一種耐受低密度的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，含有如下組分：L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒酸鈉、重組人胰島素、人脫鐵轉鐵蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子beta1、肝素鋰和/或肝素鈉、DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基及滲透壓調節(jié)劑。本發(fā)明的培養(yǎng)基在低密度和普通密度進行hiPSC培養(yǎng)時，增殖速度高，細胞形態(tài)和多能性維持的好，不需要使用昂貴的硫酸乙酰肝素，極大的降低了成本，并且能夠滿足現階段幾乎所有的hiPSC維持培養(yǎng)，以及加入各小分子化合物進行誘導重編程培養(yǎng)（去除TGFB1和DM），因此該培養(yǎng)基將適合各基礎科研、臨床科研實驗的廣泛研究。
【專利說明】
一種耐受低密度的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種耐受低密度的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002] 多能干細胞（Pluripotency stem cell，iPSC)具有自我更新能力和多能性，它能 夠向胚胎三個胚層（外胚層、中胚層、內胚層）的任何組織和細胞進行分化，因此iPSC在再 生醫(yī)學、發(fā)育生物學等領域起到重要的作用。iPSC包括胚胎干細胞（Embryonic stem cell， ESC)和誘導多能干細胞（induced pluripotency stem cell, iPSC)，無論是 ESC 還是 iPSC 他們都具有類似的基因表達譜、自我更新能力、多能性、表觀遺傳譜，前者來自于囊胚時期 的內細胞團，后者來自于成體細胞導入重編程因子誘導并純化出來的多能干細胞。現階段 研究最多的IPSC物種包括小鼠和人，其中小鼠的iPSC通常情況下處于naive狀態(tài)，更加原 始，能夠形成生殖嵌合，而人的iPSC通常被認為處于Primer狀態(tài)（鼠的Primer iPSC生殖 嵌合能力很弱，由于倫理因素未能得知人iPSC是否容易形成生殖嵌合）。正是因為物種、發(fā) 育階段等因素，小鼠iPSC增殖能力很強，能夠適應低密度（小于5%匯合度）以及正常情況 下健康生長，甚至小鼠iPSC可以較容易單細胞存活和增殖，而人的iPSC在低密度條件培養(yǎng) 下（如小于約10 %匯合度）較難生長，甚至會逐步死亡，其增殖速度也遠低于鼠的iPSC，由 于低密度或者單細胞iPSC培養(yǎng)在iPSC純化早期以及基因打靶（基因組編輯）過程中至關 重要，因此人的iPSC相關研究十分困難且相較鼠的iPSC研究付出更大代價。
[0003] 人的iPSC經歷了使用飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)、無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)以及無動物源性無飼 養(yǎng)層細胞培養(yǎng)的階段。1998年Thomson JA.首次分離并穩(wěn)定持續(xù)傳代培養(yǎng)得到人胚胎干細 胞（hESC)，當時將hESC培養(yǎng)在包含20% FBS以及其他因子的培養(yǎng)基中，其必須在gelatin 包被的飼養(yǎng)層細胞（feeder，絲裂霉素C處理后的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF，失去增殖能 力））上進行維持生長，hESC在該條件下傳代培養(yǎng)能夠長期維持其多能性和自我更新能力 (Science. 1998Nov6 ;282 (5391) : 1145-7.)。然而由于血清的成分不確定、質量差異、批間 差影響hESC穩(wěn)定傳代以及自我更新和分化的機制研究，也影響涉及人體的無動物源性研 究，后續(xù)有人利用血清替代物（KnockOut Serum Replacement，KSR)替代FBS可以穩(wěn)定持 續(xù)的在 feeder 上進行傳代培養(yǎng)，（NEngl J Med. 2004Mar 25 ;350 (13) : 1353-6.)迄今為止 KSR加feeder培養(yǎng)hiPSCs的方法廣泛使用。然而由于feeder通常來源于小鼠胚胎成纖 維細胞（MEF)，其批間差、動物源性、各類感染源性、成分不確定性等影響實驗研究的判斷和 進一步深入地應用研究，2001 年 Chunhui Xu 使用 MEF-conditioned medium 在 matrigel 或者其他基質蛋白包被條件下進行無feeder hESC培養(yǎng)（Nat Biotechnol.20010ct; 19(10) : 971-4.)，由此可見MEF分泌的許多因子參與iPSC的自我更新，后續(xù)發(fā)現TGFB1/ ActivinA/Nodal/bFGF等存在條件下可以維持iPSCs的自我更新能力，基于此Thomson 實驗室于2006年公開無feeder無血清無KSR成分明確的iPSCs培養(yǎng)基mTeSRl (Nat Methods. 2006Aug ;3 (8) : 637-46)，該培養(yǎng)基是目前全球科研運用最廣泛的iPSCs無feeder 培養(yǎng)基（包含2 %左右的動物源性蛋白，牛血清白蛋白BSA)。盡管mTeSRl的誕生使hiPSC領 域發(fā)展迅速，但mTeSRl仍包含大量的BSA，不適宜臨床研究，且費用高昂，因此StemCell公 司使用人血清白蛋白（HSA)替代mTeSRl的BSA，以及使用人源的細胞因子，開發(fā)出TeSR?2， 該培養(yǎng)基不含任何動物源性物質，適合臨床科研相關工作，后續(xù)許多各類其他公司也相應 開發(fā)出各自特色的的IPSCs培養(yǎng)基。