專利名稱：突變的異戊烯基二磷酸合成酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的合成線性異戊二烯基二磷酸的突變體酶，異戊二烯基二磷酸是對有機體重要的化合物的前體，如甾類化合物、泛醌、多萜醇、類胡蘿卜素、異戊二烯基化的蛋白質、動物激素、植物激素等或其基因等等。
在體內具有重要功能的物質中，許多物質是利用異戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)作為基礎生物合成的。這些化合物稱為類異戊二烯、類萜或萜烯，依賴于碳原子數(shù)目分為半萜(C5)、單萜(C10)、倍半萜(C15)、雙萜(C20)、雙半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)等等。實際合成以甲羥戊酸途徑開始，通過這個途徑合成5-二磷酸甲羥戊酸，其后是活性的異戊二烯單位的異戊烯基二磷酸(IPP)的合成。
發(fā)現(xiàn)作為推測的前體的異戊二烯單位是IPP，所謂的活性異戊二烯單位。已知IPP的異構體二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)(在異戊烯基腺嘌呤的反應中作為底物，已知它作為細胞分裂素，而且是植物激素之一)可與IPP進行縮合反應以合成線性活性類異戊二烯，如香葉酯二磷酸(GP)、橙花基二磷酸、法呢二磷酸(FPP)、香葉酯香葉酯二磷酸(GGPP)、香葉酯法呢二磷酸(GFPP)、六異戊二烯基二磷酸(HexPP)、七異戊二烯基二磷酸(HepPP)等。
縮合反應有Z-型和E-型。GPP是E-型縮合反應的產物，橙花基二磷酸是Z-型縮合反應的產物。盡管在FPP和GGPP中所有的E-型都被認為是活性形式，Z-型縮合反應導致了在天然橡膠、多萜醇、細菌萜醇(十一萜醇)和植物中發(fā)現(xiàn)的不同的聚萜醇的合成。它們被認為利用存在于分子中的焦磷酸和/或碳主鏈的磷酸酯鍵能量進行縮合反應以產生作為反應副產物的焦磷酸和/或磷酸鹽。
FPP或GGPP作為反應底物導致了異戊二烯基化的蛋白質合成(從FPP或GGPP合成)，這些蛋白質以G-蛋白為代表，在細胞信號轉導機制、archaea的細胞膜脂類(從GGPP合成)、作為甾族化合物前體的角鯊烯(從FPP合成)、作為類胡蘿卜素前體的八氫番茄紅素(從GGPP合成)中起重要作用。從分別具有六和七個異戊二烯單位的HexPP和HepPP到具有10個異戊二烯單位的異戊二烯基二磷酸作為在電子傳遞系統(tǒng)中起作用的泛醌和甲萘醌(維生素K2)合成的前體。
而且，通過這些活性形式的類異戊二烯的生物合成，合成了下列生命必需的植物種類的化合物。正如剛剛提到的，合成的化合物如下使用半萜作為其合成前體的細胞分裂素和異戊烯腺苷修飾的tRNA的植物激素、作為玫瑰油香料主要組分的單萜香葉醇及其橙花醇異構體、作為殺蟲劑的樟腦樹提取物樟腦。倍半萜包括昆蟲保幼激素，雙萜包括植物激素赤霉素、昆蟲的追蹤(trail)信息素、作為視覺色素前體起作用的視黃醇和視黃醛、嗜鹽的archaea的紫膜蛋白的結合組分以及維生素A。
而且，使用角鯊烯(一種三萜)可合成各種甾類化合物，這些化合物包括，例如，動物性激素、維生素D、作為昆蟲交配激素的蛻皮素、植物激素蕓苔甾內酯以及質膜組分。作為有機體的各種色素和維生素A前體的四萜的各種類胡蘿卜素也是衍生自活性類異戊二烯的重要組分。如hlorophyll、脫鎂葉綠素、生育酚(維生素E)和葉綠醌(維生素K1)的化合物也衍生自四萜。
將烯丙型底物DMAPP、GPP、FPP、GGPP、GFPP等與IPP連續(xù)縮合的活性類異戊二烯合成酶稱為異戊二烯基二磷酸合成酶，也可基于最大反應產物的最大鏈長命名，例如法呢二磷酸合成酶(FPP合成酶)、香葉酯香葉酯合成酶(GGPP合成酶)等等。對酶的純化、活性測量、基因克隆及其核苷酸測序已有報道，這些酶如得自細菌、archaea、真菌、植物和動物的法呢二磷酸合成酶、六異戊二烯基二磷酸合成酶、香葉酯香葉酯二磷酸合成酶、七異戊二烯基二磷酸合成酶、八異戊二烯基二磷酸合成酶、九異戊二烯基二磷酸合成酶(茄呢醇二磷酸合成酶)、十一異戊二烯基二磷酸合成酶等等。
這些組成在工業(yè)和生命科學領域是重要的許多種化合物合成的基礎的活性類異戊二烯合成酶由于其不穩(wěn)定的特征和低特異性活性，對于其工業(yè)應用很少引起人們的注意。然而，隨著FPP合成酶和GGPP合成酶基因從細菌和archaea中的分離[A.Chen和D.Poulter(1993)，生物化學雜志，26811002-11007，T.Koyama等(1993)，生物化學雜志，113355-363，S.-i，Ohnuma等(1994)，生物化學雜志，26914792-14797]，它們作為酶的可利用率提高了。
如許多報告中所發(fā)表的，合成具有20至25個碳的異戊二烯基二磷酸的酶是同型二聚體，而且在體外比較容易反應。然而，合成鏈長超過上述長度的異戊二烯基二磷酸的酶被認為是異型二聚體，或需要其它因子如脂類等。因此，為了實現(xiàn)其工業(yè)應用，必需找出允許兩種亞單位或其它因子的再裝配的最優(yōu)條件，這是一項困難的任務。
因此，需要這樣一種技術，這種技術通過人工改變衍生自嗜熱有機體的同型二聚體異戊二烯基二磷酸合成酶氨基酸序列(穩(wěn)定且具有高的特異性活性)使同型二聚體的耐熱異戊二烯基二磷酸合成酶能合成具有更長鏈長的異戊二烯基二磷酸。
