Trim50在食管鱗癌診治中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了TRIM50在食管鱗癌診治中的應用，本發(fā)明采用生物信息學方法對芯片雜交結(jié)果進行分析，食管鱗癌的差異表達基因TRIM50，TRIM50基因在患者中表達下調(diào)，通過上調(diào)TRIM50的表達水平可以抑制食管鱗癌細胞的增殖和增加食管鱗癌細胞的凋亡率。本發(fā)明為精準醫(yī)療的開展提供理論基礎，同時可以為藥物的研發(fā)提供新靶點。
【專利說明】
TRIM50在食管鱗癌診治中的應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，TRIM50在食管鱗癌診治中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌(eso地ageal carcinoma)又叫食道癌，是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤 疾病之一。來自世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on化ncer，lARC)報告顯示，食管癌發(fā)病率位于世界惡性腫瘤排行榜的第八位，其死亡率位 于第六位。據(jù)統(tǒng)計，2008年食管癌的每年新發(fā)病例數(shù)約為48.23萬例，其死亡病例數(shù)為40.68 萬例。中國食管癌的新發(fā)病例和死亡率均位居世界第一位。病理學研究證明，鱗狀上皮來源 的鱗狀細胞癌是食管癌最常見的病理類型，而其他類型較少見。
[0003] 食管癌的分布呈現(xiàn)地域性特征。在世界范圍內(nèi)，伊朗北部穿越中亞共和國到中國 北方，運一區(qū)域被稱為"食管癌地帶"。我國食管癌高發(fā)地區(qū)主要集中在太行山、秦嶺、大別 山W及川北、閩粵、蘇北、新疆和甘肅等地理區(qū)域。中國北方的河南省安陽地區(qū)是食管鱗癌 (esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)高發(fā)地區(qū)之一，也是世界上發(fā)病率最高的 地區(qū)之一。
[0004] 食管鱗癌的發(fā)病原因尚未完全清楚，除了環(huán)境因素外，遺傳因素在食管癌的發(fā)病 中也同樣起著重要作用，掲示食管癌發(fā)病的內(nèi)在遺傳分子機制是一個迫切需要解決的問 題。近年來分子醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，特別是腫瘤臨床分子醫(yī)學的技術(shù)突破，使得腫瘤的早期風 險預測和監(jiān)控成為可能。越來越多的信號分子和通路被確證為抗腫瘤藥物的治療祀點，細 胞毒類抗腫瘤藥物也經(jīng)歷著逐漸轉(zhuǎn)向為非細胞毒類的分子祀向藥物，研究和開發(fā)分子祀向 抗腫瘤藥物成為一種新進展。然而，大多數(shù)分子祀向藥物只能阻斷一個受體，并不能阻斷全 部的信號傳導，治療效果往往不理想。利用分子生物技術(shù)研究和發(fā)現(xiàn)食管鱗癌的特異基因 的功能，分子祀點出發(fā)出發(fā)，對食管鱗癌的治療將具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種食管鱗癌的診斷標記 物-TRIM50基因。
[0006] 本發(fā)明的目的之二，提供一種診斷產(chǎn)品，實現(xiàn)食管鱗癌的早期診斷。
[0007] 本發(fā)明的目的之Ξ，提供一種治療手段和治療藥物，實現(xiàn)食管鱗癌的精準分子治 療。
[000引為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了檢測TRIM50基因表達水平的試劑在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的 應用。
[0010] 進一步，所述TRIM50基因在食管鱗癌患者中表達下調(diào)。
[0011] 進一步，所述產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交、忍片或高 通量測序平臺檢測TRIM50基因的表達水平W診斷食管鱗癌。其中，所述用RT-PCR診斷食管 鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增TRIM50基因的引物;所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌 的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增TRIM50基因的引物;所述用免疫檢測診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包 括:與TRIM50蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與TRIM50 基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片； 其中蛋白忍片包括與TRIM50蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因忍片包括與TRIM50基因的核酸序 列雜交的探針。
[0012] 進一步，所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增TRIM50 基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0013] 本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測食管組織中 TRIM50基因的表達水平來診斷食管鱗癌。
