一種耐油污微藻的高通量篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微藻篩選領(lǐng)域，具體設(shè)及一種高通量篩選耐油污微藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 來源于生活污水、石油泄露、溢油及石油工業(yè)化學(xué)制品等的油污，是水體富營(yíng)養(yǎng)化 重要的有機(jī)污染源。因此，油污水處理是水質(zhì)保護(hù)和治理的一個(gè)重要目標(biāo)。在消減工業(yè)油污 水排放、生活污水治理等領(lǐng)域，將耐油微藻或可利用油污組分的微藻接種到油污水中，一方 面微藻的增殖利用可消減油污，另一方面增殖的微藻生物量可W用于開發(fā)進(jìn)一步的生物質(zhì) 應(yīng)用。而篩選合適的微藻是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，其中，微藻對(duì)油污的耐受性分析是一個(gè)重要方 法。
[0003] 但是，油污水是一類復(fù)雜的多源性污染物，來源于生活污水的、石油開采慢漏的、 突發(fā)性溢油的、石油化工的污染排放的、或其他生產(chǎn)勞動(dòng)過程中排放的油污，其組分在各時(shí) 間、各案例中都可能各不相同；同時(shí)，油污染濃度的不同，也對(duì)微藻增殖造成不同影響。另 夕h自然界中的微藻種類繁多，不同種類的微藻，受復(fù)雜多樣的油污染源影響時(shí)，其細(xì)胞增 殖、生理生化參數(shù)變化特征都是不同的；在不同季節(jié)、不同營(yíng)養(yǎng)鹽環(huán)境條件、不同的起始生 物量對(duì)油污染的響應(yīng)差異也顯著不同。
[0004] 可見，在篩選耐油污微藻時(shí)，需設(shè)置油污染和微藻的多維度互作實(shí)驗(yàn)組，因此，篩 選和分析時(shí)，在方法學(xué)上具有顯著的復(fù)雜性，常出現(xiàn)大量實(shí)驗(yàn)組W及產(chǎn)生復(fù)雜的數(shù)據(jù)關(guān)系， 工作量大，數(shù)據(jù)量大且關(guān)系復(fù)雜，從而易造成結(jié)論的不確定性、W及篩查范圍、篩查對(duì)象局 限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明提供了一種高通量篩選耐油污微藻的方法，可W高效的篩查高通量篩選耐 油污微藻從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明的方法，包括如下的步驟：
[0007] 1)首先，分別將待檢測(cè)的已經(jīng)純化的單種微藻，分別加入到已添加不同濃度的待 檢測(cè)油水的培養(yǎng)基中進(jìn)行微藻的增殖培養(yǎng)作為耐油污檢測(cè)組;并設(shè)置2-6個(gè)平行樣；
[0008] 2)同時(shí)，將對(duì)應(yīng)微藻分別加入無油污的正常微藻培養(yǎng)基中，在相同條件下進(jìn)行微 藻的增殖培養(yǎng)，作為空白對(duì)照組;設(shè)置2-6個(gè)平行樣；
[0009] 3)對(duì)全部微藻在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行一次培養(yǎng)方式的增殖培養(yǎng)，對(duì)微藻生物量 變化進(jìn)行每天連續(xù)檢測(cè)，獲得各組每天的生物量變化數(shù)據(jù)；
[0010] 4) 一次培養(yǎng)結(jié)束后，利用Simca-P計(jì)算機(jī)軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA);
[0011] 5)結(jié)果的判別
[001引根據(jù)PCA圖分析，與空白對(duì)照組明顯分開的微藻為受到對(duì)應(yīng)油污染影響嚴(yán)重的種 類，為不耐油污種類;與空白對(duì)照組不能分開或分開無顯著性的，為耐油污種類。
[0013]所述的微藻，指來源于淡水、海水、咸水或其他水域環(huán)境中的、已經(jīng)純化的可培養(yǎng) 的單細(xì)胞自養(yǎng)微藻或具有異養(yǎng)能力的微藻；
[0014] 所述的油污水，指各種來源的油污染水，包括生活污水、石油工業(yè)污水來源的石油 化學(xué)品油污水、特殊勞動(dòng)或生產(chǎn)工藝過程中排放的油污水等;或已經(jīng)明確化學(xué)成分的油污 水；
[0015] 所述培養(yǎng)基，指常用適宜微藻增殖的培養(yǎng)基，如f/2培養(yǎng)基，或在培養(yǎng)介質(zhì)中添加 利于特異微藻正常增殖營(yíng)養(yǎng)需求的培養(yǎng)基；
[0016] 所述導(dǎo)入Simca-p軟件的數(shù)據(jù)整理，指將觀測(cè)的生物量數(shù)據(jù)作為X變量，實(shí)驗(yàn)組別 信息作為Y變量，導(dǎo)入Simca-p軟件。
[0017] 本發(fā)明的方法，可W在篩選實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)微藻和油污水的特征，設(shè)置足夠多的實(shí)驗(yàn) 組別:構(gòu)建微藻種類、不同起始密度與油污水不同處理、不同濃度在不同培養(yǎng)條件下的多維 度相互關(guān)系實(shí)驗(yàn)組，應(yīng)用Simca-p軟件的大數(shù)據(jù)分析能力，從而可W確定出典型條件下耐受 油污的微藻。
【附圖說明】
[0018] 圖1:4個(gè)微藻在4種石油化學(xué)品3個(gè)濃度下的生物量變化圖；