至于衍生自嗜熱有機體的異戊二烯基二磷酸合成酶，目前有衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的改變的FPP合成酶和衍生自嗜酸熱硫化葉菌的GGPP合成酶的例子。嗜熱脂肪芽孢桿菌的FPP合成酶的突變體酶及其基因基于有機體的顏色變化通過由衍生自噬夏孢歐文氏菌的crtB(八氫番茄紅素合成酶的基因)與CrtI(八氫番茄紅素去飽和酶的基因，順反異構酶)和大腸桿菌中的嗜熱脂肪芽孢桿菌突變體的FPP合成酶的基因的共存產生的番茄紅素選擇。GGPP合成酶及它的突變體及其嗜酸熱硫化葉菌的基因基于互補釀酒酵母的HexPP合成酶缺陷芽殖酵母的甘油代謝活性的活性來選擇。
噬夏孢歐文氏菌的crtB和CrtI基因的共存方法不能用于篩選比突變體酶的GGPP更長的反應產物，使用HexPP合成酶缺陷芽殖酵母釀酒的互補活性的篩選方法不能用于比HexPP更長的反應產物的特異性檢測。這些基因組篩選方法有能力克隆具有GGPP、GFPP和HexPP的合成活性的突變體異戊二烯基二磷酸合成酶的基因，但是不能有系統(tǒng)地控制用于延伸反應產物的鏈長的異戊二烯基二磷酸合成酶的反應產物鏈長度。關于這一目的的規(guī)律也是未知的。
本發(fā)明的目的是通過修飾異戊二烯基二磷酸酶的氨基酸殘基建立反應產物鏈長系統(tǒng)控制的規(guī)則。更穩(wěn)定或具有適合于工業(yè)應用的高特異性活性的新酶使立即獲得突變體酶或其基因(基于上述規(guī)則通過修飾氨基酸殘基合成具有更長鏈長的異戊二烯基二磷酸)成為可能。
從突變體嗜酸熱硫化葉菌的GGPP合成酶的基因的核苷酸序列的信息可以清楚地知道基于異戊二烯基二磷酸合成酶的氨基酸順序的分析在兩個提出的富含天冬氨酸結構域之外，定位在氨基酸氨基末端富含天冬氨酸結構域保守序列I(DDXX(XX)D)的上游的第五個位置的氨基酸殘基參與了反應產物鏈長的控制。
因此，本發(fā)明提供了一種突變體異戊二烯基二磷酸合成酶，其中定位在富含天冬氨酸的結構域DDXX(XX)D(在括號中的兩個X可能不存在)的N-末端方向從N-末端的D開始的第五個位置的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代，其中所說的結構域存在于異戊二烯基二磷酸合成酶的保守區(qū)的第二個區(qū)域中。
本發(fā)明也提供了編碼所說的酶的DNA或RNA。
本發(fā)明還提供了包含所說的DNA的重組載體，具體來說是表達載體。
本發(fā)明還提供了用上述載體轉化的宿主。
本發(fā)明進一步提供了用于產生具有20個或更多碳的異戊二烯基二磷酸的方法，其特征在于上述酶和選自異戊烯基二磷酸合成酶、二甲基烯丙基二磷酸合成酶、香葉酯二磷酸合成酶、法呢二磷酸合成酶以及香葉酯香葉酯二磷酸合成酶的底物相接觸。
本發(fā)明進一步提供了用于產生權利要求1至4任一中提出的酶的方法，所說的方法包括培養(yǎng)上述宿主，然后從培養(yǎng)物中收獲表達產物。
附圖的簡要說明

圖1是顯示獲得的19種突變體型BstFPSs(嗜熱脂肪芽孢桿FPP合成酶)和野生型BstFPS(樣品名為Y)的酶促活性的圖表“引物DMAPP”表明DMAPP用作烯丙型底物，“引物GPP”表明GPP用作烯丙型底物，“引物FPP”表明FPP用于烯丙型底物。在命名為A到W的樣品中，位置81的取代導入后氨基酸的名稱用一字母密碼表明。
圖2顯示了DMAPP用作為烯丙型底物時，突變體BstFPSs反應的脫磷酸產物的TLC展開模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突變。
圖3顯示了GPP用作烯丙型底物時，突變體BstFPSs反應的脫磷酸產物的TLC展開模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突變。
圖4顯示了EPP用作烯丙型底物時，突變體BstFPSs反應的脫磷酸產物的TLC展開模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突變。
圖5是顯示當DMAPP用作烯丙型底物時酶促活性和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖6是顯示當GPP用作烯丙型底物時酶促活性和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖7是顯示當FPP用作烯丙型底物時酶促活性和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖8是顯示當DMAPP用作烯丙型底物時反應產物的平均鏈長和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖9是顯示當FPP用作烯丙型底物時反應產物的平均鏈長和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖10是顯示當FPP用作烯丙型底物時反應產物的平均鏈長和氨基酸側鏈的分子量之間關系的圖表。
圖11是顯示各種異戊二烯基二磷酸合成酶和富含天冬氨酸結構域的區(qū)域(I)至(VII)的圖表，氨基酸(星號)定位在N-末端方向從其末端的第五個位置。在圖中，序列代表法呢二磷酸合成酶氨基酸序列，1是衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌的氨基酸序列，2衍生自大腸桿菌，3衍生自釀酒酵母，4得自大鼠，5得自人。
