潮霉素抗性基因及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種潮霉素抗性基因及其應(yīng)用，其解決了潮霉素抗性基因在假絲酵母菌中不能正常表達(dá)，從而不能作為篩選標(biāo)記來(lái)使用的技術(shù)問(wèn)題，其編碼區(qū)核苷酸序列如序列表的序列12和13所示。本發(fā)明同時(shí)提供了其應(yīng)用，可用于假絲酵母菌的基因工程改造。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
潮霉素抗性基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種潮霉素抗性基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在微生物分類(lèi)中，有一類(lèi)酵母菌被稱(chēng)為假絲酵母（Candida)，在分類(lèi)地位上屬于 屬，一般能形成假菌絲、不產(chǎn)生子囊孢子，大多屬于二倍體，即每個(gè)基因都有等位基因，兩個(gè) 等位基因具備同等的生理功能。不少的假絲酵母能利用正烷烴為碳源進(jìn)行石油發(fā)酵脫蠟， 并產(chǎn)生有價(jià)值的產(chǎn)品，在發(fā)酵工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。其中氧化正烷烴能力較強(qiáng)的假絲酵 母，如解脂假絲酵母（C. lipolytica)或熱帶假絲酵母（C. tropicalis)，能夠生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元 酸。有些種類(lèi)可用作飼料酵母；個(gè)別種類(lèi)能引起人或動(dòng)物的疾病。由于假絲酵母在工業(yè)生 物技術(shù)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究?jī)r(jià)值，利用基因工程進(jìn)行菌種改造受到了廣泛關(guān)注。高 效的遺傳操作系統(tǒng)，包括良好的篩選標(biāo)記、有效的轉(zhuǎn)化手段和高效的同源重組方法，是代謝 工程育種的前提。一般情況，可以利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型（如不同的氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型）或抗性 (如不同的耐藥性）作為篩選標(biāo)記。由于菌種、菌株的不同，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特性和 遺傳背景相差較大，抗性標(biāo)記并不一定完全通用，在實(shí)際使用上有一定的限制。特別是，假 絲酵母在密碼子使用方面具有特殊性，將CUG密碼子翻譯成絲氨酸，而其他絕大多數(shù)物種 將該密碼子翻譯為亮氨酸。這就限制了外源抗性基因作為選擇性標(biāo)記在假絲酵母菌種改造 中的使用。另外，在二倍體酵母的基因工程改造中，往往需要幾種抗性聯(lián)合作為篩選標(biāo)記來(lái) 完成對(duì)含有等位基因的靶位點(diǎn)或多個(gè)不同靶位點(diǎn)的基因工程改造，如基因敲除、基因插入、 基因替換、基因表達(dá)增強(qiáng)或減弱等等。
[0003] 潮霉素是來(lái)源于吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)的氨基糖苷類(lèi)抗生 素，分子式為C2(]H37N 3013，含有A、B兩種組分。其中，潮霉素B是一種常用的抗性篩選藥物， 通過(guò)干擾70S核糖體移位，導(dǎo)致錯(cuò)誤翻譯，抑制蛋白合成。其抗性基因表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)蛋 白激酶，通過(guò)磷酸化潮霉素B使其喪失活性，由于在真核和原核生物中潮霉素B篩選假陽(yáng) 性率低，重復(fù)性好，被廣泛使用。大腸桿菌的hph基因就編碼這樣一個(gè)蛋白激酶，能使潮霉 素B喪失活性。最早潮霉素抗性基因hph由科學(xué)家從大腸桿菌里分離獲得，并且作為篩 選標(biāo)記應(yīng)用于釀酒酵母的遺傳操作中（Gene 1983, 25 (2-3): 179-88)，又經(jīng)過(guò)改進(jìn)獲得質(zhì)粒 pAG32 (Yeastl999, 15:1541-53)〇
[0004] 然而由于假絲酵母密碼子系統(tǒng)具有上述的特殊性，未經(jīng)優(yōu)化的潮霉素B抗性基因 (如大腸桿菌的hph基因）在假絲酵母菌中不能正常表達(dá)，從而不能作為篩選標(biāo)記來(lái)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明就了為了解決潮霉素B抗性基因在假絲酵母菌中不能正常表達(dá)，從而不能 作為篩選標(biāo)記來(lái)使用的技術(shù)問(wèn)題，提供一種可以在假絲酵母菌中正常表達(dá)，從而可作為篩 選標(biāo)記來(lái)使用的潮霉素抗性基因及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了一種潮霉素抗性基因，其編碼區(qū)核苷酸序列如序列表的序列12所 不。
