一株產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽孢桿菌及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)CB?019，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.11950。本發(fā)明的菌株發(fā)酵及制備生化型驅(qū)油劑的方法簡單易行，制備的生化型驅(qū)油劑的環(huán)境適應性好，能保持較高的表界面活力和原油乳化降粘能力；該菌株還能夠降解石油、瓜膠等高分子聚合物，可應用于含油污水、壓裂返排液和含聚廢水處理。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌CB?019在微生物采油和環(huán)境修復領(lǐng)域具有重要的推廣和應用價值。CGMCC No.1195020160104
【專利說明】
-株產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽抱桿菌及其應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，設及一株產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽抱桿菌及其在微 生物采油和環(huán)境修復領(lǐng)域中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物表面活性劑，是微生物在特定條件下代謝產(chǎn)生的具有表面活性的物質(zhì)，依據(jù) 化學組成和微生物來源可分為糖脂、脂膚和脂蛋白、脂肪酸和憐脂、聚合物和全胞表面本身 等五大類。與化學合成的表面活性劑一樣，生物表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)也由兩部分組成，疏 油親水的極性基團和疏水親油的非極性基團。但是與化學表面活性劑相比，生物表面活性 劑有其自身的強大優(yōu)勢，選擇性廣，對環(huán)境友好，分子結(jié)構(gòu)類型多樣，具有許多特殊的官能 團，專一性強，原料在自然界廣泛存在且價廉，發(fā)酵生產(chǎn)是典型的"綠色"工藝等，運是一般 化學合成的表面活性劑難W匹敵的。尤其是脂膚類表面活性劑，常由13~15個碳為主的脂 肪酸鏈和4~17個氨基酸數(shù)不等的膚組成，擁有重要的表面活性，其中主要分為Su計actin (表面活性素）、itu;rin(伊枯草菌素）、fengycin(芬莽素）、lichenysins(地衣素）和 bacillomycin(桿菌霉素)等。生物表面活性劑擁有龐大而復雜的化學結(jié)構(gòu)使得表面活性和 乳化能力更強，因其具有許多獨特的優(yōu)良特性，從而吸引著越來越多的研究者。
[0003] 解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)為革蘭氏陽性芽抱桿菌，好氧 菌，與枯草芽抱桿菌具有很高的親緣性，其生長過程中可W產(chǎn)生一系列低分子量抗生素 W 及抗菌蛋白或多膚等活性代謝產(chǎn)物，具有表面活性，廣譜抗菌活性和抗逆能力，生長速度 快，穩(wěn)定性較好。目前，已報道的解淀粉芽抱桿菌產(chǎn)生脂膚類表面活性物質(zhì)，主要有表面活 性素(Surfactin)、伊枯草菌素（lUirin)和芬莽素(Fengycin)。芽抱桿菌作為工業(yè)生產(chǎn)脂膚 類生物表面活性劑的優(yōu)良菌種，其中報道最多的是枯草芽抱桿菌和地衣芽抱桿菌，有關(guān)解 淀粉芽抱桿菌及其在油井增產(chǎn)和環(huán)境修復等領(lǐng)域的應用報道較少。
[0004] 目前我國大多數(shù)油田已進入高含水期，總體含水率已高達90%，而全國平均采收 率還不到35%，仍然有50% W上的難動原油有待挖潛。因此Ξ次采油有著特別重要的意義， 目前世界上已形成四大技術(shù)系列，即化學驅(qū)、氣驅(qū)、熱力驅(qū)和微生物驅(qū)。微生物驅(qū)油中較為 重要的就是利用微生物及其代謝產(chǎn)生的生物表面活性劑進行驅(qū)油。生物表面活性劑的驅(qū)油 機理主要有W下幾點：降低油水界面張力，從而大大降低或消除地層的毛細管作用，減少了 剝離原油所需的粘附功，提高了洗油效率;乳化原油，表面活性劑體系對原油具有較強的乳 化能力，在水油兩相流動剪切的條件下，能迅速將巖石表面的原油分散、剝離，形成水包油 (0/W)型乳狀液，從而改善油水兩相的流度比，提高波及系數(shù);改變巖石表面的潤濕性(潤濕 反轉(zhuǎn)機理），合適的表面活性劑，可W使原油與巖石間的潤濕接觸角增加，使巖石表面由油 濕性向水濕性轉(zhuǎn)變;提高表面電荷密度，當驅(qū)油表面活性劑為陰離子(或非離子-陰離子型） 表面活性劑時，它們吸附在油滴和巖石表面上，可提高表面的電荷密度，增加油滴與巖石表 面間的靜電斥力，使油滴易被驅(qū)替介質(zhì)帶走，提高了洗油效率;改變原油的流變性，用表面 活性劑水溶液驅(qū)油時，一部分表面活性劑溶入油中，吸附在漸青質(zhì)點上，可W增強其溶劑化 外殼的牢固性，減弱漸青質(zhì)點間的相互作用，削弱原油中大分子的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而降低原油 的極限動剪切應力，提高采收率。