已經(jīng)提出在異戊二烯基二磷酸合成酶(在雜二聚物的情況下為一個亞單位)的氨基酸序列中有七個保守區(qū)域(Chem等，Protine Science，第3卷，600-607，1994)。也已經(jīng)知道在五個保守區(qū)域中，包含富含天冬氨酸的結構域的區(qū)域II保守區(qū)域I[DDXX(XX)D](在括號中的兩個X可能不存在)。盡管在區(qū)域IV也有富含天冬氨酸結構域，用于指定本發(fā)明的氨基酸序列修飾區(qū)域的富含天冬氨酸結構域存在于區(qū)域II，所說的結構域與存在于區(qū)域V的富含天冬氨酸的結構域I比較定名為富含天冬氨酸的結構域I。
對于具有以上所述的富含天冬氨酸結構域的異戊二烯基二磷酸合成酶，可以論及的有法呢二磷酸合成酶、香葉酯香葉酯二磷酸合成酶、六異戊二烯基二磷酸合成酶、七異戊二烯基二磷酸合成酶、八異戊二烯基二磷酸合成酶、九異戊二烯基二磷酸合成酶、十一異戊二烯基二磷酸合成酶等。更具體的例子包括嗜熱脂肪芽孢桿菌的法呢二磷酸合成酶、大腸桿菌的法呢二磷酸合成酶、釀酒酵母的法呢二磷酸合成酶、大鼠法呢二磷酸合成酶、人法呢二磷酸合成酶、粗糙脈孢菌的香葉酯香葉酯二磷酸合成酶、釀酒酵母的六異戊二烯基二磷酸合成酶等。
通過某些這樣的酶的例證的方式，在法呢二磷酸合成酶的氨基酸序列中的區(qū)域I至VII和區(qū)域II的富含天冬氨酸的結構域I(在方框中)在圖11中顯示。
本發(fā)明適用于具有這些富含天冬氨酸結構域I的異戊二烯基二磷酸合成酶。
按照本發(fā)明，定位在富含天冬氨酸的結構域DDXX(XX)D(在括號中兩個X可能不存在)的N-末端方向從N-末端的D開始的第五個位置的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代，其中所說的結構域存在于異戊二烯基二磷酸合成酶的保守區(qū)的第二個區(qū)域中。這種氨基酸在圖11中通過星號指出。取代之后的氨基酸可以是任何不同于原來氨基酸的天然產生的氨基酸。對這樣的一個例子提到一種具有這樣的氨基酸序列的酶，其中在SEQ ID No1中位置81的酪氨酸被一種天然產生的氨基酸替代。
許多本發(fā)明的突變體異戊二烯基二磷酸合成酶與天然異戊二烯基二磷酸相比可合成具有更長鏈長的異戊二烯基二磷酸。例如，一些可合成具有15個碳的法呢二磷酸的法呢二磷酸合成酶，當修飾進突變體酶時可合成具有30個碳的六異戊二烯基二磷酸。
已經(jīng)知道即使酶原來的氨基酸序列通過一種或幾種氨基酸的添加、缺失和/或取代時，酶可以保留它原來的酶促活性。因此，本發(fā)明有意包括除在SEQID No1中提出的氨基酸序列的肽之外，那些包含通過一個或幾個(例如多達5或多達10)氨基酸的取代、缺失和/或添加修飾的氨基酸序列并可完成它原來功能的酶。
本發(fā)明也提供了編碼上述各種突變體酶的基因、包含這些基因的載體(具體來說是表達載體)以及用所說的載體轉化的宿主。本發(fā)明的基因(DNA)易于獲得，例如，可通過使用位點特異性誘變或其它常規(guī)方法如PCR等把突變導入編碼在SEQ ID No1中提出的天然氨基酸序列的DNA。
而且，一旦確定了合乎需要的酶的氨基酸序列，就可以確定其適當?shù)暮塑账嵝蛄?，DNA就可按照DNA合成的常規(guī)方法化學合成。
本發(fā)明還提供了包含如上所述的一種DNA的表達載體、用所說的表達載體轉化的宿主以及使用這些宿主產生本發(fā)明的酶或肽的方法。
表達載體包含復制起點、表達調節(jié)序列等，但是它們與宿主不同。對宿主來說，可以是原核生物，例如，細菌(如大腸桿菌和芽孢桿菌屬，如枯草芽孢桿菌)以及真核生物，例如，真菌(如酵母，例如酵母屬種類，如釀酒酵母，絲狀真菌，例如曲霉屬，如米曲霉和黑曲霉)、動物細胞(例如，蠶的培養(yǎng)細胞、高等動物的培養(yǎng)細胞如CHO細胞)等等。而且，植物可以用作宿主。
如在實施例中所示，按照本發(fā)明在培養(yǎng)用本發(fā)明的DNA轉化的宿主期間，長鏈異戊二烯基二磷酸如GGPP、GFPP、Hexpp等可在培養(yǎng)基上積累，可以通過回收以產生它們各自的二磷酸。進而，按照本發(fā)明，長鏈異戊二烯基二磷酸也可以通過使按照本發(fā)明產生的突變體異戊二烯基二磷酸合成酶與底物異戊烯基二磷酸和烯丙型底物如法呢二磷酸接觸產生。
大腸桿菌用作宿主時，已知宿主在DNA轉錄mRNA以及從mRNA翻譯蛋白質階段有基因的調節(jié)功能。作為調節(jié)mRNA合成的啟動子序列，已知除了天然產生的序列之外(例如，lac、trp、bla、lpp、PL、PR、ter、T3、T7等等)，還有它們的突變體(例如，lacUV5)、天然產生的啟動子在其中人工融合的序列(如tac、trc等等)，它們可用于本發(fā)明。
已經(jīng)知道，核糖體結合位點的序列(GAGG及其類似的序列)和起始密碼子之間的距離作為調節(jié)從mRNA合成蛋白質的能力的序列是重要的。也已經(jīng)知道，指導3’端轉錄終止完成的終止子(例如，Pharmacia市售的包含rrnPT1 T2的載本)通過重組體影響蛋白質合成的效率。