[0007] 優(yōu)選地，潮霉素抗性基因，其編碼區(qū)核苷酸序列符合假絲酵母屬的密碼子編碼系 統(tǒng)。
[0008] 本發(fā)明同時(shí)提供一種潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如序列表的序列13所示。
[0009] 本發(fā)明還提供潮霉素抗性基因在假絲酵母菌基因工程改造中的應(yīng)用。
[0010] 優(yōu)選地，本發(fā)明在對(duì)假絲酵母菌基因工程改造中，對(duì)靶位點(diǎn)等位基因之一進(jìn)行敲 除；基因敲除的靶位點(diǎn)為酯酰輔酶A合成酶基因，該基因的等位基因分別為如序列表14所 示的 CandidaA00308 和序列表 15 所示的 Candida01833。
[0011] 本發(fā)明提供一種潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件的構(gòu)建方法，通過(guò)分子生物學(xué)方法在該 基因的前后分別加上啟動(dòng)子和終止子序列，其包括如下步驟：（1)準(zhǔn)備引物PI、P2、P3、P4、 P5、P6 ; (2)使用步驟一中的引物分別擴(kuò)增啟動(dòng)子、優(yōu)化的潮霉素抗性基因片段及終止子； (3)步驟1中的P1和P6為引物，步驟2中的PCR產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增完整的潮霉素抗性篩選 標(biāo)記元件；(4)將步驟3中獲得的潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件進(jìn)行末端加A反應(yīng)；（5)將步驟 4中獲得的片段與PMD-18T載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性 克隆通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，制備質(zhì)粒，保存?zhèn)溆?。本發(fā)明獲得的質(zhì)粒含有優(yōu)化的潮霉素抗性基因篩 選標(biāo)記元件。
[0012] 本發(fā)明同時(shí)提供一種通過(guò)雙交換同源重組對(duì)假絲酵母菌進(jìn)行基因工程改造的方 法，其包括如下步驟：（1)準(zhǔn)備引物ACS-hph-F和ACS-hph-R ; (2)準(zhǔn)備假絲酵母菌感受態(tài)細(xì) 胞；⑶使用步驟⑴中的引物進(jìn)行擴(kuò)增HygB抗性基因，利用擴(kuò)增的產(chǎn)物對(duì)菌種中的靶位 點(diǎn)等位基因之一進(jìn)行敲除；（4)通過(guò)PCR擴(kuò)增、純化、電轉(zhuǎn)、篩選、鑒定，得到基因工程改造后 的新菌株。
[0013] 本發(fā)明提供的假絲酵母菌基因工程改造方法中，所使用的菌株為假絲酵母Candia sp.(參見(jiàn)《微生物學(xué)報(bào)》1980,20(1):88-93,正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈混合二羧酸，可從中國(guó)科 學(xué)院微生物研究所購(gòu)買(mǎi)）。
[0014] 總體上，由于假絲酵母密碼子系統(tǒng)的特殊性，天然的潮霉素抗性基因本身不能直 接應(yīng)用于假絲酵母菌的基因工程操作。本發(fā)明提供了一種解決方法，解決了這個(gè)問(wèn)題。具 體地講，潮霉素抗性基因序列經(jīng)優(yōu)化并人工合成后，再經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)組裝加上啟動(dòng)子和 終止子元件，從而得以在假絲酵母體內(nèi)中進(jìn)行功能性表達(dá)，使得假絲酵母能在含潮霉素的 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因而，本發(fā)明優(yōu)化后的潮霉素抗性基因可以作為篩選標(biāo)記用于基因工程操 作中，實(shí)現(xiàn)對(duì)假絲酵母的菌種改造，如基因敲除、基因插入、基因替換、基因表達(dá)增強(qiáng)或減弱 等等。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為本發(fā)明涉及到的潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件得構(gòu)建流程圖；
[0016] 圖2為本發(fā)明涉及到的潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件構(gòu)建過(guò)程中的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳 圖；
[0017] 圖3為本發(fā)明涉及到的基因敲除流程圖；