但是TeSR2以及其他同類的培養(yǎng)基仍然包含大量的細 胞因子、蛋白質，成分復雜，且使用效果差于mTeSRl，不能廣泛滿足基礎科研和臨床科研的 需求，亦使研究發(fā)育和分化的不確定性增加，2011年Thomson實驗室確定了八種mTeSRl中 的主要成分的培養(yǎng)基即E8培養(yǎng)基，E8培養(yǎng)基可以長期穩(wěn)定維持iPSCs多能性和自我更新能 力（Nat Methods. 2011May;8(5):424-9.)。隨著全球相關領域廣泛使用E8,大家逐步發(fā)現 E8有許多不足之處，影響其更深入的應用，其不足之處包括：1.由于不存在HSA或者BSA， 培養(yǎng)基中如果添加促進重編程的小分子化合物或者巰基乙醇等細胞會表現明顯的細 胞毒性，不能在高效誘導重編程尤其是極限條件重編程過程中進行應用，影響加入不同的 各種小分子化合物的分化實驗，也限制低密度條件下培養(yǎng)hiPSC(我們的實驗發(fā)現96孔板 中每孔低于2000個hiPSC使用E8進行培養(yǎng)，細胞幾乎不能生長，直到細胞達到4000個才 能穩(wěn)定健康的生長）；2.E8所包含的細胞因子濃度很高，所需成本仍然很高。因此研發(fā)具有 大多數小分子或0 _巰基乙醇耐受性以及低密度hiPSC耐受性且成本低的高性能無feeder hiPSC培養(yǎng)基十分迫切。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種耐受低密度的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術方案是：
[0006] -種無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，含有如下組分：L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒 酸鈉、重組人胰島素、人脫鐵轉鐵蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子betal、肝 素鋰和/或肝素鈉、DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基。
[0007] 作為優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中各組分的含量為：L_抗壞血 酸-2磷酸鎂60~70 y g/ml，亞硒酸鈉10~20ng/ml，重組人胰島素15~25 y g/ml， 人脫鐵轉鐵蛋白5~15 y g/ml，堿性成纖維細胞生長因子1~100ng/ml，轉化生長因 子-betalO. 1 ~2. 0ng/ml，肝素裡 1 ~600ng/ml 和 / 或肝素納 1 ~400ng/ml，DMEM/F-12 基礎培養(yǎng)基補足至1L。
[0008] 進一步地，所述堿性成纖維細胞生長因子的含量優(yōu)選為10~30ng/ml，轉化生長 因子-betal的含量優(yōu)選為0. 1~1. 0ng/ml，肝素鈉的含量優(yōu)選為100~400ng/ml，肝素鋰 的含量優(yōu)選為100~500ng/ml。
[0009] 本申請的另一個方案，所述培養(yǎng)基中的轉化生長因子betal可替換為作用于相同 受體和具備相同功能的細胞因子，例如Nodal。轉化生長因子betal和Nodal在本培養(yǎng)基中 的作用是：維持人多能干細胞自我更新能力、多能性以及未分化狀態(tài)，抑制其自發(fā)分化。
[0010] 作為優(yōu)選的，上述培養(yǎng)基的滲透壓至280~350m〇sm〇l/lit er，常用的滲透壓調節(jié) 劑為氯化鈉。
[0011] 作為優(yōu)選的，所述人多能干細胞基礎培養(yǎng)基中還含有碳酸氫鈉和/或BMP信號 通路抑制劑，所述BMP信號通路抑制劑優(yōu)選為Dorsomorphin dihydrochloride、DMH-1、 Noggin、LDN-193189 中的至少一種。
[0012] 作為優(yōu)選的，所述人多能干細胞基礎培養(yǎng)基中碳酸氫鈉含量優(yōu)選為500~ 600 μg/ml，進一步優(yōu)選為520~570 μg/ml ;BMP信號通路抑制劑的含量優(yōu)選為10~ 500nM，進一步優(yōu)選為25~250nM。
[0013] 作為優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有牛血清白蛋白，含量優(yōu) 選為0. 05 %~4. 0 %，進一步優(yōu)選為0. 1 %~2. 0 %，按質量計。
[0014] 作為優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有Chemically Defined Lipid Concentrate，含量優(yōu)選為0? 01 %~2. 0 %，進一步優(yōu)選為0? 05 %~1. 5 %，按體積 計。
[0015] 作為優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有人血清白蛋白，所述人 血清白蛋白的含量優(yōu)選為〇. 005 %~2. 0 %，進一步優(yōu)選為0. 01 %~1. 0 %，按質量計。
