一株降解氧氟沙星的蒼白桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株降解氧氟沙星的蒼白桿菌，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，其分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，菌株號(hào)為OF?13，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10539，保藏日期為2015年2月9日。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下該菌株對500ug/L氧氟沙星的降解率達(dá)97.2％，解決了含抗生素廢水對微生物產(chǎn)生抑制而影響其處理效果的問題。該菌株的菌劑制備工藝簡單，成本低、效率高、無二次污染，具有很好的應(yīng)用前景。CGMCC NO. 1053920150209
【專利說明】
-株降解氧氣沙星的蒼白桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株降解氧氣沙星的蒼白桿菌其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素是指具有水溶性和脂溶性醫(yī)學(xué)特征的一類化學(xué)物質(zhì)，不僅能殺滅細(xì)菌，而 且對霉菌、支原體、衣原體等致病微生物也具有良好的抑制和殺滅作用，可作為治療各種細(xì) 菌感染或W致病微生物感染的藥物而在醫(yī)藥業(yè)得到廣泛使用。通?？股匚廴疚镎魵鈮狠^ 小、疏水性不強(qiáng)，主要存在于水環(huán)境中，水中含有多種難降解的生物毒性物質(zhì)和濃度較高的 活性抗生素，抑制了廢水生化處理中微生物的生長，因此現(xiàn)有的水處理技術(shù)很難將抗生素 徹底清除，一部分抗生素又會(huì)隨著處理后的廢水進(jìn)入水和±壤中。低濃度抗生素的長期存 在對微生物群落有一定的影響，大量研究表明，抗生素的使用能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生一些能夠 抵抗抗生素的病原菌，通常水生系統(tǒng)中每升范圍內(nèi)微克量的抗生素就會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株的增 加，從而破壞了生態(tài)系統(tǒng)的平衡，一旦運(yùn)些耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌，該影響就會(huì)通過食物鏈 對高級生物發(fā)生作用，更增加了對人和動(dòng)物健康的威脅。另外，畜用抗生素也會(huì)通過肉類食 品進(jìn)入人類食物鏈，致使各種肉類及奶制品中抗生素含量常常超標(biāo)，引起人的過敏反應(yīng)，嚴(yán) 重時(shí)甚至?xí)斐墒澄镏卸?，而且部分抗生素藥物可能具有致崎、致癌、致突變作用，?yán)重干 擾了人類各項(xiàng)生理機(jī)能，威脅人類健康。
[0003] 氧氣沙星((FLX)是當(dāng)前廣泛應(yīng)用于臨床的第Ξ代哇諾酬抗生素(氣哇諾酬類）的 代表藥物之一。由于氧氣沙星的哇諾酬環(huán)的穩(wěn)定性和抗水解能力使其成為持久性污染物， 目前已多次在水體中被檢測出來。微生物降解具有成本低、效率高、無二次污染、生態(tài)恢復(fù) 性好等優(yōu)點(diǎn)，已在很多方面得到應(yīng)用，所W篩選出氧氣沙星降解菌對于處理氧氣沙星生產(chǎn) 廢水具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株降解氧氣沙星的蒼白桿菌，具有較高降解 氧氣沙星的性能。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述蒼白桿菌的應(yīng)用，利用微生物的方法來降 解廢水中的污染物，適用于現(xiàn)代廢水處理工藝，使廢水達(dá)標(biāo)排放，同時(shí)降低生產(chǎn)和使用成 本。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] 一株降解氧氣沙星的蒼白桿菌，其分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum SP.)，菌 株號(hào)為0F-13,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（簡稱CGMCC)，地 址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為 CGMCC NO.10539,保藏日期為2015年2月9日。菌株0F-13是發(fā)明人于2015年1月在江蘇省南 京市發(fā)現(xiàn)并篩選得到的，所述的菌株0F-13其主要生物學(xué)特性為革蘭氏陰性，W周生鞭毛運(yùn) 動(dòng)，專性好氧，嚴(yán)格呼吸代謝，氧化酶和接觸酶陽性，不產(chǎn)生嗎I噪，不水解纖維素和屯葉靈。 在添加50mg/L無水贓嗦為底物的情況下，可W很好地降解氧氣沙星。測得菌株的16S rDNA 基因的核巧酸序列長度為1355bp，其基因序列如SEQ ID No:l所示。
[0008] -種固定化微球，將所述的蒼白桿菌固定于微球上。
[0009] 其中，所述的固定化微球按照如下步驟制備得到：
[0010] (1)將菌株0F-13接種于LB液體培養(yǎng)基中于30°C下培養(yǎng)至對數(shù)期；
[0011] (2)將步驟（1)得到的菌液固液分離后去除掉清液，用無菌水洗涂菌體，再用無菌 水重懸菌體；