[0018] 圖4為本發(fā)明涉及到的利用潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件進(jìn)行ACS基因敲除結(jié)果示意 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0020] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021] 本發(fā)明中，序列表中序列名稱(chēng)如下：序列1 :引物P1 ;序列2 :引物P2 ;序列3 :弓丨 物P3 ;序列4 :引物P4 ;序列5 :引物P5 ;序列6 :引物P6 ;序列7 :引物ACS-hph-F ;序列 8 :引物ACS-hph-R;序列9 :引物ACS-U ;序列10 :引物ACS-D ;序列11 :大腸桿菌潮霉素 抗性基因hph編碼區(qū)核苷酸序列；序列12 :優(yōu)化后的潮霉素抗性基因hph編碼區(qū)核苷酸 序列；序列13 :帶有啟動(dòng)子和終止子的潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件的核苷酸序列；序列14 : CandidaA00308 ;序列 15 :Candida01833〇
[0022] 以下實(shí)施例中使用了下面所列的培養(yǎng)基：
[0023] 1、YPD培養(yǎng)基，其配方為：1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固體培養(yǎng)基， 加入2%瓊脂粉。上述百分比為質(zhì)量體積百分比，即每100毫升培養(yǎng)基所需該組分的克數(shù)。 若要添加抗生素，液體培養(yǎng)基在使用時(shí)加入至相應(yīng)終濃度。固體培養(yǎng)基在高壓滅菌后冷卻 至50攝氏度左右時(shí)，加入抗生素至相應(yīng)終濃度，混勻后立刻倒如無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，待凝固 后倒置，放于4攝氏度冰箱，兩周內(nèi)使用。
[0024] 2、LB培養(yǎng)基，其配方為：0. 5%的酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl，若制固體培養(yǎng)基， 加入1%瓊脂粉。121°C滅菌30分鐘。
[0025] 以下實(shí)施例中使用了下面所列的菌體培養(yǎng)及發(fā)酵液處理方式：
[0026] 1、平板培養(yǎng)：在YH)平板上劃線(xiàn)或涂布后倒置于30°C培養(yǎng)箱內(nèi)，2-3天即可觀察到 大而飽滿(mǎn)的乳白色菌落形成。
[0027] 2、搖床培養(yǎng)：平板上接種單菌落至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接過(guò)來(lái)，30°C 搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速保持在220轉(zhuǎn)/分鐘。
[0028] 實(shí)施例1 :潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件的構(gòu)建
[0029] (1)潮霉素抗性篩選標(biāo)記元件的構(gòu)建流程圖如圖1所示。根據(jù)啟動(dòng)子序列（質(zhì)粒 PAG32的TEF啟動(dòng)子），優(yōu)化合成后的潮霉素抗性基因序列，終止子序列（質(zhì)粒pAG32的TEF 終止子）設(shè)計(jì)引物。弓丨物設(shè)計(jì)：TEF啟動(dòng)子的下游引物P2的右半段是優(yōu)化合成后的潮霉素 抗性基因的上游引物P3的部分序列；P3同理；則P2和P3的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)。同理設(shè) 計(jì)P4和P5引物。
[0030] (2)以質(zhì)粒pAG32為模板，P1和P2為引物1和引物2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到TEF啟 動(dòng)子片段，大小為400bp左右，標(biāo)為PCR產(chǎn)物1。以?xún)?yōu)化合成的潮霉素抗性基因?yàn)槟０?，?P3和P4為引物1和引物2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到潮霉素抗性基因片段，大小約為1050bp，標(biāo)為 PCR產(chǎn)物2。以質(zhì)粒pAG32為模板，P5和P6為引物1和引物2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到TEF終止 子，大小約為274bp，標(biāo)為PCR產(chǎn)物3。結(jié)果見(jiàn)附錄圖2。
[0031] PCR反應(yīng)體系為：
[0032] ]Ox緩沖液 5 Pi 模版 1 P 1 引物1 (10 p M ) 1 il l 引物 2 (10 yM ) 1 il l dNTP (10 mM) 1 p 1 DNA聚合酶（5 U/ tt 1) 0. 25 yl 超純水_40.75 pi ft 50 p 1
[0033] DNA聚合酶是寶生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的 Phusion DNA聚合酶，活性單位均為5U/ y 1 〇