對于可用于本發(fā)明的重組載體制備的載體，可以提到不同的依賴于特定應用衍生的載體。例如，可以提到pBR322、pBR327、pKK223-3、pKK233-3、pTrc99以及同時具有衍生自pMB1的復制子的類似物；pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396以及改變可提高拷貝數(shù)量的類似物；或pACYC177、PACYC184以及衍生自p15A的復制子；進而，衍生自pSC101、ColE1、R1、F因子等等的質粒。進而，也可以使用可使純化更容易的融合蛋白質表達載體(如PGEX-2T、pGEX-3X、pMal-cZ)。用作本發(fā)明的起始材料的基因的一個例子在日本專利申請6-315572中描述。
進而，除質粒之外，病毒載體如λ噬菌體或M13噬菌體或轉座子可用于基因的導入。關于通過pHY300PLK(Takara Shuzo)把基因導入非大腸桿菌的微生物、把基因導入芽孢桿菌屬有機體是已知的。這些載體在《分子克隆》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實驗室出版社)，《克隆載體》(P.H.Pouwels，B.E.Enger，Valk，和W.J.Brammar，Elsevier)以及許多制造廠商的目錄中描述。
pTrc99是特別優(yōu)選的，因為它除了氨芐青霉素抗性基因的可選擇性標記之外，還具有啟動子、調節(jié)基因如Ptrc和lacIq、作為核糖體結合位點的序列AGGA、作為啟動子的rrnPT1T2以及調節(jié)FPP合成酶表達的功能。
編碼異戊二烯基二磷酸合成酶的DNA片段的整合(需要時，可整合具有調節(jié)所說的插入這些載體的酶的基因表達功能的DNA片段)可使用適當?shù)南拗菩詢惹忻负瓦B接酶通過已知的方法進行。這樣構建的質粒的具體例子包括，例如，pTV118N-Bst FPS。
作為用于通過這樣的重組載體整合的微生物，可以使用大腸桿菌和芽孢桿菌屬的微生物。這樣的轉化也可以使用在《分子克隆》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港實驗室出版社)和《DNA克隆》，I至III卷(D.M.Clover ed.，IRL出版社)中描述的CaCl2方法和原生質體方法進行。
為了產生本發(fā)明的突變體酶，培養(yǎng)如上轉化的宿主，然后所說的培養(yǎng)物經(jīng)受鹽析、用有機溶劑沉淀、凝膠色譜、親和色譜、疏水相互作用色譜、離子交換色譜等以回收和純化所說的酶。
本發(fā)明也提供了利用本發(fā)明的酶產生異戊二烯基二磷酸方法。按照這種方法，本發(fā)明的酶在培養(yǎng)基(尤其是含水的培養(yǎng)基)中反應，然后從反應培養(yǎng)基回收所需的異戊二烯基二磷酸。作為酶，不僅可使用純化的酶，而且可以使用半純化到不同階段的粗制酶或培養(yǎng)的微生物的生物量的混合物。另外，也可以使用按照常規(guī)方法從所說的酶、粗制酶或包含酶的產物制備的固化酶。
作為底物，可以使用具有比所需的異戊二烯基二磷酸的碳數(shù)目少5至20(優(yōu)選的是5)碳的異戊二烯基二磷酸和異戊烯基二磷酸。作為反應培養(yǎng)基，可以使用水或含水的緩沖液，例如Tris緩沖液或磷酸緩沖液等等。
通過使用本發(fā)明獲得的異戊二烯基二磷酸合成酶反應產物鏈長調節(jié)系統(tǒng)，可使用易于操作的同型二聚物突變體異戊二烯基二磷酸合成酶合成具有更長鏈長的異戊二烯基二磷酸(其合成迄今為止僅能用雜二聚物型酶進行)。進而，通過使用上述系統(tǒng)修飾定位在具有雜二聚物型異戊二烯基二磷酸合成酶的富含天冬氨酸的結構域的相應亞單位的富含天冬氨酸的結構域I的上游五個氨基酸中的氨基酸殘基，就可以期望產生合成具有更長鏈長的異戊二烯基二磷酸的突變體酶。
在本發(fā)明的權利要求和說明書中，氨基酸殘基用一字母密碼或三字母密碼表示A；Ala；丙氨酸C；Cys；半胱氨酸D；Asp；天冬氨酸E；Glu；谷氨酸F；Phe；苯丙氨酸G；Gly；甘氨酸H；His；組氨酸I；Ile；異亮氨酸K；Lys；賴氨酸L；Leu；亮氨酸M；Met；甲硫氨酸N；Asn；天冬酰胺P；Prl；脯氨酸Q；Gin；谷氨酰胺R；Arg；精氨酸S；Ser；絲氨酸T；Thr；蘇氨酸V；Val；纈氨酸W；Trp；色氨酸y；Tyr；酪氨酸氨基酸取代以順序“取代之前的氨基酸殘基”、“氨基酸殘基的編號”，“取代之后的氨基酸殘基”表示。例如，在位置81的酪氨酸殘基被甲硫氨酸殘基取代的突變表示為Y81M。
實施例現(xiàn)在參考特定的實施例來解釋本發(fā)明，但是它們不應該理解為以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1構建包含F(xiàn)PP合成酶的基因的質粒衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌的FPP合成酶的基因(下文作為BstFPS)亞克隆進質粒載體pTV118N(可從Takara Shuzo買到)的NcoI-HindIII位點，質粒DNA定名為pTV118N-BstFPS。BstFPS基因可從大腸桿菌JM109(于1991年9月26日在國立生命科學和人體技術研究所，工業(yè)科學和技術局，Ibalaki，日本進行了國際保藏，保藏號為FERM BP-3581獲得。BstFPS基因的全核苷酸序列也在日本專利申請3(1991-253788，T.Koyama等，(1993)生物化學雜志，113355-363，或在遺傳信息數(shù)據(jù)庫如GenBank以保藏號D13293發(fā)表。因為嗜熱脂肪芽孢桿菌也可從各種微生物保藏處如ATCC等得到，BstFPS區(qū)域基因的DNA可通過常規(guī)的基因克隆方法獲得。