[0019] 圖2:微藻對(duì)不同石油化學(xué)品響應(yīng)的PCA圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 在透明多孔培養(yǎng)板上，將待檢測(cè)的不同油污水制備的油水培養(yǎng)基，與不同目標(biāo)微 藻混合，形成油污實(shí)驗(yàn)組;將對(duì)應(yīng)微藻接種至適宜微藻增殖的無油污微藻培養(yǎng)基中，作為空 白對(duì)照組，在相同的環(huán)境條件下，進(jìn)行一次培養(yǎng)。每天檢測(cè)各培養(yǎng)孔中68化m或?qū)?yīng)微藻吸 收峰值處的吸光值，對(duì)微藻生物量變化進(jìn)行連續(xù)跟蹤。收集全部數(shù)據(jù)后，利用Simca-p計(jì)算 機(jī)軟件(>12，1]1116化；!^3,5￥6(16]1)對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析?！?):將觀測(cè)值(吸光值或?qū)?應(yīng)的生物量值)作為X變量，實(shí)驗(yàn)組別信息作為Y變量，導(dǎo)入Simca-p，選用CTR Scanning模 式，運(yùn)行程序。從得到的PCA中，分析油污組與對(duì)照組之間的差異顯著性:油污實(shí)驗(yàn)組與空白 對(duì)照組顯著分開的微藻，表示該微藻受油污影響大，不耐受油污；油污實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照 組不能分開的，表示該微藻不受油污影響，為耐油污微藻。
[0021] 根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)的微藻正常增殖的需要，可W將多孔培養(yǎng)板置換成小體積培養(yǎng)瓶， 則檢測(cè)生物量時(shí)，可將直接讀取多孔板上的吸光值改為取樣檢測(cè)細(xì)胞數(shù)、吸光值或其他可 表征生物量變化的定量指標(biāo)。
[0022] 實(shí)施例1:
[0023] 1)將4種純化培養(yǎng)的海洋微藻，包括:柔弱角刺藻、球等鞭金藻、東海原甲藻、劇毒 卡羅藻，正常培養(yǎng)至指數(shù)期;將待檢測(cè)的油水樣品（雙酪、對(duì)苯二甲酸、對(duì)二甲苯)溶于f/2藻 類培養(yǎng)基中，形成濃度分別為0.1 ppm、Ippm和lOppm的油水培養(yǎng)基;將油水培養(yǎng)液與藻液按 照1:1比例分別置于24孔板中，開多成油污終濃度為0.05ppm、0.5ppm和5ppm油藻混合液，各處 理各2平行。
[0024] 2)同期，將不同種微藻分別對(duì)應(yīng)加至無添加油水樣品的f/2培養(yǎng)基，作為空白對(duì)照 組，各2平行；
[0025] 3)將24孔板置于溫度為18-20°C，光照為35-85皿ol/m2 · S化:D = 12h:12h)的培養(yǎng) 室中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0026] 4)在一次培養(yǎng)過程中，每天用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各藻液在680nm波長(zhǎng)處吸光值變 化；
[0027] 5)收集全部數(shù)據(jù)后，指將觀測(cè)的生物量數(shù)據(jù)作為X變量，實(shí)驗(yàn)組別信息作為Y變量， 導(dǎo)入Simca-P軟件。利用Simca-P計(jì)算機(jī)軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)。原始數(shù)據(jù)見 下表。
[002引
[0029]
[0030]
[0031] 6)結(jié)果的判別
[0032] 利用Excel數(shù)據(jù)分析，獲得4個(gè)微藻在4種石油化學(xué)品3個(gè)濃度下的生物量變化情況 如圖1所示。從圖1可見，柔弱角刺藻(Chaetoceros debilis)在不同實(shí)驗(yàn)濃度的巧巾石油化 學(xué)品影響下，增殖程度有差異，對(duì)于高濃度（5ppm)石油化學(xué)品增殖影響不顯著，低濃度 (0.05ppm)影響下，并沒有促進(jìn)其增殖;而中濃度(0.5ppm)影響下，雙酪促進(jìn)其增殖，其他兩 種石油化學(xué)品對(duì)二甲苯，對(duì)苯二甲酸對(duì)其有不同程度的抑制影響。球等鞭金藻（Isocrysis ga化ana)對(duì)于高濃度(5ppm)石油化學(xué)品增殖影響波動(dòng)較大，中，低濃度(0.5ppm和0.05ppm) 影響相似，對(duì)二甲苯和對(duì)苯二甲酸對(duì)其有不同程度促進(jìn)影響，而雙酪有一定程度抑制增殖 影響。對(duì)于兩種甲藻，東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense)和劇毒卡羅藻 化arlodinium veneficum)對(duì)于不同濃度石油化學(xué)品影響有一定相似性:高濃度(5ppm)對(duì) 于增殖影響波動(dòng)較大，而中，低濃度(0.5ppm和0.05ppm)影響相似，3種石油化學(xué)品對(duì)其增殖 都有一定抑制作用。