[0034] PCR 程序?yàn)椋?br>[0035] 94°C： 2 min 9'rc 30 s - 55r： 30 s - 30 個(gè)循環(huán) 72〇C 1 min 15 s. - 7:2 "C： 10 min
[0036] (3)以步驟2中的PCR產(chǎn)物1、2、3以1:1:1的比例作為模板，以PI、P6位引物1和 引物2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小約為1660bp的PCR產(chǎn)物4。PCR反應(yīng)體系同步驟2。結(jié)果見(jiàn) 附錄圖2。
[0037] PCR 程序?yàn)椋?br>[0038] 94。。 2 min 9'rc 30 s - 58V 30 s - 30個(gè)循環(huán) 72V 2 min - 72 V 1(3 min
[0039] (4)在步驟3所得的PCR產(chǎn)物4中加入0? 2 y 1 dNTP和0? 3 y 1 ExTaqDNA聚合酶 (5U/ y 1，寶生物公司），72°C保溫反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取5 y 1上述PCR樣品進(jìn)行瓊 脂糖電泳檢測(cè)，證明擴(kuò)增所得的DNA片段大小與預(yù)計(jì)的一樣，而且沒(méi)有雜帶，對(duì)DNA進(jìn)行純 化，利用PCR純化試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
[0040] (5)將步驟4中回收的DNA與pMD-18T載體16°C連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞（全式金公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。其中，熱擊和復(fù)蘇處理后將菌 液與 40 y 1 IPTG (100mM)、15 y lX-gal (20mg/ml)均勻，涂布于 LB 平板（含 100 y g/ml 氨芐 青霉素）上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。挑選藍(lán)色單菌落，接種至lml LB液體培養(yǎng)基（含100 y g/ ml氨芐青霉素），振蕩培養(yǎng)2小時(shí)，用T載體通用引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定結(jié)果如附錄 圖2所示。將PCR驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送公司進(jìn)行sanger法測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，含有啟 動(dòng)子和終止子的潮霉素抗性基因元件獲得了正確構(gòu)建，構(gòu)建過(guò)程中沒(méi)有引入突變。新構(gòu)建 的質(zhì)粒命名為pUC-hph 113。
[0041] 本發(fā)明對(duì)大腸桿菌的潮霉素抗性基因編碼區(qū)序列進(jìn)行了優(yōu)化，使其符合假絲酵母 菌的密碼子系統(tǒng)（參見(jiàn)表1)。其中，優(yōu)化前大腸桿菌hph基因的序列如序列表中序列11所 示，優(yōu)化后的序列如序列表中序列12所示，再將該優(yōu)化序列通過(guò)公司進(jìn)行人工合成。
[0042] 表1 :假絲酵母屬密碼子使用頻率表
[0043]


[0046] 實(shí)施例2 :潮霉素抗性篩選標(biāo)記用于脂酰輔酶A合成酶基因的敲除
[0047] (1)基因敲除實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示
[0048] 引物ACS-hphF和ACS-hphR的5'末端為同源臂序列，對(duì)應(yīng)于革巴位點(diǎn)的上游和下 游序列。這兩個(gè)長(zhǎng)引物的3'末端分別與質(zhì)粒pUC-hph 1^中敲除模塊（deletion cassette) 的上游和下游配對(duì)，即與潮霉素抗性基因的啟動(dòng)子5'末端和終止子3'末端分別配對(duì)。以 ACS-hphF和ACS-hphR為引物，質(zhì)粒pUC-hph ea為模版，PCR擴(kuò)增后得到的DNA片段，兩頭分 別帶上下游同源臂，中間為潮霉素抗性篩選標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系同實(shí)施例1中的步驟2，PCR 程序同實(shí)施例1中的步驟3?？剐院Y選標(biāo)記通過(guò)同源臂區(qū)域，能夠宿主基因組發(fā)生雙交換同 源重組，抗性基因從而得到表達(dá)，使得菌體能夠在含潮霉素的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，并形成菌 落。同時(shí)對(duì)抗性平板生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，進(jìn)行純化和驗(yàn)證。