實施例2導入突變的寡核苷酸的合成為了導入FPP合成酶基因的突變，設計和合成了下列寡核苷酸引物DNA(Y81X)5’GAT CCA TAC GNN NTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No2)引物DNA(Y81N)5’GAT CCA TAC GAA CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No3)引物DNA(Y81I)5’GAT CCA TAC GAT TTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No4)引物DNA(Y81M)5’GAT CCA TAC GAT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No5)引物DNA(Y81F)5’GAT CCA TAC GTT CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No6)引物DNA(Y81P)5’GAT CCA TAC GCC CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No7)引物DNA(Y81V)5’GAT CCA TAC GGT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No8)設計它們以重新導入限制性內切酶BspHI(5’TCATGA3’)的裂解位點并在編碼BstFPS的位置81的氨基酸殘基的密碼子中導入突變。因為密碼子的簡并性，導入BspHI裂解位點不改變由BstFPS基因編碼的氨基酸序列。這用于通過BspHI消化后的瓊脂糖凝膠電泳檢測取代突變的質粒，因為導入通過取代BstFPS基因位置81的氨基酸殘基的突變同時產生了一個新的BspHI裂解位點。
這些引物DNA在37℃下于下述反應培養(yǎng)基中經(jīng)受30分鐘的磷酸化，其后在70℃下變性10分鐘10pmol/μl引物DNA2μl10×kination緩沖液 1μl10mM ATP 1μlH2O 5μlT4多核苷酸激酶 1μl其中10×kination緩沖液是1000mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM MgCl2以及70mM DTT。
實施例3把取代突變導入對應于BstFPS基因的位置81的氨基酸殘基的密碼子使用在實施例2中構建的每種引物DNA，按照Kunkel方法把取代突變導入實施例1中制備的質粒中。用從Takara Shuzo購買的Mutan-K試劑盒進行Kunkel方法。實驗步驟如試劑盒插入物所述。質粒的取代突變不必用Kunkel方法進行。例如，通過利用聚合成酶鏈式反應(PCR)的方法可獲得相同的結果。
使用在Mutan-K試劑盒中的大腸桿菌CJ236作為宿主細胞，獲得了單鏈DNA，其中在質粒pTV118N-BstFPS中的胸腺嘧啶堿基被脫氧尿嘧啶堿基取代。
這樣獲得的單鏈DNA在反應中用作模板，其中用于合成互補鏈的引物DNA在下列反應溶液中于65℃下處理15分鐘，然后通過使鏈在37℃下維持15分鐘退火單鏈DNA0.6pmol退火緩沖液 1μl引物DNA溶液(實施例2) 1μl水 加至10μl的最終體積其中退火緩沖液是200mM Tris-Cl(pH 8.0)、100mM MgCl2、500mM NaCl以及10mM DTT。
進而，加入25μl的延長(extention)緩沖液、60單位的大腸桿菌DNA連接酶以及1單位的T4 DNA聚合成酶在25℃下進行2小時的互補鏈合成。延長緩沖液是50mM Tris-Cl(pH 8.0)、60mM乙酸銨、5mM MgCl2、5mM DTT、1mMNAD以及0.5mM dNTP。
反應結束后，向溶液中加入3μl的0.2M EDTA(pH 8.0)，在65℃下經(jīng)受5分鐘的處理以停止反應。
實施例4構建具有其中把取代突變導入對應于BstFPS基因的位置81的氨基酸殘基的密碼子的基因的重組體按照實施例3，配制的DNA溶液通過CaCl2方法用于來轉化大腸桿菌DH5α。替代的方法如電穿孔得出了相同的結果。
通過CaCl2方法獲得的轉化體平板接種于包含氨芐青霉素和轉化體可選擇的標記的瓊脂平板上，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。
在上述獲得的轉化體中，選擇那些在BstFPS編碼區(qū)具有BspHI裂解位點的取代突變pTV118N-BstFPS質粒。在對應于選擇的取代突變的pTV118N-BstFPS質粒的BstFPS基因的位置81的氨基酸殘基的密碼子鄰近的核苷酸序列使用雙脫氧方法測定。結果是，獲得了包含下列19種取代突變的BstFPS基因的pTV118N-BstFPS質粒突變密碼子Y81AGCTY81CTGCY81DGACY81EGAAY81FTTCY81GGGTY81HCACY81IATTY81KAAGY81LCTC
