、100 μ1、50 μ1、25 μ? 0.1mmol.L—1 的NaN02溶液，加去離子水至 1000 μ?，則NaN02終濃度為40 ymol.L-1JO ymol.L^aO μπιο?.L—\5 μπιο?.L—\2.5 ymol.L—S每個樣品中分別加入40 μ?濃度的對氨基苯磺酸，混勻避光靜置5 min;然后分別加入20 μ?濃度為0.2%(W/V)的鹽酸萘乙二胺溶液，混勻避光靜置15 min;取200 μ?樣品反應(yīng)液于96孔板中，用酶標(biāo)儀在波長540 nm處測定其吸光值，分別為 1.179075、0.658675、0.360775、0.188475 和 0.101175，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 7 =0.0286χ + 0.0548ο
[0020]將每天取的樣品稀釋到原來的千分之一，用鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明:0-3 d培養(yǎng)基中亞硝酸鈉含量基本未變;第4 d時亞硝酸鈉的利用率為25%，第5 d時亞硝酸鈉的利用率達(dá)到67.5%;第6 d時培養(yǎng)基中的亞硝酸鈉已利用完全；由此表明本發(fā)明的Daldinia sp.HYTC-TB2具有較高的降解亞硝酸鹽的能力。
[0021 ] 實施例5、亞硝酸鹽還原酶活的測定:將二塊印.HYTC-TB2菌餅(直徑為5mm)接種于200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(配方:葡萄糖30 g/L、NaN〇2 I g/L、MgS04.7出0 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、FeS04.7H20 0.01 g/L^K2HPO4 I g/L)中，28°C，120 rpm，搖床培養(yǎng)5 d，過濾收集菌體，并用去離子水漂洗兩次，用PH7.4緩沖液漂洗一次;每克濕菌體加入10 ml于4°C預(yù)冷的緩沖液，冰浴超聲波破碎菌體I h，每超聲5秒停10秒，超聲后取出12 000 rpm離心10 min，取上清即為真菌PaW1ia sp.HYTC-TB2的胞內(nèi)總蛋白樣品液。
[0022]酶催化反應(yīng)體系為250 μ?，先取125 μ I 0.1 mol.L-1 pH 7.4的Tris-Cl緩沖液、15 μ? 0.1 mol.L—1 的 NaCl溶液、12.5 μ? 0.1 mol.L—1 的NaNO2溶液和7.5 μ? 0.1 mol.L一1的甲基紫精溶液于1.5 ml離心管中，混勻，30°C預(yù)熱5 min;再加入50 μ?粗蛋白樣品液，30°C預(yù)熱5 min;加入40 μ? 0.1 mol.L—1 的Na2S2O4溶液(Na2S2O4溶于0.I mol.L—1 的NaHCO3溶液中)，此時酶催化反應(yīng)被啟動，置于30°C水浴鍋中，并計時;分別在O min、30 min取反應(yīng)液10 μ?，加990 yl水，劇烈震蕩至藍(lán)色完全褪去，酶催化反應(yīng)終止;在該條件下，每分鐘降解I μπιο? NaN02所需的酶量定義為I個酶活力單位；用鹽酸萘乙二胺法測定樣品中亞硝酸鈉的含量變化，結(jié)果表明sp.HYTC-TB2發(fā)酵5 d后胞內(nèi)總蛋白亞硝酸鹽還原酶酶活達(dá)到5.6 U/mg總蛋白；由此表明本發(fā)明的真菌漢sp.HYTC-TB2具有產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶活性。
【主權(quán)項】
1.一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是:該亞硝酸鹽降解菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏名稱從sp.HYTC-TB2，保藏編號:CCTCC M2016067，保藏日期2016年2月22日。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是:絲狀真菌PaWifiiasp.HYTC-TB2應(yīng)用在亞硝酸鹽降解中。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是:絲狀真菌PaWifiiasp.HYTC-TB2的胞內(nèi)總蛋白應(yīng)用在亞硝酸鹽降解中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株亞硝酸鹽降解菌，其特征是:絲狀真菌PaWifiiasp.HYTC-TB2的胞內(nèi)總蛋白應(yīng)用在生產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶中。
【文檔編號】C12R1/645GK106010981SQ201610410202
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】汪偉, 周玉珍, 鄢貴龍, 趙利琴, 姜曉劍, 唐玉玲, 王新風(fēng), 紀(jì)麗蓮
【申請人】淮陰師范學(xué)院