[0014] 進一步，所述產(chǎn)品包括忍片、或試劑盒；其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍 片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。所述基因忍片包括固相載體W 及固定在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測TRIM50基因轉(zhuǎn)錄水平 的針對TRIM50基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的 TRIM50蛋白的特異性抗體;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測TRIM50基因轉(zhuǎn)錄水平的試 劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括TRIM50蛋白的特異性抗體。
[0015] 所述基因檢測試劑盒可用于檢測包括TRIM50基因在內(nèi)的多個基因（例如，與食管 鱗癌相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白免疫檢測試劑盒可用于檢測包括TRIM50蛋白 在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。將食管鱗癌的多個標 志物同時進行檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0016] 在本發(fā)明中，基因忍片可用于檢測包括TRIM50基因在內(nèi)的多個基因（例如，與食管 鱗癌相關(guān)的多個基因）的表達水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括TRIM50蛋白在內(nèi)的多 個蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì)）的表達水平。通過將多個與食管鱗癌的標志 物同時檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0017] 本發(fā)明提供了 TRIM50基因和/或其表達產(chǎn)物的增強劑在制備治療食管鱗癌的藥物 組合物中的應用。
[0018] 進一步，所述增強劑包括增加 TRIM50基因表達、增強TRIM50表達功能、和/或增強 TRIM50表達產(chǎn)物活性的試劑。
[0019] 進一步，所述試劑包括:含有能編碼功能性TRIM50蛋白的核酸的試劑、TRIM50蛋白 的激活劑、含有TRIM50蛋白質(zhì)的試劑。
[0020] 本發(fā)明提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括增加 TRIM50 基因表達、增強TRIM50表達功能、和/或增強TRIM50表達產(chǎn)物活性的試劑。
[0021] 進一步，所述試劑包括但不限于含有能編碼功能性TRIM50蛋白的核酸的試劑、 TRIM50蛋白的激活劑、含有TRIM50蛋白質(zhì)的試劑。
[0022] 其中，所述含有能編碼功能性TRIM50蛋白的核酸的試劑可W是在有利條件下翻譯 成活性形式的TRIM50蛋白的單鏈核酸（如mRNA)或雙鏈核酸（如DNA)，所述的核酸可W連接 在表達載體上或重組到宿主細胞里，只要能編碼成活性TRIM50蛋白，任何一種TRIM50基因 的攜帶方式均可。所述的TRIM50蛋白激活劑是指刺激TRIM50蛋白活性、增加 TRIM50蛋白活 性、促進TRIM50蛋白活性、增強TRIM50蛋白激活、使TRIM50蛋白活性敏感化或上調(diào)TRIM50蛋 白活性的試劑，如去甲基化試劑、TRIM50啟動子和/或增強子特異性的轉(zhuǎn)錄激活劑、TRIM50 蛋白的激動劑(如激活抗體)等。
[0023] 本發(fā)明中，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的其它成分，作為運樣的其它成 分，例如，可W列舉緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，能夠 使用憐酸鹽、甘氨酸，山梨酸，山梨酸鐘，飽和植物脂肪酸的部分甘油醋混合物，水，鹽或電 解質(zhì)例如硫酸鐘、憐酸氨二鋼、憐酸氨鐘、氯化鋼、鋒鹽，膠態(tài)二氧化娃，Ξ娃酸儀，聚乙締化 咯燒酬，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，簇甲基纖維素鋼，聚丙締酸醋，蠟，聚乙締-聚氧丙締 嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作為乳化劑，能夠使用阿拉伯樹膠、海藻酸鋼、西黃巧膠 等。作為懸浮劑，能夠使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸侶、甲基纖維素、簇甲基纖維素、徑甲基 纖維素、月桂基硫酸鋼等。作為穩(wěn)定劑，能夠使用丙二醇、二亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。 作為防腐劑，能夠使用疊氮化鋼、苯扎氯錠、對徑苯甲酸、氯下醇等。本發(fā)明的藥物組合物還 可W包括離子交換劑如抓±，硬脂酸侶，卵憐脂，半乳化藥物遞送系統(tǒng)（S抓DS)例如da-生 育酪聚乙二醇1000班巧酸鹽，在藥物劑型中使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似聚合遞 送基質(zhì)，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可W使用環(huán)糊精例如曰-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、和丫-環(huán) 糊精，或化學修飾的衍生物例如是徑基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-徑基丙基-β-環(huán)糊精、或其 它增溶衍生物來促進本發(fā)明化合物的遞送。本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領域已知的各 種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、隧菌體、病毒等。