[0016] 作為優(yōu)選的，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有海藻糖和/或DM0G ;所 述海藻糖的含量優(yōu)選為0.01%~2%，進一步優(yōu)選為0. 1%~1%，按質量計；所述DM0G的 含量為l〇nM~2000nM，優(yōu)選為50~500nM。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 我們開發(fā)的培養(yǎng)基在E8基礎上將bFGF濃度由100ng/ml降低至最低lng/ml， TGFB1濃度由2ng/ml降低至最低0. lng/ml，不使用ActivinA，加入肝素鈉，外加極微量BMP 抑制劑，該培養(yǎng)基我們命名為BioCI (含肝素鈉）系列，此培養(yǎng)基為無feeder無動物源性培 養(yǎng)基，在96孔板中每孔種2000個hiPSC，其增殖速度為E8的3倍（種4000個hiPSC時，E8 增殖速度略高于BioCI)，當去除BioCI中的肝素鈉時，2000個起始細胞量的96孔板hiPSC 便不能增殖，由此可見BioCI可以有效的進行低密度或正常密度hiPSC維持培養(yǎng)。當向 BioCI 分別加入 BSA 或 Chemically Defined Lipid Concentrate/HSA/海藻糖時（前者成 為BioCISO系列，后者稱為BioCISH系列），培養(yǎng)基在低密度和普通密度進行hiPSC培養(yǎng)時， 增殖速度更高，細胞形態(tài)和多能性維持的更好，而BioCISO和BioCISH的成本僅相當于E8 的三分之一，也不需要使用昂貴的硫酸乙酰肝素，極大的降低了成本，并且能夠滿足現階段 幾乎所有的hiPSC維持培養(yǎng)，以及加入各種小分子化合物進行誘導重編程培養(yǎng)（去除TGFB1 和BMP信號通路抑制劑）或者誘導分化培養(yǎng)，同時BioCI系列培養(yǎng)基已經能夠很好地滿足 hiPSC的單細胞存活和生長，其單細胞存活率較mTeSRl高出3. 5倍，而E8的單細胞存活率 為0,因此該培養(yǎng)基將適合各基礎科研、臨床科研實驗的廣泛研究。
[0019] 本發(fā)明首次在使用肝素鋰，將其替代肝素鈉或與肝素鈉混合使用，該培養(yǎng)基我們 命名為BioCII (含肝素鋰）系列，使用BioCII系列培養(yǎng)基（包含不添加以及添加BSA或 Chemically Defined Lipid Concentrate/HSA/海藻糖的 BioCII、BioCIIS0、BioCIISH)培 養(yǎng)hiPSC，hiPSC在低密度和普通密度進行培養(yǎng)的速度更快（較mTeSRl高出1. 1倍），多能 性和自我更新能力更強，單細胞的存活率更高（較mTeSRl高出4. 5倍）。
[0020] 此外，為了獲得更高的hiPSC單細胞存活率，本發(fā)明的部分培養(yǎng)基配方添加了 DM0G，使hiPSC在單細胞條件下的存活效率極大地提高（較mTeSRl高出200倍以上），為基 因打靶改造hiPSC以及其他應用提供了重要的工具。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :表1第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0022] 圖2 :表1第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性標 記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果；
[0023] 圖3 :表2第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0024] 圖4 :表2第4組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性標 記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果；
[0025] 圖5 :表6第5組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0026] 圖6 :表6第5組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性標 記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果；
[0027] 圖7 :表8第6組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0028] 圖8 :表8第6組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性標 記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果；
[0029] 圖9 :表9第16組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0030] 圖10 :表9第16組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性 標記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果；
[0031] 圖11 :表13第7組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行核型鑒定的圖；
[0032] 圖12 :表13第7組培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細胞HN4 50代后，進行流式檢測多能性 標記物（Marker) (0ct4、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-80) FACS 鑒定結果。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0034] -、以下實施例中所用的到的試劑如下所示：