[0005] 近年來，隨著石油行業(yè)的快速發(fā)展，原油開采過程中產(chǎn)生的油田污水和含油固廢 已成為主要的工業(yè)污染源之一。目前油田污水基本可W分為水驅(qū)的含油污水和聚驅(qū)的含聚 污水。含油污水和含聚廢水已經(jīng)嚴重影響了周圍±壤、農(nóng)作物、生物W及人類的健康，油田 污水的無害化處理將關(guān)系到整個石油行業(yè)的生存與發(fā)展。迄今為止，物理的化學的方法都 已經(jīng)普遍應用于油田污水的處理，但其處理效果比較局限，成本較高，尤其是"水十條"等環(huán) 保法的頒布，迫切需要高效和低成本的處理技術(shù)，國內(nèi)外學者已經(jīng)開始把目光投向了微生 物處理，微生物處理技術(shù)也已經(jīng)成為油田污水處理技術(shù)的研究熱點。含油固廢主要包括鉆 井泥漿和老化油等，其中鉆井泥漿成分復雜，含有懸浮顆粒、重金屬離子、油、化學處理劑、 鹽類等，具有污染物種類多、COD含量高、色度大、可生化性差的特點；老化油含有重質(zhì)化原 油、多種采油措施后的化學殘液、采出液攜帶的礦物質(zhì)、泥沙等，成分非常復雜，具有高膠 質(zhì)、高漸青質(zhì)、高鹽份、高乳化程度、高雜質(zhì)含量等特點。另外，壓裂返排液污染主要來自油 水井的壓裂工藝，壓裂作業(yè)排出的殘余壓裂液中，含有瓜膠、原油及各種添加劑，若不處理 直接排放，將會對周圍環(huán)境造成污染。在油田污水、含油固廢和壓裂返排液污染的處理技術(shù) 中，與傳統(tǒng)物理和化學處理方法相比，生物處理技術(shù)具有作用持久、低成本、環(huán)境友好等優(yōu) 勢，具有廣闊的開發(fā)與應用前景。針對石油、瓜膠和聚合物等難降解的有機物，利用能夠高 效降解運些污染物的優(yōu)良菌種，調(diào)控生態(tài)因子，從而使污染物達到排放標準具有重要的工 業(yè)價值。
[0006] 目前，有關(guān)解淀粉芽抱桿菌及其生物活性產(chǎn)物在微生物采油和環(huán)境修復領(lǐng)域中應 用的相關(guān)報道較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種可通過發(fā)酵生產(chǎn)微生物采油用表面活性素的微生物菌株，并 提供利用該菌株制備生化型驅(qū)油劑的方法和應用。
[0008] 本發(fā)明所提供的生產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽抱桿菌（B a C i 1 1 U S amyloliquefaciens)CB-019是由某油田采出液中篩選獲得的。該菌株已在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱:CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學院微生物研究所，郵編：100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 11950，保藏日期為2016 年1月4日。
[0009] 本發(fā)明的解淀粉芽抱桿菌CB-019的生理生化特征及遺傳學特征如下：
[0010] (1)菌體特征:單個細胞(0.7~0.8) X (2.0~3.0)μπι，著色均勻；芽抱(0.6~0.9) X (1.0~1.5)μπι，楠圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大;在液體培養(yǎng) 基中生長時，常形成皺釀。
[0011] (2)菌落特征:菌落表面粗糖不透明，污白色或微黃色。
[0012] (3)理化性質(zhì):革蘭氏陽性菌，接觸酶和氧化酶反應均為陽性，淀粉水解、解酪素 及水解明膠均為陽性，巧樣酸利用試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陰性。
[001引（4)遺傳學特征：16S rDNA分析，表明其屬于解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amylolique化ciens)相似但又有區(qū)別的類群，定名為CB-019。
[0014] 本發(fā)明還提供利用所述解淀粉芽抱桿菌CB-019制備的生化型驅(qū)油劑，按質(zhì)量百分 比包括如下組分： 解淀粉芽抱桿菌CB-019發(fā)酵液 40~85% 非離子型表面活性劑 0.5~1.0%