[0049] 驗(yàn)證時(shí)，使用到一對(duì)檢測(cè)引物ACS-U和ACS-D，分別與靶位點(diǎn)的上游和下游區(qū)域配 對(duì)。如果沒(méi)有同源重組發(fā)生，通過(guò)這一對(duì)等位基因?yàn)槟０鏀U(kuò)增出來(lái)的片段在長(zhǎng)度上是一樣 的，在瓊脂糖電泳中只能觀察到一條帶。如果其中一個(gè)等位基因由于雙交換事件被抗性基 因片段替換了，那么經(jīng)過(guò)擴(kuò)增得到的片段長(zhǎng)度就發(fā)生變化，在瓊脂糖電泳中可以觀察到兩 條帶。
[0050] 本實(shí)施例中引物設(shè)計(jì)的原則為：用于同源重組的同源臂區(qū)域和檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)都 選擇在靶位點(diǎn)等位基因的序列比對(duì)中完全相同的區(qū)域，從而達(dá)到兩個(gè)等位基因敲除和檢測(cè) 具有同等的概率。
[0051] (2)PCR 擴(kuò)增
[0052] 10X緩沖液 5 pl 質(zhì)粒p.UC-hph (2 ng/u 1) 1 P 1 引物ACS-hphF (10 uM) 1 p 1 引物ACS-hphR (10 PM) 1 P.1 dNTP (10 mM) 1 p .l DNA聚合酶（5 U/p 1) 0. 25 p 1 超純水_40. 75 P 1 jt- 50 u 1
[0053] DNA聚合酶是寶生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的 Phusion DNA聚合酶，活性單位均為5U/ y 1 〇
[0054] PCR 程序?yàn)椋?br>[0055] MX： 2min MX： 30s ' 56°C 30s - 30 個(gè)循環(huán) 72〇C 2.5rain - 72〇C 10m in
[0056] (3) DNA 純化
[0057] 反應(yīng)結(jié)束后，取5 y 1上述PCR樣品進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，證明擴(kuò)增所得的DNA片 段大小與預(yù)計(jì)的一樣，而且沒(méi)有雜帶，進(jìn)行兩步純化和濃縮，為后面的轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備DNA樣品。
[0058] 第一步是利用PCR Cycle-Pure Kit純化試劑盒（購(gòu)自O(shè)mega公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。一般是50 y 1體系，做4管，總體積共200 y 1，PCR純化的最后一步用50或100 y 1 TE 緩沖液洗脫柱子。純化后的DNA，用NanoDrop儀器測(cè)濃度，計(jì)算得到的DNA總量約為20 y g。
[0059] 第二步是將純化的DNA再用乙醇/醋酸鈉/糖原處理進(jìn)行沉淀。具體做法是：往上 述溶在TE緩沖液的DNA溶液加入1 y 1糖原（20mg/ml)、100 y 1醋酸鈉（3M，pH5. 2)和lml 預(yù)冷的無(wú)水乙醇；放置_80°C冰箱冷卻30分鐘；4度離心機(jī)，14000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心10 分鐘，留沉淀；沉淀再用75%預(yù)冷的乙醇洗兩遍；超凈臺(tái)里風(fēng)干；4°C冰箱儲(chǔ)存，電轉(zhuǎn)之前重 懸在10 yl超純水備用。
[0060] (4)感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)
[0061] 從新鮮活化的平板上挑出發(fā)菌株（Candida Sp.DC12,參見(jiàn)《微生物學(xué)報(bào)》20(1): 88-93, 1980,正烷烴發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈混合二羧酸，可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所購(gòu)買(mǎi)）的單 菌落于3ml液體YH)培養(yǎng)基中，30 °C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘；2 %轉(zhuǎn)接于20ml YPD，30°C搖床培養(yǎng)，220轉(zhuǎn)/分鐘，至0D600達(dá)到1. 8 ;將菌液置于冰上靜置15分鐘，使其 停止生長(zhǎng)，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；用4ml預(yù)冷無(wú)菌水洗一次；4000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4mlTE/0. 1M LiOAc，150轉(zhuǎn)/分鐘，30°C的搖床內(nèi)振 蕩90分鐘；加入0. lml 1MDTT，繼續(xù)150轉(zhuǎn)/分鐘、30°C的搖床箱內(nèi)振蕩30分鐘；4000轉(zhuǎn)/ 分鐘，4°C離心3分鐘，留菌體沉淀；加入4ml預(yù)冷無(wú)菌水，洗3次；加入2ml 1M山梨醇，洗1 次，4000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心3分鐘；棄上清，加入120 y 1山梨醇將細(xì)胞懸起；取出40ul的細(xì) 胞懸液于1. 