Y81M ATGY81N AACY81P CCGY81Q CAAY81R AGGY81S TCGY81T ACAY81V GTGY81W TGGY81Y(野生型) TAC實施例5突變體BstFPS的活性測量如下所述從包含在實施例4中獲得的19個突變體BstFPS基因和一個野生型BstFPS基因的20個轉化體制備粗制酶溶液。
離心在2×LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的轉化體以收獲細胞，然后把細胞懸浮進用于細胞勻漿的緩沖液(50mM Tris-Cl(pH 8.0)、10mMβ-meracptoethanol、1mM EDTA)中。通過聲處理勻漿然后以10,000r.p.m在4℃下離心10分鐘。上清液在55℃下處理30分鐘以滅活得自大腸桿菌的異戊二烯基二磷酸合成酶的活性。進一步在相同的條件下離心，獲得的上清液用作粗制酶提取物，在下列的反應溶液中于55℃下反應15分鐘[1-14C]-IPP(1Ci/mol) 25nmol烯丙型底物(DMAPP或GPP或FPP) 25nmolTris-Cl(pH 8.5) 50MgCl25mMNH4Cl 50mMβ-mercaptoethanol 50mM酶溶液 50μg水 加至1ml反應結束后，加入3ml的丁醇以把反應產物提取進丁醇層。獲得的1ml丁醇層加入3ml的液態(tài)閃爍器中以通過閃爍計數(shù)器測量放射性。結果在圖1中顯示。Y81P突變體BstFPS表現(xiàn)出十分低的酶促活性，可以推知是因為這樣的事實僅脯氨酸氨基殘基衍生自亞氨基酸，因此不能形成α-螺旋或β-折疊(sheet)的結構形式，由此顯著地改變了酶自身必需的高級結構。
當加熱分層使之濃縮到0.5ml時，通過清除(purging)進入其中的氮氣從丁醇層其余部分蒸發(fā)溶劑。向濃縮液中加入2ml乙醇和1ml馬鈴薯酸性磷酸酶溶液(2mg/ml馬鈴薯酸性磷酸酶，0.5M醋酸鈉(pH 4.7))以影響在37℃下的脫磷酸化反應。其后用3ml正戊烷提取脫磷酸化的反應產物。該提取物通過清除氮氣以蒸發(fā)溶劑而濃縮，然后通過TLC(反相TLC平板LKC18(Whatman)，顯色溶劑∶丙酮/水＝9/1)分析。通過生物圖象分析儀BAS 2000(富士照相膠卷)分析顯色的脫磷酸化反應產物以確定位置和相對放射性。所有反應產物量的比率相同，而放射性的比率變?yōu)镕PP∶GGPP∶GFPP∶HexPP＝2∶3∶4∶5。當DMAPP用作烯丙型底物時，效果在圖2中顯示，當GPP用作烯丙型底物時效果在圖3中顯示，當FPP用作烯丙型底物時效果在圖4中顯示。
實施例6取代突變的氨基酸殘基和反應產物的鏈長度之間的關系圖1和圖4顯示當使用FPP作為烯丙型底物進行反應時，突變體BstFPSs把IPP轉化成具有長于GGPP鏈長的異戊二烯基二磷酸。在這時，其中氨基酸的側鏈是小分子(如甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸)的取代突變體具有較高的活性，但是其中氨基酸側鏈是大的野生型分子(如酪氨酸和色氨酸)的取代突變體顯示出較低的活性。
然后，繪出了對于位置81的氨基酸殘基，酶促活性對側鏈分子量的圖(圖5、圖6和圖7)。然而，排除了Y81P取代突變體酶(其中酶促功能失去)。
結果清楚地表明當側鏈分子量小時，活性趨于提高(圖7)。即使使用代表氨基酸殘基大小的非側鏈分子量的參數(shù)，如可及表面面積(即氨基酸殘基暴露的表面面積的參數(shù))[Chothia(1976)，分子生物學雜志，1951-14，B.Lee和F.M.Richads(1971)，分子生物學雜志，55379-400，S.Miller等(1987)，分子生物學雜志，196641]等時，也可觀察到這樣的趨勢。
迄今為止，很少有報告表明在通過導入位點特異性突變(而不篩選如導入的隨機突變)對FPP合成酶的催化機制的研究中改變了反應產物的鏈長。導入單一位點特異性突變可實現(xiàn)本發(fā)明獲得的反應產物鏈長的動態(tài)控制的事實是完全沒有預料到的。
從圖5和6中可以看到，當DMAPP和GPP用作烯丙型底物時，在取代突變的氨基酸殘基的分子量和酶促活性之間沒有明顯的關系。這被認為是由這樣的事實造成的當FPP用作烯丙型底物時，野生型酶的反應特異性直接反映為酶促活性。使用DMAPP和GPP作為烯丙型底物的特異性是野生型酶固有的，因此只通過酶促活性參數(shù)分析趨勢是困難的。
因此，反應產物鏈長的期望值(此值是平均鏈長)由下列公式獲得(反應產物鏈長的期望值)＝(FPP的比率)×15+(GGPP的比率)×20+(GFPP的比率)×25+(HexPP的比率)×30作出了獲得的反應產物鏈長的期望值對位置81的氨基酶側鏈分子量的圖。然而，排除了Y81P取代突變體酶(其中酶促功能失去)。從這些圖中可以看出即使當烯丙型底物是DMAPP或GPP時，位置81的氨基酸殘基的側鏈分子量越小，反應產物鏈長的期望值越大。