[0015] 氣碳表面活性劑 0.001~0.005% 蒸溜水 余量。
[0016] 進一步地，所述的非離子型表面活性劑為烷基酪聚氧乙締酸、脂肪酸二乙醇酷胺 和多元醇脂肪酸脂中的至少一種。
[0017] 進一步地，所述的氣碳表面活性劑為非離子氣碳表面活性劑。
[0018] 本發(fā)明還提供上述生化型驅(qū)油劑的制備方法，包括如下步驟：
[0019] (1)將解淀粉芽抱桿菌CB-019菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，30~37°C培養(yǎng)0.5~ 2d，所述LB固體培養(yǎng)基為瓊脂粉18~20g/L，蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，補水至lL，pH 7.0~8.0;
[0020] (2)將LB固體培養(yǎng)基單菌落接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，在30~37°C、100~30化pm下振 蕩培養(yǎng)1~4d，得種子液，所述種子培養(yǎng)基為：蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，補水至lL，pH 7.0~8.0;
[0021] (3)將種子液按照體積比1:20~50接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30~37°C、100~30化pm 下振蕩培養(yǎng)2~5d，離屯、，得解淀粉芽抱桿菌CB-019發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖10~ 12邑/1，心谷氨酸鋼2~3g/L，酵母粉0.5~lg/L，K2HP〇4 3~4g/L，K此P〇4 1.5~2g/L，F(xiàn)eS〇4 0.005~0.01g/L，MnS〇4 0.005~0.01g/L，MgS〇4 0.01~0.02g/L，CaCl2 0.01~0.02g/L，補 水至lL，pH 7.0~8.0;
[0022] (4)在25~50°C下，根據(jù)質(zhì)量百分比將解淀粉芽抱桿菌CB-019發(fā)酵液、非離子型表 面活性劑、氣碳表面活性劑和蒸饋水混合攬拌40~60min。
[0023] 本發(fā)明還提供解淀粉芽抱桿菌CB-019在含油污水、壓裂返排液和含聚廢水處理中 的應用。所述解淀粉芽抱桿菌CB-019具有降解原油、瓜膠和高分子聚合物的能力。其應用方 向還包括，但不限于，石油工業(yè)領(lǐng)域中的鉆井泥漿處理、老化油及油泥處理、油田有害微生 物抑制（如硫酸鹽還原菌），原油污染的±壤生物處理，W及在食品、醫(yī)藥、造紙、紡織印染、 飼料工業(yè)等領(lǐng)域。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明的解淀粉芽抱桿菌CB-019是一株高產(chǎn)表面活性素的菌株，菌株發(fā)酵及制備 生化型驅(qū)油劑的方法簡單易行，制備的生化型驅(qū)油劑的環(huán)境適應性好，能保持較高的表界 面活力和原油乳化降粘能力；同時解淀粉芽抱桿菌CB-019在油田污水的處理過程中，環(huán)境 敏感性弱，對來水水質(zhì)要求不嚴格，具有高效的原油和瓜膠降解能力，可滿足微生物采油技 術(shù)和環(huán)境修復領(lǐng)域的工程需求。
【附圖說明】
[00%]圖1為菌株CB-019的革蘭氏染色鏡檢圖；
[0027]圖2為菌株CB-019的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[00%]圖3為菌株CB-019發(fā)酵產(chǎn)物的紅外圖譜；
[0029] 圖4為菌株CB-019發(fā)酵產(chǎn)物的核磁共振圖譜；
[0030] 圖5為菌株CB-019的排油圈；
[0031 ]圖6為菌株CB-019降解原油前后的氣相色譜對比圖；
[0032] 圖7為菌株CB-019降解瓜膠水解圈。
【具體實施方式】
[0033] 下屬非限制性實施例可W使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不W 任何方式限制本發(fā)明。另外，下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方 法，所用材料、試劑等均可從生物或化學試劑公司購買。
[0034] 下述實施例采用的培養(yǎng)基及其組成如下：
[00巧]LB固體培養(yǎng)基：瓊脂粉18~20g/L，蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~ lOg/L，補水至lL，pH 7.0~8.0;