[0024] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑，如 含水乳糖或無水乳糖、淀粉、葡萄糖、薦糖、甘露醇、山梨醇、娃酸、微晶纖維素、徑甲基纖維 素鋼、淀粉甘醇酸鋼及其衍生物等。
[0025] 本發(fā)明的藥物組合物還包含界面活性劑、乳化劑、擴散劑、消泡劑等。任何藥學上 或醫(yī)學上可接受的界面活性劑、乳化劑、擴散劑、消泡劑等皆可被使用。
[0026] 本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學上可接受的涂層材料包括(但不限于），快速分解 涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其 他崩散劑。常見快速分解涂層材料包括0PADRY;腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)締酸聚合物、憐徑 丙甲基纖維素苯二甲酸醋、徑丙甲基纖維素乙酸醋、徑丙甲基纖維素班巧酸醋、徑甲乙基纖 維素、乙酷憐苯二甲酸纖維素;增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
[0027] 本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給 藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的膽藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射 給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況 下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的pHW提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定 性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、 鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和煩內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達到目標組織，本發(fā)明所述藥物組合物 可W通過任何途徑給予受體。
[0028] 本發(fā)明藥物組合物可呈無菌注射劑形式，例如無菌可注射水或油懸浮液。該懸浮 液可依據(jù)本領域已知技術(shù)使用合適的分散劑或潤濕劑(例如吐溫80)和懸浮劑來配制。無菌 注射劑還可W是在無毒可非胃腸道給藥用稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例 如在1,3-下二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮艿馁x形劑和溶劑是甘露醇、水、林格氏溶液和等 滲氯化鋼溶液。此外，無菌不揮發(fā)油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。如可使用溫和的不揮發(fā)油， 包括合成的甘油-醋或甘油二醋。脂肪酸例如油酸及其甘油醋衍生物可用于制備注射劑，也 可W使用天然可藥用油例如橄攬油或藍麻油，尤其是其聚氧乙基化變型。運些油溶液或懸 浮液也可W含有長鏈醇稀釋劑或分散劑例如在化armacopeia Helvetica，Ph.化Iv.，中描 述的那些，或類似的醇，或簇甲基纖維素，或通常用于配制可藥用劑型例如乳劑或懸浮劑的 類似分散劑。其它常用表面活性劑例如吐溫或司盤和/或其它常用于制備可藥用固體、液體 或其它劑型的類似乳化劑或生物利用度促進劑也可用于配制的目的。
[0029] 本發(fā)明藥物組合物可任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片 劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于日服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還 加入潤滑劑例如硬脂酸儀。為了 W膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米 淀粉。當口服施用水懸浮液和/或乳液時，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑 和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當時，可 將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包 埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可W用于補充內(nèi)源性的 TRIM50蛋白的缺失或不足，通過提高TRIM50蛋白的表達或增強TRIM50蛋白的功能，從而治 療因 TRIM50蛋白減少導致的食管鱗癌。
[0030] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可W與主 要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可單獨的組合物或與主要 的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可W與其它 治療性化合物同時給藥，而其它劑量可W單獨給藥。在治療過程中，可W根據(jù)癥狀的嚴重程 度、復發(fā)的頻率和治療方案的生理應答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。