[0035] DMEM/F-12 培養(yǎng)基（1:1 基礎培養(yǎng)基），碳酸氫鈉（NaHC03, CAS 號 144-55-8)，L-抗 壞血酸-2 磷酸儀（L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium，CAS 號：113170-55-1)， 亞硒酸鈉（Sodium selenite，CAS 號：10102-18-8)，重組人胰島素（insulin，CAS 號： 11061-68-0)，人脫鐵轉鐵蛋白（transferrin，CAS號：11096-37-0)，堿性成纖維細胞 生長因子（bFGF)，轉化生長因子 betal (TGFB1)，Dorsomorphin dihydrochloride (CAS 號：1219168-18-9)，Chemically Defined Lipid Concentrate (Gibco,貨號 11905-031)，牛 血清白蛋白（BSA)，重組人血清白蛋白（HSA)，海藻糖（CAS號：6138-23-4)，肝素鈉Ofeparin sodium salt，CAS 號：9041-〇8_1)，肝素裡（Heparin lithium salt, CAS 號：9045-22_1) 〇
[0036] 二、檢測以下各實施例的培養(yǎng)基對單細胞人多能干細胞的存活效果的影響可采用 如下方法：
[0037] 1、MTT 法：
[0038] 消化、計數好細胞后，用培養(yǎng)基母液吹勻細胞，鋪到96孔板中，每個孔中種2000個 細胞，種5個復孔，然后分別補入對應的培養(yǎng)基至終體積150ul，每天都要換相應的培養(yǎng)基， 細胞放置37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。dayl，day5測MTT值：
[0039] 2、AP 染色法
[0040] 消化、計數好細胞后，用培養(yǎng)基母液吹勻細胞，鋪到96孔板中，每個孔中種1個細 胞，每組種2000個單細胞孔，然后分別補入對應的培養(yǎng)基至終體積150ul，培養(yǎng)基中加入 0. 5uM thiazovivin(后續(xù)的培養(yǎng)基中都不添加thiazovivin)。細胞放置37°C，5% (302培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前2~3天，不換液，day4~daylO是隔一天換液，dayll~dayl4,每天換液， day 15AP染色檢測單克隆數量。
[0041] 三、通過核型鑒定及流式檢測多能性標記物（Marker)檢測利用本發(fā)明培養(yǎng)基長 期培養(yǎng)人IPSC超過50代的情況下，是否能良好地維持人IPSC的染色體穩(wěn)定、多能性以及 自我更新能力。
[0042] ( -）核型鑒定方法：
[0043] 1 ?實驗試劑：
[0044] 20 y g/ml 秋水仙素；PBS ;生理鹽水；0? 25% trypsin ;0? 075M氯化鉀溶液；MEF ;卡 諾固定液；Giemsa染色液；3% Tris。
[0045] 2.實驗用品：
[0046] 37°C恒溫培養(yǎng)箱；移液槍（100 y 1，1ml);低速離心機；恒溫水浴鍋；載玻片；膠頭 滴管；烘箱；酸缸；染色缸；顯微鏡。
[0047] 3?實驗步驟
[0048] 3. 1細胞準備
[0049] 生長狀態(tài)良好，去feed，無分化，生長密度在80~90%之間。
[0050] 3. 2秋水仙素處理
[0051] 培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基的量加入濃度為20 y g/ml的秋水仙素，使其終濃度為 0. 2 y g/ml，37°C培養(yǎng)箱中處理100~130min(時間根據不同細胞有所不同，本實驗室一般 小鼠ips細胞處理時間為60min，人ips細胞處理130min)。
[0052] 3. 3低滲處理
[0053] 秋水仙素處理完后，先吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，加入0. 5ml0. 25%胰酶消化，輕 輕敲打培養(yǎng)皿，使未脫落的細胞脫落，加入lmlMEF終止消化，用吸管吸取轉移入15ml離心 管，離心（1200rpm，5min)，收集細胞。然后加入37°C預熱的0.075mol/LKCL溶液7ml，用吸 管吹打成細胞懸液，置37°C水浴處理18-28min(根據不同細胞有所不同，本實驗室一般小 鼠ips細胞低滲28-30分鐘，人ips細胞低滲18-20分鐘）。
[0054] 3. 4預固定
[0055] 新鮮配制卡諾固定液（甲醇冰醋酸3:1配制），用膠頭滴管加入約1ml固定液進行 預固定3min 〇
[0056] 3. 5 固定
[0057] 預固定后，1200r/min離心5min，棄上清，加入約7ml新鮮的固定液，用膠頭滴管輕 輕打勾，于37°C水浴固定40min。
[0058] 3. 6 滴片
[0059] 固定完成后，1200r/min離心5min，然后用膠頭滴管吸棄大部分固定液，留部分固 定液（根據細胞的量確定留液多少）重懸細胞，距離載玻片30cm左右距離滴片。注意使用 冰凍干凈的載玻片進行滴片。
[0060] 3. 7 烤片
[0061] 滴片后馬上把載玻片移進75°C烘箱烘3h。
[0062] 3. 8染色（G顯帶）
[0063] 往551111生理鹽水加入0.038胰酶粉，輕輕搖勻，用3%1^18調節(jié)其？11約為7.2。 將制片放入胰酶消化液處理8秒后，迅速放入生理鹽水終止其消化，再放入Giemsa染液染 色5~lOmin,然后用鑷子夾出玻片，用自來水輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風吹干。
[0064] 3. 9 鏡檢
[0065] 待玻片干后，在顯微鏡下檢查，先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀 察。
[0066] 3. 10分析（對染色體數目，帶型進行分析）
[0067] (二）流式檢測多能性多能性標記物（Marker):
[0068] 1.用0. 25%胰酶消化細胞，離心，之后用PBS重懸細胞，轉移到1. 5ml的EP管中。
[0069] 2?加入 200ull%多聚甲醛，37°C，5-10min。
[0070] 3?離心，用PBS洗1次，之后加入200ul90%甲醇，冰上30min.(甲醇要先預冷）。