使用位置81氨基酸殘基的另一種性質進行類似的作圖分析時，如作為疏水性參數(shù)的Hopp-Woods數(shù)值[J.E.Coligan等(1995)，蛋白質科學的當前方案，Johen Wiley和Sons公司]，當FPP用作烯丙型底物時，沒有觀察到關于反應產物的鏈長期望值或酶促活性有明顯的趨勢。進而，即使當使用如易于形成α螺旋結構[J.E.Coligan等(1995)，蛋白質科學的當前方案，Johen Wiley和Sons公司]或易于形成β-折疊結構[J.E.Coligan等(1995)，蛋白質科學的當前方案，Johen Wiley和Sons公司]的參數(shù)時，當FPP用作烯丙型底物時，沒有觀察到關于反應產物的鏈長期望值或酶促活性的明顯關系。本發(fā)明第一次闡明負責決定反應產物鏈長的因素是在富含天冬氨酸的結構域I(DDXX(XX)D)的上游的第五個氨基酸殘基的氨基酸殘基側鏈的大小。
序列表SEQ ID No1序列長度894序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線性分子類型基因組DNA來源有機體嗜熱脂肪芽孢桿菌序列GTG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG GCG48Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala5 10 15GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG CCG GCG96Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala20 25 30AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC CGC GGC AAA CGA144Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG CTC GGC AAA GAC192Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT GAA ATG ATC CAT ACG240Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC ATG GAC AAC GAT GAT TTG288Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu85 90 95CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC336Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala100 105 110ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC386Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr115 120 125GAA ATG GAC GAT GAG CGC ATC CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC 432Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile130 135 140GAA CGG CTG GCG AAA GCG GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG 480Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln145 150 155 160GCA GCC GAT ATG GAA GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC 528Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu165 170 175GAA TAC ATT CAT CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG 576Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val180 185 190CAC GCC GGC GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG 624His Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu195 200 205CTT GAC GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT 672Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp210 215 220GAT ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720Asp Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val225 230 235 240GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG TCG 768Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser245 250 255CTT