[0031] 本發(fā)明所述的藥物組合物也可W脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單 層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種憐脂形成，如膽醬醇、硬脂基胺或憐脂酷膽堿。
[0032] 本發(fā)明藥物組合物可W局部給藥的藥物組合物，可W配制成軟膏、乳膏劑、混懸 劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。
[0033] 本領域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的 任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至 少85%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。
[0034] 在本發(fā)明的上下文中，TRIM50基因表達產(chǎn)物包括人TRIM50蛋白W及TRIM50蛋白的 部分膚。所述TRIM50蛋白的部分膚含有與食管鱗癌病相關(guān)的功能域。
[0035] "TRIM50蛋白"包括TRIM50蛋白W及TRIM50蛋白的任何功能等同物。所述功能等同 物包括TRIM50蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物或其突變體。突變體 包括等位變異體、天然突變體、誘導突變體、其氨基酸序列通過缺失、替代、增加和/或插入 發(fā)生變異的突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人TRIM50的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白 質(zhì)。
[0036] 通常，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領域技 術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插 入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基 酸的保守替換表是本領域公知的。
[0037] 氨基酸序列的修飾可W源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可W人工誘導天然基因產(chǎn) 生。通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是TRIM50蛋白的融合蛋 白。對于與TRIM50蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留TRIM50蛋 白的生物學活性即可。
[0038] 本發(fā)明的藥物組合物可W按藥劑學上有效的量進行給藥，本發(fā)明的用語"藥劑學 上有效的量"指的是W可適用于醫(yī)學治療或預防的合理的受惠/危險比率足W治療或預防 疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對 藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時間、給藥途徑及排出比率、治療時間、與所 使用的本發(fā)明的組合物配合或同時使用的藥物的要素及其它醫(yī)學領域中公知的要素來決 定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨的治療劑進行給藥，或是與其它治療劑 并用地進行給藥，可W與W往的治療劑依次地或同時地進行給藥。此外，可單次或多次地進 行給藥。重要的是，需要對上述要素均加 W考慮，并且W無副作用的最少的量可取得最大效 果的量進行給藥。
[0039] 本領域的技術(shù)人員可考慮使用目的、疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重、性別、既 往病歷，或是作為有效成分使用的物質(zhì)的種類等來決定本發(fā)明的藥物組合物的給藥量。
[0040] 本發(fā)明中"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除 非另有指出，術(shù)語"探針"通常指能通過互補堿基配對與另一多核巧酸(往往稱為"祀多核巧 酸"）結(jié)合的多核巧酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補 性的祀多核巧酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不 限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
[0041] 所述探針具有與祀點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。運里，所謂"互補"， 只要是雜交即可，可W不是完全互補。運些多核巧酸通常相對于該特定的堿基序列具有 80 % W上、優(yōu)選90 % W上、更優(yōu)選95 % W上、特別優(yōu)選100 %的同源性。運些探針可W是DNA， 也可W是RNA，另外，可W為在其一部分或全部中核巧酸通過PNA(Polyamide nucleic acid,膚核酸）、LNA(注冊商標，locked nucleic acid，&ridged Nucleic Acid,交聯(lián)化核 酸）、ENA(注冊商標，2' -0,4' -C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid,甘油核酸）、TNA(T虹eose nucleic acid,蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的 多核巧酸。
[0042] 本發(fā)明中所述TRIM50蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性 抗體(例如雙特異性抗體）、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性。