[0036] 種子培養(yǎng)基:蛋白腺8~lOg/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~lOg/L，補水至lL，pH 7.0 ~8.0;
[0037] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10~12旨凡心谷氨酸鋼2~3g/L，酵母粉0.5~lg/L，K2HP〇4 3 ~4g/L，K出P〇4 1.5~2g/L，F(xiàn)eS〇4 0.005~0.01g/L，MnS〇4 0.005~0.01g/L，MgS〇4 0.01~ 0.02g/L，CaCl2 0.01 ~0.02g/L，補水至lL，pH 7.0~8.0。
[0038] 實施例1菌株CB-019的篩選及鑒定
[0039] 1.菌株CB-019的分離
[0040] (1)樣品來源:某油田采出液。
[0041] (2)菌株初篩:將樣品用無菌水按濃度梯度稀釋至10-3~10-8,取O.lmL均勻涂布于 血平板培養(yǎng)基上，放于37Γ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將有溶血圈的菌落轉(zhuǎn)接至新鮮的血平板上，劃線 純化后接種至斜面培養(yǎng)基中，4Γ保存，備用。
[0042] (3)菌株復篩:將保存的菌種接種至LB培養(yǎng)基中，37°C、160巧m振蕩培養(yǎng)2地，再W 1:50的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 °C下、16化pm振蕩培養(yǎng)30~36h。取上述發(fā)酵液30血， 500化/min條件下離屯、后測定上清液的表面張力。其中表面張力值最低（29.35mN/m)的菌 株，編號為CB-019。
[0043] 2.菌株CB-019的鑒定
[0044] (1)菌體特征:單個細胞(0.7~0.8) X (2.0~3.0)μπι，著色均勻；芽抱(0.6~0.9) X (1.0~1.5)μπι，楠圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽抱形成后菌體不膨大;在液體培養(yǎng) 基中生長時，常形成皺釀。
[0045] (2)菌落特征:菌落表面粗糖不透明，污白色或微黃色。
[0046] (3)理化性質(zhì):革蘭氏陽性菌(革蘭氏染色鏡檢如圖1所示），接觸酶和氧化酶反應 均為陽性;淀粉水解、水解酪素及水解明膠均為陽性;巧樣酸利用試驗呈陽性；甲基紅試驗 呈陰性。
[0047] ( 4)遺傳學特征：16S rDNA分析，表明其屬于解淀粉芽抱桿菌（Baci 1 lus amyloliquefaciens)相似但又有區(qū)別的類群，定名為CB-019,被分類于解淀粉芽抱桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中屯、保藏，保藏號為CGMCC No. 11950，保藏日期為2016年1月4日。菌株CB-019的16S rDNA序 列具體可見序列表，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。
[004引實施例2菌株CB-019的發(fā)酵產(chǎn)物提取及鑒定
[0049] 菌株CB-019的發(fā)酵:將解淀粉芽抱桿菌CB-019菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，在35 °C培養(yǎng)Id,將單菌落接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，在35°C、15化pm下振蕩培養(yǎng)2d，成為種子液，種子 液按照體積比1:20接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35°C、150巧m下振蕩培養(yǎng)3d，離屯、，得發(fā)酵液。
[0050] 發(fā)酵液采用酸沉淀法提取CB-019中的發(fā)酵產(chǎn)物:將發(fā)酵液離屯、去除菌體，調(diào)節(jié)上 清液抑為2.0，靜置過夜，離屯、收集沉淀，沉淀用抑2.0鹽酸洗涂，用化肥化粉末調(diào)節(jié)鹽酸洗 涂液至pH 8.0,加入氯仿甲醇(3:1)混合物作萃取劑，保留水相，冷凍干燥后得發(fā)酵產(chǎn)物。
[0051] 分別采用巧Ξ酬顯色反應、紅外圖譜和核磁圖譜對發(fā)酵產(chǎn)物進行鑒定。