[0012] (3)將步驟(2)得到的菌體液與含有Fe3化和海藻酸鋼的水溶液混勻，然后用注射器 將混合液滴入常溫下的化C12水溶液，于4°C交聯(lián)巧化化后得到海藻酸巧凝膠固定化微球， 無菌水洗兩遍保存于4°C備用。
[OOU]步驟（1)中，所述的LB培養(yǎng)基配方為:化C1 lO.Og/L，蛋白腺lO.Og/L，酵母粉5.0g/ L，抑7.0。
[0014]步驟(3)中，所述的菌體液與含有Fe3〇4和海藻酸鋼的水溶液的體積比為1:20;其 中，所述的菌體液中，菌體的濃度0D600nm= 1.0，所述的含有Fe3〇4和海藻酸鋼的水溶液中， 化3化的濃度為lOOmg/L，海藻酸鋼的濃度為6wt%。
[001引步驟(3)中，所述的CaCl27jC溶液中，CaCl2的濃度為4wt%。
[0016] 上述蒼白桿菌在降解氧氣沙星中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0017] 上述固定化微球在降解氧氣沙星中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 其中，氧氣沙星存在的環(huán)境優(yōu)選為水體。
[0019]具體的應(yīng)用方法優(yōu)選為:先將固定化小球在廢水中曝氣lOh進(jìn)行活化，活化過程中 水溫28 ± 2 °C，曝氣量在1.化/min，然后在溫度為28 ± 2 °C、pH值為6.8-7.2，添加無水贓嗦使 贓嗦濃度為50mg/L，在氧氣沙星進(jìn)水濃度50化g/L的情況下，每升氧氣沙星廢水采取200ml 的固定化小球來處理，同時(shí)，水力停留時(shí)間為72h，在運(yùn)種情況下氧氣沙星的去除率在90% W上，有較好的去除效果。
[0020] 有益效果:本發(fā)明所述的氧氣沙星降解菌株0F-13能W氧氣沙星和無水贓嗦發(fā)生 共代謝生長。本發(fā)明提供了一種菌株0F-13所制備的固定化小球，實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，固定化小球?qū)?(K)yg/L氧氣沙星的降解率達(dá)到90%W上。該發(fā)明生產(chǎn)的降解菌0F-13 的固定化小球具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，可W降解廢水中的氧氣沙 星，適合在含有氧氣沙星的廢水處理中推廣使用。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身 體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1菌株0F-13菌體結(jié)晶紫染色照片（lOOOx);
[0022] 圖2固定化小球?qū)ρ鯕馍承墙到馊コ孰S時(shí)間變化的示意圖；
[0023] 圖3為固定化小球?qū)ρ鯕馍承遣煌M(jìn)水濃度的降解去除率。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0025]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。 [00%]實(shí)施例1:氧氣沙星降解菌株0F-13的分離和鑒定。
[0027]取氧氣沙星富集菌液1.0ml，加入9.0ml無菌水中，充分混勻配成1〇-1的富集液，再 吸取1.0ml配好的10^1的富集液加入9.0ml無菌水中，充分混勻配成10-2的富集液，W此類 推，對富集液進(jìn)行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含500ug/L氧氣沙星的無機(jī) 鹽固體培養(yǎng)基上，其配方為：每升含1.5g K2冊〇4、0.5g K出P〇4、0.2g MgS〇4.7出0、1.0g 化Cl、1.0g(NH4)2S04,0.05g無水贓嗦，20g瓊脂，pH7.0,30°C培養(yǎng)7天。7天后從W上的無機(jī) 鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于5ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，于8000r/min的條件 下離屯、2min，倒去上清液，加入5ml的無菌水搖勻，仍于SOOOr/min的條件下離屯、2min，按此 方法用無菌水洗兩遍后，加入5ml無菌水懸浮該菌。吸取1ml該菌液加入100ml氧氣沙星濃度 為500ug/l的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，其配方為：每升含1.5g K2HP〇4、0.5g KH2P〇4、0.2g MgS04·7H20、1.0g化Cl、1.0g(NH4)2S04,0.05g無水贓嗦，pH7.0，于160r/min，30°C條件下 振蕩培養(yǎng)72h后，用高效液相色譜測其降解效果。將降解效率較高的一株菌株保存，進(jìn)行后 續(xù)實(shí)驗(yàn)。其菌體革蘭氏染色照片（lOOOx)如圖1所示，鑒定為蒼白桿菌屬(Oc虹obactrum);命 名為:0F-13。主要生物學(xué)特性為革蘭氏陰性，W周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，專性好氧，嚴(yán)格呼吸代謝，氧 化酶和接觸酶陽性，不產(chǎn)生嗎I噪，不水解纖維素和屯葉靈。能W氧氣沙星和無水贓嗦發(fā)生共 代謝生長。如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下游離細(xì)菌和固定化小球?qū)?00ug/L氧氣沙星的 降解率均可達(dá)到90 % W上。
[00%]實(shí)施例2:菌株0F-13制備成固定化小球的方法。