[0043] 本發(fā)明中"單克隆抗體"指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各 個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此 類變體一般W極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合祀物的多膚序列的抗體， 其中祀物結(jié)合多膚序列是通過包括從眾多多膚序列中選擇單一祀物結(jié)合多膚序列在內(nèi)的 過程得到的。
[0044] 克隆抗體在本發(fā)明中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生 自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分 與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，W及此類 抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性。
[0045] "完整抗體"在本發(fā)明中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及化區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗 體具有功能性Fc區(qū)。
[0046] "抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包 括化b Jab/、F(ab/ )2和Fv片段;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子;及由抗體片段形成的多 特異性抗體。
[0047] 本發(fā)明中檢測TRIM50基因表達產(chǎn)物的抗體，可W選擇適當?shù)墓姆椒▉碇苽洌?如雜交瘤法、重組DNA法、隧菌體法等單克隆抗體的制作方法等。使用結(jié)合有標記物質(zhì)的抗 體時，通過檢測該標記，能夠直接檢測祀點蛋白質(zhì)。作為標記物質(zhì)，只要是能夠與抗體結(jié)合、 能夠檢測的物質(zhì)即可，沒有特別限定，例如，可W為過氧化物酶、β-D-半乳糖巧酶、微過氧化 物酶、辣根過氧化物酶化RP)、異硫氯酸巧光素(FITC)、若丹明異硫氯酸鹽(RITC)、堿性憐酸 酶、生物素及放射性物質(zhì)。另外，除使用結(jié)合有標記物質(zhì)的抗體直接檢測祀點蛋白質(zhì)的方法 W外，也能夠利用使用結(jié)合有標記物質(zhì)的二次抗體、蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)A等間接地檢測祀點 蛋白質(zhì)的方法。
[0048] 本發(fā)明中術(shù)語"治療"指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉(zhuǎn)已存在的癥狀、 病癥、病況或疾病的進展或嚴重性。
[0049] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0050] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 TRIM50與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在食管鱗癌患者中TRIM50 表達下調(diào)，鑒于此，TRIM50有望成為診斷食管鱗癌的分子標志物。
[0051] 本發(fā)明提供了一種食管鱗癌的精準醫(yī)療手段，通過提高患者中TRIM50的表達水 平，從而治愈或緩解患者的癥狀。
【附圖說明】
[0052] 圖1顯示利用QPCR檢測TRIM50基因在食管鱗癌組織中的表達情況；
[0053] 圖2顯示利用QPCR檢測TRIM50基因在食管鱗癌細胞中的表達情況；
[0054] 圖3顯示利用QPCR檢測轉(zhuǎn)染TRIM50基因在食管鱗癌細胞中的轉(zhuǎn)染效率；
[0055] 圖4顯示利用利用軟瓊脂克隆形成實驗檢測TRIM50基因表達對食管鱗癌細胞增殖 能力的影響；
[0056] 圖5顯示利用transwell小室檢測PDILT基因?qū)κ彻荀[癌細胞侵襲的影響。
[0057] 具體的實施方式
[0058] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0059] 實施例1篩選與食管鱗癌相關(guān)的基因標志物
[0060] 1、樣品收集
[0061] 各收集6例周圍食管鱗癌組織和周圍正常食管粘膜組織，患者均知情同意，上述所 有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
[0062] 2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進行操作）
[0063] 取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預冷的研鉢中進行研磨，按照 試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：
[0064] 1)加入 Trizol，室溫放置 5min;
[0065] 2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離屯、管，充分混勻，室溫下放置5-lOmin;
[0066] 3)1200化pm離屯、15min，將上層水相移到另一新的離屯、管中（注意不要吸到兩層水 相之間的蛋白物質(zhì)），加入等體積的-20°C預冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上lOmin;
[0067] 4)12000rpm高速離15min后小屯、棄掉上清液，按lml/mlT;rizol的比例加入75% DEPC乙醇洗涂沉淀(4°C保存），洗涂沉淀物，振蕩混勻，4°C，12000巧m離屯、5min;