GCC GGG GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG GCG CAG 816Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala Ala Gln260 265 270CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC GCC TAT ATT 864Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile275 280 285TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His ***290 295SEQ ID No2序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG NNNTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No3序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG AACTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No4序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG ATTTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No5序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA
序列GATCCATACG ATGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No6序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG TTCTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No7序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG CCGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No8序列長度34序列類型核酸鏈型單鏈拓撲結構線性分子類型合成DNA序列GATCCATACG GTGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG3權利要求
1.一種突變的異戊二烯基二磷酸合成酶，其中定位在富含天冬氨酸的結構域DDXX(XX)D(在括號中的兩個X可能不存在)的N-末端方向從N-末端的D開始的第五個位置的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代，其中所說的結構域存在于異戊二烯基二磷酸合成酶的保守區(qū)的第二個區(qū)域中。
2.按照權利要求1的酶，其中所說的異戊二烯基二磷酸合成酶是法呢二磷酸合成酶、香葉酯香葉酯二磷酸合成酶、六異戊二烯基二磷酸合成酶、七異戊二烯基二磷酸合成酶、八異戊二烯基二磷酸合成酶、九異戊二烯基二磷酸合成酶或十一異戊二烯基二磷酸合成酶。
3.按照權利要求1或2的酶，其中所說的異戊二烯基二磷酸合成酶是耐熱的酶。
4.按照權利要求1的酶，其中具有在SEQ ID No1中提出的氨基酸序列的法呢二磷酸合成酶的位置31的酪氨酸被另一種氨基酸取代。
5.按照權利要求1至4中任意一項的酶，其中所說的另一種氨基酸選自酪氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
6.一種編碼按照權利要求1至5中任意一項的酶的DNA。
7.一種從按照權利要求6的DNA轉錄的RNA。
8.一種包含按照權利要求6的DNA的重組載體。
9.一種用按照權利要求8的重組載體轉化的宿主有機體。
10.一種產生按照權利要求1至8中任意一項的酶的方法，所說的方法包括培養(yǎng)用包含編碼所說的酶的DNA的表達載體轉化的宿主，然后從培養(yǎng)物中回收表達產物。
11.一種產生具有20或更多個碳的異戊二烯基二磷酸的方法，其特征在于按照權利要求1至5中任意一項的酶或通過按照權利要求9的方法產生的酶與選自異戊烯基(isopentenyl)二磷酸合成酶、二甲基烯丙基二磷酸、香葉酯二磷酸、法呢二磷酸、香葉酯香葉酯二磷酸的底物相接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了突變體異戊二烯基(prenyl)二磷酸合成酶的制造或用途,其中定位在富含天冬氨酸的結構域DDXX(XX)D(在括號中的兩個X可能不存在)的N－末端方向從N－末端的D開始的第五個位置的氨基酸殘基被另一個氨基酸取代,其中所說的結構域存在于異戊二烯基二磷酸合成酶的保守區(qū)的第二個區(qū)域中。
文檔編號C07H21/02GK1199776SQ9711717
公開日1998年11月25日 申請日期1997年7月3日 優(yōu)先權日1996年7月3日
發(fā)明者成田啟之, 石田千佳, 竹內由枝, 大音德, 大沼信一, 西野德三 申請人:豐田自動車株式會社