[0071] 4?離心，用 PBS 洗 2 次。加一抗（抗體 1 :50 稀釋），加 50ul，37°C，30min。
[0072] 5?離心，用 PBS 洗 1-2 次，加二抗（抗體 1 :500 稀釋），加 100ul，37°C，30min，加 二抗要避光。
[0073] 6?用PBS洗1次，之后用300ulPBS重懸，過濾，上機，收488 (綠色）或568 (紅色） 陽性細胞。
[0074] 下面開始檢測本發(fā)明不同的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基對單細胞人多能干細 胞的培養(yǎng)效果，以E8和mTeSRl培養(yǎng)基作為對照。
[0075] 四、以下實施例中各組培養(yǎng)基的制備方法：
[0076] 稱取基礎培養(yǎng)基DMEM/F12粉末，用超純水將其完全溶解；稱取其他各成分，分別 溶解，調節(jié)好pH值，逐一加入基礎培養(yǎng)基中；冰上攪拌，充分混勻后定容，調節(jié)滲透壓，過濾 滅菌，分裝，一 l〇°C以下保存。
[0077] 實施例 1 (BioC I )
[0078] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表1所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0079] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC 50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第4組培養(yǎng)基的檢測結果如圖1和圖2所示。
[0080] 表1無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0081]
[0083] 以上實驗數據表明：在培養(yǎng)基中添加肝素鈉可以促進人iPSC (包括ESC和iPSC) 的增殖速度及單細胞存活率。
[0084] 實施例 2 (BioC II )
[0085] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表2所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0086] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第4組培養(yǎng)基的檢測結果如圖3和圖4所示。
[0087] 表2無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0088]
[0090] 以上實驗數據表明：在培養(yǎng)基中添加肝素鋰可以促進人iPSC (包括ESC和iPSC) 的增殖速度及單細胞存活率。
[0091] 實施例 3(BI0C I /BIOC II )
[0092] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表3所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0093] 表3無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0094]
[0096] 以上實驗數據表明：肝素鈉和肝素鋰配合使用同樣可以促進人iPSC (包括ESC和 iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0097] 實施例 4(BI0C I -2)
[0098] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表4所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0099] 表4無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0100]

[0102] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加碳酸氫鈉和Dorsomorphin dihydrochloride 可以促進人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0103] 實施例 5(BioC I -3)
[0104] 本實施例檢測培養(yǎng)基中各組分的濃度改變對培養(yǎng)基性能的影響。根據MTT法和AP 法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0105] 表5無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0106]

[0108] 以上實驗數據表明：本發(fā)明的培養(yǎng)基在L-抗壞血酸-2磷酸鎂60~70 y g/ml，亞 硒酸鈉10~20ng/ml，重組人胰島素15~25 y g/ml，人脫鐵轉鐵蛋白5~15 y g/ml，堿性 成纖維細胞生長因子1~100ng/ml，轉化生長因子-betal 0? 1~2. Ong/ml，肝素鈉1~ 400ng/ml，碳酸氫鈉500~600 y g/ml ;BMP信號通路抑制劑10~500nM的濃度范圍內，均 可以促進人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0109] 實施例 6(BioC I SO)
[0110] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表6所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0111] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC 50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第5組培養(yǎng)基的檢測結果如圖5和圖6所示。