[0068] 5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；
[0069] 6)用Nano化OP2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C冰箱。
[0070] 3、逆轉(zhuǎn)錄和標記
[0071] 用Low RNA I叩ut Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用切3 分別標記實驗組和對照組。
[0072] 4、雜交
[0073] 基因忍片采用Aglient公司的人全基因組表達譜忍片，每張忍片包括45015個寡核 巧酸，其中有43376個人基因探針和1639個實驗控制探針。按忍片使用說明書的步驟進行， 溫度在65°C，經(jīng)17h lOr/min滾動雜交，37°C洗片。
[0074] 5、數(shù)據(jù)處理
[00巧]雜交后忍片用Agilent掃描儀掃描，分辨率為5皿，掃描儀自動W100%和10%PMT 各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction進行處 理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應用Bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實驗 組和對照組。差異基因篩選標準:ratio>4為上調(diào)基因，ration《0.25為下調(diào)基因。
[0076] 6、結(jié)果
[0077] 與對照相比，TRIM50基因在食管鱗癌組織中的表達量顯著低于周圍正常食管黏膜 組織中的表達量。
[0078] 實施例2 QPCR測序驗證TRIM50基因的差異表達
[0079] 1、對TRIM50基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式 選擇周圍正常食管粘膜組織和食管鱗癌組織各50例。
[0080] 2、RNA提取步驟同實施例1。
[0081 ] 3、逆轉(zhuǎn)錄：
[0082] 采用25μ1反應體系，每個樣品取化g總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入W下 組分:DEPC水，5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM dNTP，0.1mM 0ΤΤ，30μΜ Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV， 模板RNA。42 °C解育化，72 °C lOmin，短暫離屯、。
[0083] (3)QPCR 擴增檢驗
[0084] 引物設計
[0085] TRIM50基因的引物序列為：
[0086] 正向引物：5'-TGAAGCAGGAGCAGAAAA-3'（沈Q ID N0.3)
[0087] 反向引物：5'-GAAGACATCCGACTCATTG-3'（沈Q ID N0.4)
[008引管家基因 GAPDH的引物序列為：
[0089] 正向引物：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5)
[0090] 反向引物:5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)
[0091] 采用25μ1反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復Ξ次W上W保 證結(jié)果的可靠性。
[0092] 配制W下反應體系：SYBR Green聚合酶鏈式反應體系12.化1，正反向引物(5μΜ) 各化1，模板cDNA2.化1，無酶水8.化1。各項操作均于冰上進行。
[0093] 擴增程序為:95°C10min，（95°C15s，60°C45s)X30個循環(huán)。
[0094] WSYBR Green作為巧光標記物，在Li曲t切cler巧光實時定量PCR儀上進行PCR反 應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ ACT法進行相對定量。
[0095] 3、統(tǒng)計學方法
[0096] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0097] 4、結(jié)果
[0098] 結(jié)果如圖1所示，與周圍正常食管粘膜組織相比，TRIM50基因在食管鱗癌組織中表 達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇. 05)，同RNA-S巧結(jié)果一致。
[0099] 實施例3 TRIM50基因在食管癌細胞系中的差異表達
[0100] 1、細胞培養(yǎng)
[0101] 人食管鱗癌細胞株KYSE 150、KYSE450購自中科院腫瘤研究所，正常食管上皮細胞 株化t-la購自于廣州吉尼歐公司。W含10%胎牛血清和1%ΡΛ的培養(yǎng)基DMEM在37°C、5% C〇2、相對濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25 %含抓ΤΑ的膜蛋白酶常規(guī) 消化傳代。
[0102] 2、RNA 的提取
[0103] 1)膜酶消化貼壁細胞，吹打獲得的細胞經(jīng)離屯、、重懸、清洗后，W1640培養(yǎng)基（10% 小牛血清)重懸。
[0104] 2)將重懸的細胞轉(zhuǎn)移至6孔板(/孔），添加培養(yǎng)基至2ml/孔，輕搖6孔板使細胞均勻 重懸。
[01化]3)細胞貼壁生長4她，去培養(yǎng)基。
[0106] 4)WlmlTrizol試劑裂解細胞，反復吹打6孔板壁，盡量使細胞完全裂解。
[0107] 5)轉(zhuǎn)移細胞裂解液至1.5ml DEPC處理過的EP管中，置于冰上。加入0.2ml氯仿，剩 余操作步驟同組織中RNA提取過程。
[010引 3、逆轉(zhuǎn)錄
[0109] 具體步驟同實施例2.