[0052] 巧Ξ酬顯色反應為紫色，說明菌株CB-019的發(fā)酵產(chǎn)物含有膚類物質(zhì)；紅外圖譜的 ii定結(jié)果如圖3所示，由圖可知，3410cnfi處的吸收帶為N-H、〇-H鍵伸縮振動吸收。2928cnfi、 2859cnfi為脂肪族碳鏈上的C-H鍵伸縮振動的吸收帶，1468cm-i和1390cm-i為碳鏈上C-H的彎 曲振動吸收帶，說明存在碳鏈結(jié)構(gòu)。在1658cm-i和1545cm-i處是酷胺譜帶I和II，說明CB-019 發(fā)酵產(chǎn)物分子中存在膚鍵；1240cm-i是C-0-C鍵的吸收峰，說明物質(zhì)中有醋基結(jié)構(gòu);Η-醒R核 磁共振圖譜的測定結(jié)果如圖4所示，由圖可知，化學位移0.5~1.25的峰，可W推斷含有燒控 鏈，且峰面積較大，說明存在長鏈脂肪酸，化學位移4.6的峰，可W推斷締控的存在。
[0053] 綜合巧Ξ酬顯色反應、紅外光譜和核磁圖譜的分析結(jié)果，推斷出CB-019的表面活 性產(chǎn)物具有表面活性素的結(jié)構(gòu)特征，CB-019發(fā)酵產(chǎn)物為表面活性素。
[0054] 實施例3菌株CB-019生物活性物質(zhì)性能測定
[0055] 采用實施例2得到的菌株CB-019的發(fā)酵液進行如下的測定。
[0056] 1.乳化性能測定
[0057] (1)發(fā)酵液排油圈測定:〇.5g蘇丹紅虹加入到lOOmL液體石蠟中，將液體石蠟染色， 過濾后備用。將8mL染色后的液體石蠟加入到裝有60mL蒸饋水的9cm平皿中，平皿表面形成 一層均勻分散的染色后的液體石蠟薄膜后，在油膜中屯、慢慢滴入菌株CB-019發(fā)酵液ImL，觀 察排油圈大小，結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明CB-019能產(chǎn)生較大排油圈，直徑約5~6cm。
[0058] (2)煤油和液體石蠟乳化率:取煤油和液體石蠟各5mL，在刻度試管內(nèi)分別與等體 積的菌株CB-019發(fā)酵液混合，縱滿振蕩器震蕩Imin，混合后靜置，5min后觀察起泡層高度， 結(jié)果表明CB-019對煤油乳化率可達72%，對液體石蠟乳化率可達55%。
[0059] (3)原油乳化測定:發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入10%的4種原油樣品，接入CB-019種子 液，接種量為1:10，在35 °C、150rpm培養(yǎng)3d后，觀察原油變化。結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明CB- 019對原油具有較好的乳化效果。
[0060] 表1菌株CB-019的原油乳化性能
[0061]
[0062] 2.環(huán)境適應性
[0063] (1)耐溫適應性:將CB-019種子液按照體積比1:10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，置于不同溫 度下培養(yǎng)2地，測定發(fā)酵液表面張力。結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明菌株CB-019可在溫度為25~ 45°C的范圍內(nèi)生長，并產(chǎn)生生物表面活性劑，35°C下代謝產(chǎn)物活性最高，表面張力最低，可 達 27.aiiN/m。
[0064] 表2菌株CB-019的耐溫適應性
[00 化]
[0066] (2)耐堿適應性:將CB-019種子液接種于不同抑的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)2地，測定發(fā)酵 液表面張力。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明菌株CB-019可在抑為4~9的范圍內(nèi)生長，并產(chǎn)生生 物表面活性劑，抑=6下表面張力最低，可達28.9mN/m。
[0067] 表3菌株CB-019的耐堿適應性 [006引
[0069] ~(3)耐鹽適應性:將CB-019種子液接按照體積比1:10種于由化C1配制的不同礦化 度的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵液表面張力。結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明菌株CB-019可 在礦化度《l〇Xl〇4mg/L的范圍內(nèi)生長，并產(chǎn)生生物表面活性劑。礦化度為5X104mg/L下表 面張力最低，可達27.3mN/m。
[0070] 表4菌株CB-019的耐鹽適應性
[0071]
[0072] 實施例4菌株CB-019原油降解能力測定
[0073] 發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%的原油樣品，高溫高壓滅菌后，接入CB-019種子液，接種量 為10%; 150rpm培養(yǎng)8d后，觀察原油變化，并采用氣相色譜測定CB-019降解原油前后的組分 變化。結(jié)果表明CB-019在接有原油的培養(yǎng)基中能夠生長，且培養(yǎng)基呈淺棟色。圖6為菌株CB- 019 降解原油前后的氣相色譜對比圖 ，結(jié)果表明 CB-019 處理原油樣品前后，原油中各組分明 顯減少，其中碳鏈長度小于11的組分幾乎完全降解，碳鏈長度為11~21的降解情況如表5所 示，CB-019對碳鏈長度為11~21的平均降解率可達42.15 %，說明CB-019對原油中各組分具 有較好的降解能力。