5ml離心管，加入5 y 1上述純化后重懸在無(wú)菌水的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（約10 y g)， 混勻，置于冰上5分鐘；轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，擦干電轉(zhuǎn)杯，進(jìn)行電轉(zhuǎn)（電轉(zhuǎn)條件為：2mm狹 縫的電轉(zhuǎn)杯，電壓為1800伏，電擊時(shí)間為5毫秒）；電轉(zhuǎn)后立刻加入lml山梨醇，混勻后吸出 放到1. 5ml的離心管中；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加入lml YH)培養(yǎng)基，37°C的 搖床內(nèi)培養(yǎng)2小時(shí)；4000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，棄上清，加100 y 1 YPD重懸菌體，涂布YPD 固體平板（含300 y g/ml潮霉素），放到30°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。
[0062] (5)篩選抗性菌落
[0063] 上述抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落分別接種到lml YH)培養(yǎng)基的離心管中，加潮霉素 至終濃度為400 y g/ml，220轉(zhuǎn)/分鐘，30°C搖床培養(yǎng)。出現(xiàn)生長(zhǎng)，說(shuō)明帶有抗性，證明抗性 基因已經(jīng)整合到菌體基因組中并發(fā)揮作用，這部分菌落用于下一步驗(yàn)證。沒(méi)有出現(xiàn)生長(zhǎng)的 菌落，說(shuō)明是假陽(yáng)性，等同于出發(fā)菌株，停止處理。
[0064] (6)鑒定
[0065] 上面出現(xiàn)生長(zhǎng)的抗性菌落，接種YH)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，吸取500 y 1菌液，利用 寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒制備基因組DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。以獲得的基因組DNA為模版，ACS-U和ACS-D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系及反 應(yīng)條件參照本實(shí)施例2的第2)條。如果靶位點(diǎn)上的等位基因沒(méi)有被敲除，從兩條等位染色 體上擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段大小一樣，在瓊脂糖電泳上表現(xiàn)為一條帶。如果靶位點(diǎn)上其中一 個(gè)等位基因被敲除，從兩條等位染色體上擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段大小不一樣，在瓊脂糖電泳 上表現(xiàn)為兩條帶（見(jiàn)圖4)。鑒定為抗性陽(yáng)性并且靶位點(diǎn)被敲除的菌株，再進(jìn)一步經(jīng)菌落純 化和相同方法的鑒定，得到成功敲除靶位點(diǎn)基因的新菌株。本實(shí)施例證實(shí)了本發(fā)明提供的 潮霉素抗性在假絲酵母遺傳操作系統(tǒng)中能夠作為篩選標(biāo)記應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)假絲酵母菌的基因工 程改造。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種潮霉素抗性基因，其特征是其編碼區(qū)核苷酸序列如序列表的序列12所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的潮霉素抗性基因，其特征是其符合假絲酵母屬的密碼子編碼 系統(tǒng)。3. -種潮霉素抗性基因，其特征是其核苷酸序列如序列表的序列13所示。4. 如權(quán)利要求1或3所述的潮霉素抗性基因在假絲酵母菌基因工程改造中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的潮霉素抗性基因在假絲酵母菌基因工程改造中的應(yīng)用， 其特征在于在對(duì)假絲酵母菌基因工程改造中，對(duì)靶位點(diǎn)等位基因之一進(jìn)行敲除；基因 敲除的靶位點(diǎn)為酯酰輔酶A合成酶基因，該基因的等位基因分別為如序列表14所示的 CandidaA00308 和序列表 15 所示的 Candida01833。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK106032537SQ201510103245
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月10日
【發(fā)明人】張子娟, 賴(lài)小勤, 葛書(shū)華, 晏禮明, 楊勇, 陶勇, 傅深展
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院微生物研究所