[0110] 4、統(tǒng)計學方法
[0111] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[om] 5、結(jié)果
[011引結(jié)果如圖2所示，與食管上皮細胞相比，TRIM50基因在食管鱗癌細胞KYSE150、 KYSE450中表達均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。
[0114] 實施例4 TRIM50基因的過表達
[0115] 1、細胞培養(yǎng)
[0116] 人食管鱗癌細胞株KYSE 150、購自中科院腫瘤研究所。W含10%胎牛血清和1%P/ S的培養(yǎng)基DMEM在37 °C、5 % C〇2、相對濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用 0.25 %含邸TA的膜蛋白酶常規(guī)消化傳代。
[0117] 2、TRIM50基因的過表達
[011引 2.1TRIM50基因表達載體的構(gòu)建
[0119] 根據(jù)TRIM50基因的編碼序列（如SEQ ID NO. 1所示)設計擴增引物，引物序列如下：
[0120] 正向引物：5'-CCGAAGCTTGCCACCATGGCTTGGCAGGTGAGC-3'（SEQ ID N0.7)
[0121] 反向引物：5'-CGGCTCGAGCAGCTTGGTGGGCTGCTCG-3'（沈Q ID N0.8)
[0122] 從成人胎腦的cDNA文庫（clontedi公司，貨號：638831)中擴增全長的TRIM50基因 的編碼序列，上述cDNA序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶化ndlll和趾〇1雙酶切后插入到經(jīng)限制性內(nèi)切 酶化ndin和化〇1雙酶切的真核細胞表達載體PCDNA3.1中，連接獲得的重組載體PCDNA3.1- TRIM50用于后續(xù)實驗。
[0123] 2.2 轉(zhuǎn)染
[0124] 將食管鱗癌細胞分為兩組，分別為對照組(轉(zhuǎn)染PCDNA3.1空載體）、和TRIM50過表 達組(轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-TRIM50)。使用脂質(zhì)體2000進行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說明書 的指示進行。PCDNA3.1空載體和PCDNA3.1-TRIM50的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。
[01 巧]2.3RT-PCR 檢測
[0126] 具體步驟同實施例2。
[0127] 3、統(tǒng)計學方法
[0128] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0129] 4、結(jié)果
[0130] 如圖3所示，與轉(zhuǎn)染PCDNA3.1空載體的細胞相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-TRIM50的細胞中 TRIM50的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
[0131] 實施例5 TRIM50基因?qū)κ彻荀[癌細胞調(diào)亡的影響
[0132] 使用流式細胞儀檢測TRIM50基因?qū)毎{(diào)亡的影響。
[0133] 1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。
[0134] 2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。
[0135] 3、步驟
[0136] 細胞轉(zhuǎn)染72h后，使用預冷PBS洗涂細胞，然后用0.25 %膜酶消化細胞，中止消化， 將離屯、收集的細胞使用PBS重懸，將細胞定量為IX 106個/ml,取20化1上述細胞懸液放置到 E卵endorf管中，加入10μ1 Annexin-V-FITC混勻，室溫暗處解育染色15min，上機前5min加 入lOmg/L艦化丙錠(PI)染色扣1。未轉(zhuǎn)染siRNA的細胞分別用Annexin-V-門TC和PI染色用于 標準定量。用FACS流式細胞儀進行雙色巧光細胞流式計數(shù)，觀察調(diào)亡細胞百分比。
[0137] 3、統(tǒng)計學方法
[0138]實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當P<0.05時 具有統(tǒng)計學意義。
[01例 4、結(jié)果：
[0140] 轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-TRIM50組的細胞調(diào)亡率為（16.37±0.003) %，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1 空載 體組的細胞調(diào)亡率為（4.87 ± 0.001) %，上述差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，上述結(jié)果表 明，TRIM50基因的過表達促進食管鱗癌細胞的調(diào)亡。
[0141] 實施例6軟瓊脂克隆形成實驗
[0142] 1、用0.25%膜蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細胞懸 液，離屯、收集細胞沉淀。
[0143] 2、用含20 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5 Xl〇3 個/ml。
[0144] 3、制備兩個濃度分別為1.2%和0.7%的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 °(：水浴中。