[0033] 但是，油污與微藻之間的明確關(guān)系并不能一目了然，沒有判定結(jié)論。利用Simca-P 數(shù)據(jù)分析軟件得到的PCA圖如圖2。相對(duì)于空白對(duì)照組，同一種微藻對(duì)不同石油化學(xué)品響應(yīng) 存在差異，柔弱角刺藻受對(duì)苯二甲酸影響與對(duì)照組無明顯差異，而雙酪、對(duì)二甲苯則影響明 顯；球等鞭金藻受對(duì)二甲苯影響與對(duì)照組無明顯差異，而雙酪、對(duì)苯二甲酸則影響顯著，不 與對(duì)照聚在一起。東海原甲藻受對(duì)二甲苯影響與對(duì)照組無明顯差異，而雙酪、對(duì)苯二甲酸則 影響明顯。劇毒卡羅藻受雙酪、對(duì)二甲苯、對(duì)苯二甲酸影響與對(duì)照組均有明顯差異，說明3種 石油化學(xué)品對(duì)該藻均具有顯著影響。因此，通過設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組及其對(duì)照組，利用該大數(shù)據(jù)分 析軟件，可W判定:柔弱角刺藻為對(duì)苯二甲酸耐受微藻，球等鞭金藻和東海原甲藻為對(duì)二甲 苯耐受微藻，而劇毒卡羅藻對(duì)巧巾微藻均不耐受。
[0034]上述的結(jié)果表明本發(fā)明的方法可W有效的篩選出耐受油污的微藻。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高通量篩選耐油污微藻的方法，其特征在于，所述的方法，包括如下的步驟： 1) 首先，分別將待檢測(cè)的已經(jīng)純化的單種微藻，分別加入到已添加不同濃度的待檢測(cè) 油水的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)作為耐油污檢測(cè)組； 2) 同時(shí)，將對(duì)應(yīng)微藻分別加入無油污的微藻培養(yǎng)基中，在相同條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)，作 為空白對(duì)照組； 3) 對(duì)全部微藻在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行一次培養(yǎng)方式的增殖培養(yǎng)，對(duì)微藻生物量變化 進(jìn)行每天連續(xù)檢測(cè)，獲得各組每天的生物量變化數(shù)據(jù)； 4) 一次培養(yǎng)結(jié)束后，利用Simca-P計(jì)算機(jī)軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA); 5) 結(jié)果的判別 根據(jù)PCA圖分析，與空白對(duì)照組明顯分開的微藻為受到對(duì)應(yīng)油污染影響嚴(yán)重的種類，為 不耐油污種類;與空白對(duì)照組不能分開或分開無顯著性的，為耐油污種類。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的耐油污檢測(cè)組和空白對(duì)照組設(shè)置2-6 個(gè)平行樣。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微藻可培養(yǎng)的單細(xì)胞自養(yǎng)微藻或具有 異養(yǎng)能力的微藻。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油污水，指各種來源的油污染水，包括 生活污水、石油工業(yè)污水來源的石油化學(xué)品油污水、特殊勞動(dòng)或生產(chǎn)工藝過程中排放的油 污水等;或已經(jīng)明確化學(xué)成分的油污水。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為適宜微藻增殖的培養(yǎng)基。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為在培養(yǎng)介質(zhì)中添加利于特異 微藻正常增殖營(yíng)養(yǎng)需求的培養(yǎng)基。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的導(dǎo)入Simca-P軟件的數(shù)據(jù)整理，指將觀 測(cè)的生物量數(shù)據(jù)作為X變量，實(shí)驗(yàn)組別信息作為Y變量，導(dǎo)入Simca-P軟件。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量篩選耐油污微藻的方法，可以高效的篩查高通量篩選耐油污微藻。本發(fā)明利用小體積微藻培養(yǎng)方法，在微藻一次培養(yǎng)過程中，采集微藻增殖全過程數(shù)據(jù)，應(yīng)用大數(shù)據(jù)分析軟件Simca-P，對(duì)根據(jù)不同需要設(shè)置的不同條件組合的油-藻互作關(guān)系進(jìn)行分析，通過運(yùn)行軟件分析獲得的PCA圖，能得到明確的篩選結(jié)論。本發(fā)明的方法，可以在篩選實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)微藻和油污水的特征，設(shè)置足夠多的實(shí)驗(yàn)組別：構(gòu)建微藻種類、不同起始密度與油污水不同處理、不同濃度在不同培養(yǎng)條件下的多維度相互關(guān)系實(shí)驗(yàn)組，應(yīng)用Simca-P軟件的大數(shù)據(jù)分析能力，從而可以確定出典型條件下耐受油污的微藻。
【IPC分類】C02F3/32, C12Q1/04, C12R1/89, C02F103/34
【公開號(hào)】CN105543324
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610041317
【發(fā)明人】楊小倩, 周成旭, 耿沙沙, 葉央芳, 駱其君, 嚴(yán)小軍, 蔣瑩, 馬斌
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月21日