[0074] 表5 CB-019降解原油前后組分含量變化
[0075]
[0076]
[0077] 實施例5生化型驅(qū)油劑的表面張力測定
[0078] 按照如下方法制備生化型驅(qū)油劑，并進行表面張力測定。
[0079] (1)將解淀粉芽抱桿菌CB-019菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，35°C培養(yǎng)Id,所述LB固 體培養(yǎng)基為瓊脂粉18g/L，蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/L，補水至lL，pH 7.0~8.0;
[0080] (2)將LB固體培養(yǎng)基單菌落接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，35Γ、振蕩培養(yǎng)Id,成為種子液， 所述種子培養(yǎng)基為:蛋白腺lOg/L，酵母粉5g/L，NaCl lOg/l，補水至lL，pH 7.0~8.0;
[0081] (3)將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2d，離屯、，得發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡 萄糖 10旨/1，心谷氨酸鋼2g/L，酵母粉lg/L，K2HP〇4 3g/L，K也P〇4 1.5g/L，F(xiàn)eS〇4 O.Olg/L， MnS04 0.01g/L，MgS04 0.02g/L，CaCl20.02g/L，補水至lL，pH7.0~8.0。
[0082] 其中所述的培養(yǎng)條件還包括所述振蕩速率為15化pm;所述種子液與發(fā)酵液培養(yǎng)基 的體積比為1:20。
[0083] 在50°C下，將質(zhì)量百分比為70%的菌株CB-019的發(fā)酵液、0.8%的非離子型表面活 性劑(烷基酪聚氧乙締酸、脂肪酸二乙醇酷胺或多元醇脂肪酸脂中的一種）、〇.002%的非離 子氣碳表面活性劑FC-03(聚氧乙締酸類)混合攬拌50min，分別測定表面張力值。實驗結(jié)果 如表6所示，復配的生化型驅(qū)油劑表面張力值較低，可達25. OmN/m左右，具有較高的降低表 面張力的能力。
[0084] 表6生化型驅(qū)油劑的表面張力測定
[0085]
[0086] 實施例6模擬驅(qū)油試驗
[0087] 按照如下方法進行菌株CB-019發(fā)酵液和生化型驅(qū)油劑的填砂管驅(qū)油試驗。
[008引（1)使用的填砂管長度為30cm，內(nèi)徑為2.5cm，其中1#為對照組為CB-019發(fā)酵液 實驗組，3#為生化型驅(qū)油劑實驗組，實驗用砂為粒徑大小不一的砂粒，人工壓制填實。
[0089] (2)將制備好的砂管通氮氣測定氣相滲透率。
[0090] (3)砂管用模擬配制礦化度為7 X 104mg/L的水抽真空飽和2地，比較飽和地層水前 后的巖屯、質(zhì)量差W確定孔隙體積PV，然后計算孔隙度。
[0091] (4)測定在恒流下整個巖屯、段的壓差，通過達西定律來確定絕對滲透率。
[0092] (5)用采集獲得的原油驅(qū)替巖屯、管中的地層水直至出口產(chǎn)出液含水小于2%，計算 驅(qū)出水體積即原油飽和體積，計算出原始含油飽和度。
[0093] (6)砂管在37°C條件下老化7d。
[0094] (7)1#砂管進行水驅(qū)，水驅(qū)至含水95%。計算水驅(qū)采收率。
[0095] (8)將CB-019發(fā)酵液分別注入其它2根砂管中，37°C條件下解育7d后水驅(qū)，計算采 收率。
[0096] 結(jié)果如表7所示，結(jié)果表明CB-019可使驅(qū)油效率提高14.71%，生化型驅(qū)油劑可使 驅(qū)油效率提高18.86%，表明生化型驅(qū)油劑具有更好的驅(qū)油能力，在提高原油采收率方面具 有很大的潛力。
[0097] 表7菌株CB-019的填砂管試驗結(jié)果 [009引
[0099] 實施例7菌株CB-019處理含油廢水試驗
[0100] 發(fā)酵培養(yǎng)基中接入約500mg/L的原油樣品，高溫高壓滅菌后，接入CB-019種子液， 接種量為10%; 150巧m培養(yǎng)8d后，加入適量的石油酸萃取至發(fā)酵液無色，經(jīng)無水硫酸鋼脫 水，保證萃取液不渾濁，在430nm的波長下比色。結(jié)果如表8所示，結(jié)果表明菌株CB-019能夠 降531.2mg/L的含油廢水降解至171.8mg/L，降解率達67.66 %，菌株CB-019對含油廢水有較 好的處理效果。