[0112] 表6無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0115] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加牛血清白蛋白可以顯著提高人iPSC(包括ESC 和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0116] 實施例 7(BI0C I SH3S，BioC II SH3S)
[0117] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表7所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0118] 表7無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0121] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加Chemically Defined Lipid Concentrate可以 顯著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0122] 實施例 8(BioC II SH)
[0123] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表8所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0124] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC 50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第5組培養(yǎng)基的檢測結果如圖7和圖8所示。
[0125] 表8無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0128] 以上實驗數據表明：Chemically Defined Lipid Concentrate和重組人血清白蛋 白組合使用可以促進人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0129] 實施例9
[0130] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表9所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0131] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC 50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第15組培養(yǎng)基的檢測結果如圖9和圖10所示。
[0132] 表9無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0135] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加海藻糖和DMOG(nM)可以顯著提高人iPSC(包括 ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0136] 實施例10
[0137] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表10所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0138] 表10無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方


[0142] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加海藻糖和DM0G，配合碳酸氫鈉、Dorsomorphin dihydrochloride使用可以顯著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活 率。
[0143] 實施例11
[0144] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表11所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0145] 表11無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方
[0147]
[0148] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加海藻糖和DM0G配合牛血清白蛋白使用可以顯 著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0149] 實施例12
[0150] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表12所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0151] 表12無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0154] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加海藻糖和DM0G配合Chemically Defined Lipid Concentrate使用可以顯著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖速度及單細胞存活率。
[0155] 實施例13