[0145] 4、1.2%的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2 X抗生素和20%的小牛血清， 取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于C〇2溫箱中備用。
[0146] 5、在無菌試管中1:1混合0.7 %的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃 度為5X103個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每 個實驗組重復4個樣本。
[0147] 6、待上層瓊脂凝固后，置入37 °C 5 % C〇2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。
[0148] 7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005%的龍膽紫染色90min。把平皿放置 在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細胞克隆數(shù)。
[0149] 8、結(jié)果
[0150] 結(jié)果如圖4所示，與其他組相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-TRIM50的細胞組單細胞克隆集落 形成數(shù)顯著降低。
[0151] 實施例7 Transwell細胞體外侵襲實驗
[0152] 1、向Transwell小室的上孔中加入100μΙ的無血清培養(yǎng)液Matrigel浸泡30min。
[0153] 2、用膜酶消化處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定感染后各組細胞，PBS清洗細胞3次，用含有 10%血清的培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1 X lOVml。
[0154] 3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入細胞懸液200μ1。
[0155] 4、Transwe 11小室的下室中加入600μ1含20 %FBS的DMEM培養(yǎng)液。
[0156] 5、37°C，5%C02 溫箱內(nèi)培養(yǎng) 2地。
[0157] 6、除去上室和下室中的培養(yǎng)液，用棉簽刮除上室中的Ma化igel和存留的細胞，用 PBS清洗2次。
[0158] 7、用1 %結(jié)晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。
[0159] 8、隨機選取4個100倍視野，在顯微鏡下分別計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每種不同類型的細 胞設3個復孔，共重復3次。
[0160] 9、數(shù)據(jù)處理
[0161] 用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示。多個樣 本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<〇.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為顯著差異。
[01創(chuàng) 10、結(jié)果
[0163] 結(jié)果如圖 5 所示，KY 沈 150、pcDNA3.1 空載、PCDNA3.1-TRIM50 組細胞在 transwell 小 室中培養(yǎng)2地后，PCDNA3.1-TRIM50組聚碳酸醋膜下室面的細胞數(shù)顯著減少。
[0164] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 檢測TMM50基因表達水平的試劑在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述TR頂50基因在食管鱗癌患者中表達下 調(diào)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測TRHKO基因的表達水平以診斷食管鱗癌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至 少包括一對特異性擴增TRHKO基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5. -種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測食管組織中TRM50 基因的表達水平來診斷食管鱗癌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。 7. TRIM50基因和/或其表達產(chǎn)物的增強劑在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應 用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述增強劑包括增加 TRIM50基因表達、增 強TR頂50表達功能、和/或增強TR頂50表達產(chǎn)物活性的試劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，所述試劑包括:含有能編碼功能性TRIM50 蛋白的核酸的試劑、TR頂50蛋白的激活劑、含有TRIM50蛋白質(zhì)的試劑。10. -種治療食管鱗癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要求7-9 任一項所述的增強劑。
【文檔編號】A61P35/00GK106011293SQ201610614192
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】楊承剛, 任靜
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司