[0029] 1)用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上挑取少量菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中于3(TC，160r/ min條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
[0030] 2)將上述培養(yǎng)好的菌液于1000化/min的條件下離屯、2min，倒掉上清液，加入相同 體積的無菌水，搖勻后1000化/min離屯、2min，如此洗兩遍，用相同體積的無菌水懸浮，制成 菌體液。
[0031] 3)取1ml菌體液與20ml含有l(wèi)OOmg/L納米Fe3〇4的6%海藻酸鋼溶液于常溫混勻，然 后用注射器將混合液滴入常溫下的4%化C12溶液，于4°C交聯(lián)巧化化后得到海藻酸巧凝膠 固定化小球，無菌水洗兩遍保存于4 °C備用。
[0032] 步驟1)中所述的LB培養(yǎng)基為：NaCl 10 . Og/L，蛋白腺10 . Og/L，酵母粉5 . Og/L， 抑 7.0。
[0033] 實(shí)施例3:固定化小球在氧氣沙星降解中的應(yīng)用方法。
[0034] 先將固定化小球在廢水中曝氣lOh進(jìn)行活化，活化過程中水溫28±2°C，曝氣量在 1.化/min，然后在溫度為28 ± 2°C、抑值為6.8-7.2，添加無水贓嗦使贓嗦濃度為50mg/L，在 氧氣沙星進(jìn)水濃度50化g/L的情況下，每升氧氣沙星廢水采取200ml的實(shí)施例2所制備的固 定化小球來處理，同時(shí)，水力停留時(shí)間為72h，如圖2所示，在運(yùn)種情況下氧氣沙星的去除率 在90% W上，有較好的去除效果;而圖3顯示了對于不同進(jìn)水濃度的氧氣沙星的去除情況， 研究表明，氧氣沙星的去除率隨著進(jìn)水濃度的升高而降低，當(dāng)進(jìn)水的氧氣沙星濃度在低于 2000yg/L的范圍內(nèi)時(shí)，氧氣沙星都有較高的去除率，可W達(dá)到70%W上。
[0035] 通過W上實(shí)驗(yàn)可W看出，在溫度為28 ± 2°C、pH值為7.0左右，添加無水贓嗦使贓嗦 濃度為50mg/L，水力停留時(shí)間為7化的條件下，500~2000yg/L的氧氣沙星廢水采取200ml/L 的固定化微生物小球來處理，都有較好的去除效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株降解氧氟沙星的蒼白桿菌，其分類命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum sp.)，菌株 號(hào)為0F-13，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10539,保藏日期為2015年2月9日。2. -種固定化微球，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的蒼白桿菌固定于微球上。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的固定化微球，其特征在于，所述的固定化微球按照如下步驟制 備得到： (1) 將菌株0F-13接種于LB液體培養(yǎng)基中于30 °C下培養(yǎng)至對數(shù)期； (2) 將步驟（1)得到的菌液固液分離后去除掉清液，用無菌水洗滌菌體，再用無菌水重 懸菌體； (3) 將步驟(2)得到的菌體液與含有Fe3〇4和海藻酸鈉的水溶液混勻，然后用注射器將混 合液滴入常溫下的CaCl 2水溶液，于4°C交聯(lián)鈣化8h后得到海藻酸鈣凝膠固定化微球，無菌 水洗兩遍保存于4°C備用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步驟（1)中，所述的LB培養(yǎng)基配方 為:NaCl 10.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，酵母粉 5.0g/L，pH7.0。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步驟（3)中，所述的菌體液與含有 Fe3〇4和海藻酸鈉的水溶液的體積比為1: 20 ;其中，所述的菌體液中，菌體的濃度0D6QQnm =1. 〇，所述的含有Fe3〇4和海藻酸鈉的水溶液中，F(xiàn)e3〇4的濃度為100mg/L，海藻酸鈉的濃度為 6wt% 〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的固定化微球，其特征在于，步驟(3)中，所述的CaCl2水溶液中， CaCl2的濃度為4wt%。7. 權(quán)利要求1所述的蒼白桿菌在降解氧氟沙星中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2所述的固定化微球在降解氧氟沙星中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，氧氟沙星存在的環(huán)境為水體。10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，菌株0F-13能以氧氟沙星和無水哌嗪 發(fā)生共代謝生長。
【文檔編號(hào)】C02F101/38GK106011040SQ201610651094
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月9日
【發(fā)明人】蔡天明, 陳吉菲, 姜燦爛, 丁大虎, 許玲, 許玲一
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)