[0101] 表8菌株CB-019處理含油污水前后對比
[0102]
[0103] 實施例8菌株CB-019瓜膠降解能力測定
[0104] 1.菌株CB-019降解瓜膠水解圈
[0105] 挑取菌株CB-019單菌落，稀釋平板涂布于含油0.5%瓜膠的固體培養(yǎng)基上，于37°C 下培養(yǎng)4她，往平板中倒入一層艦液，靜置lOmin，觀察菌落和透明水解圈。結(jié)果如圖7所示， 結(jié)果表明能看見明顯降解瓜膠的水解圈，菌株CB-019具有降解瓜膠的能力。
[0106] 2.菌株CB-019降解瓜膠粘度
[0107] 將CB-019種子液接種至裝有5.OmL瓜膠的發(fā)酵培養(yǎng)基中靜置3d，W加蒸饋水作為 對照，分別測定粘度。結(jié)果如表9所示，結(jié)果表明CB-019可將粘度為10.27mPa · S的瓜膠降至 1.62m化· S，對瓜膠的降解率達84.2%，可應用于壓裂返排液的處理。
[0108] 表9菌株CB-019降解瓜膠試驗結(jié)果
[0109]
【主權(quán)項】
1. 一種生產(chǎn)表面活性素的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)CB-〇 19,保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 11950。2. 如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌CB-019在含油污水、壓裂返排液或含聚廢水處 理中的應用。3. -種生化型驅(qū)油劑，其含有解淀粉芽孢桿菌CB-019發(fā)酵液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生化型驅(qū)油劑，其特征在于，按質(zhì)量百分比包括如下組分： 解淀粉芽孢桿菌CB-019發(fā)酵液 40~85% 非離子型表面活性劑 0.5~10% 氟碳表面活性劑 0.00丨~0,005% 蒸懐水 余量。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生化型驅(qū)油劑，其特征在于，所述的非離子型表面活性劑為烷 基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸二乙醇酰胺和多元醇脂肪酸脂中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的生化型驅(qū)油劑，其特征在于，所述的氟碳表面活性劑為非離子 氟碳表面活性劑。7. 如權(quán)利要求4所述的生化型驅(qū)油劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下 步驟： (1) 將解淀粉芽孢桿菌CB-019菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，30~37 °C培養(yǎng)0.5~2d，所 述LB固體培養(yǎng)基為瓊脂粉18~20g/L，蛋白胨8~10g/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~10g/L，補 水至IUpH 7.0~8.0; (2) 將LB固體培養(yǎng)基單菌落接種于種子培養(yǎng)基內(nèi)，在30~37°C、100~300rpm下振蕩培 養(yǎng)1~4d，得種子液，所述種子培養(yǎng)基為:蛋白胨8~10g/L，酵母粉3~5g/L，NaCl 8~10g/L， 補水至IUpH 7.0~8.0; (3) 將種子液按照體積比1: 20~50接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30~37°C、100~300rpm下振 蕩培養(yǎng)2~5d，離心，得解淀粉芽孢桿菌CB-019發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖10~12g/ 1^兒-谷氨酸鈉2~38/1，酵母粉0.5~18/1，1(2冊〇4 3~48/1，腿2?〇4 1.5~28/1^65〇4〇.005 ~0.018/1，]?11504 0.005~0.018/1，]\%5040.01~0.028/1，〇&(：12 0.01~0.028/1，補水至 IUpH 7.0~8.0; (4) 在25~50°C下，按照質(zhì)量百分比將解淀粉芽孢桿菌CB-019發(fā)酵液、非離子型表面活 性劑、氟碳表面活性劑和蒸餾水混合攪拌40~60min。
【文檔編號】C09K8/584GK106011035SQ201610632519
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月4日
【發(fā)明人】趙靜, 韓俊杰
【申請人】大連知微生物科技有限公司