[0156] 本發(fā)明提供的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基的其中一個方案，各培養(yǎng)基的配方如 表13所示。根據MTT法和AP法檢測單細胞人iPSC在各培養(yǎng)基中的存活率。
[0157] 利用以下各組培養(yǎng)基培養(yǎng)人iPSC 50代后，對人iPSC進行核型鑒定及流式檢測多 能性Marker，第7組培養(yǎng)基的檢測結果如圖11和圖12所示。
[0158] 表13無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基配方

[0161] 以上實驗數據表明：培養(yǎng)基中添加海藻糖、DMOG、Chemically Defined Lipid Concentrate配合重組人血清白蛋白使用可以顯著提高人iPSC (包括ESC和iPSC)的增殖 速度及單細胞存活率。
[0162] 以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領域技術人員來說，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。
【主權項】
1. 一種無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其含有如下組分：L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒 酸鈉、重組人胰島素、人脫鐵轉鐵蛋白、堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子betal、肝 素鋰和/或肝素鈉、及DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基。2. 根據權利要求1所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層 人多能干細胞培養(yǎng)基中各組分的含量為：L-抗壞血酸-2磷酸鎂60~70 μ g/ml，亞硒酸鈉 10~20ng/ml，重組人胰島素15~25 μ g/ml，人脫鐵轉鐵蛋白5~15 μ g/ml，堿性成纖維 細胞生長因子1~l〇〇ng/ml，轉化生長因子-betal 0.1~2.0 ng/ml，肝素鋰1~600 ng/ ml和/或肝素鈉1~400 ng/ml，DMEM/F-12基礎培養(yǎng)基補足至1L。3. 根據權利要求1所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉化生長 因子betal可替換為作用于相同受體和同樣具備維持人多能干細胞自我更新能力、多能性 以及未分化狀態(tài)，抑制其自發(fā)分化功能的細胞因子，例如Nodal。4. 根據權利要求1-3任一項所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述 培養(yǎng)基的滲透壓調節(jié)至280~350 mosmol/liter。5. 根據權利要求1-4任一項所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述 人多能干細胞基礎培養(yǎng)基中還含有碳酸氫鈉和/或BMP信號通路抑制劑，所述BMP信號通 路抑制劑優(yōu)選為 Dorsomorphin dihydrochloride、DMH-1、Noggin、LDN-193189 中的至少一 種。6. 根據權利要求5所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述人多能干 細胞基礎培養(yǎng)基中碳酸氫鈉含量優(yōu)選為500~600 μ g/ml ;BMP信號通路抑制劑的含量優(yōu) 選為10~500 nM。7. 根據權利5所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層人多 能干細胞培養(yǎng)基中還含有牛血清白蛋白，含量優(yōu)選為〇. 05%~4%，按質量計。8. 根據權利要求5所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述無飼養(yǎng) 層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有Chemically Defined Lipid Concentrate，含量優(yōu)選為 0. 01%~2. 0%，按體積計。9. 根據權利要求8所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層 人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有人血清白蛋白，所述人血清白蛋白的含量優(yōu)選為〇. 05%~ 4%，按質量計。10. 根據權利要求1-4、6-9任一項所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在 于，所述無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有海藻糖和/或DM0G ;所述海藻糖的含量為 0. 01%~2%，按質量計；所述DM0G的含量為10nM~2000nM。11. 根據權利要求5所述的無飼養(yǎng)層人多能干細胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述無飼養(yǎng)層 人多能干細胞培養(yǎng)基中還含有海藻糖和/或DM0G ;所述海藻糖的含量優(yōu)選為0. 01%~2%， 按質量計；所述DM0G的含量優(yōu)選為10nM~2000 nM。
【文檔編號】C12N5/074GK106032527SQ201510117121
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發(fā)明人】王淋立, 陳月花, 宋立兵
【申請人】廣州市搏克腫瘤研究所, 王淋立