Cmp?乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶打靶載體、載體轉(zhuǎn)導的異種移植用轉(zhuǎn)基因動物及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種CMP?乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體、一種載體轉(zhuǎn)導的異種移植用轉(zhuǎn)基因動物及其制造方法。KCTC 12439BP20130702
【專利說明】
CMP-乙醜神經(jīng)氨酸哲化酶打卽載體、載體轉(zhuǎn)導的異種移植用 轉(zhuǎn)基因動物及其制造方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的打祀載體、引入該載體的用于異種移 植的轉(zhuǎn)基因動物及其制造方法。
【背景技術】
[0002] 根據(jù)（韓國）國立臟器移植管理中屯、化orean Network for Organ化aring， KNOS)，在韓國每年通常有約20,000位患者等待進行器官移植，但是據(jù)報道，捐贈器官的實 際數(shù)量甚至少于器官移植所需的10%。而在美國，器官移植的等待名單上的患者數(shù)量每16 分鐘增加一位，同時每天在等待名單上有11位患者如果不接受所需的器官移植就將面臨死 亡。在此方面，生命科學技術的發(fā)展就成為異種移植技術發(fā)展的背景。
[0003] 動物遺傳學的持續(xù)發(fā)展使得能產(chǎn)生商業(yè)上可用的轉(zhuǎn)基因動物，所述轉(zhuǎn)基因動物經(jīng) 由特定基因的去除或插入對其每一個基因都進行功能驗證。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法的實例 包括:使用顯微注射或病毒感染的隨機基因操作法，和使用胚胎干細胞或體細胞的打祀特 定基因的基因打祀方法。
[0004] 顯微注射法是將外源DNA插入到受精卵原核中的常規(guī)方法，已經(jīng)廣泛用于制造轉(zhuǎn) 基因動物化arbers et al.,化ture,293(5833):540-2,1981;化mmer et al.,化ture,315 (6021):680-683,1985；van Berkel et al.,Nat.Biotechnol.,20(5):484-487,2002； Damak et al. , Biotechnology (NY), 14(2): 185-186,1996)。但是，來源于受精卵（其中經(jīng)由 顯微注射插入了外源DNA)的存活的轉(zhuǎn)基因卵母細胞的效率非常低，僅達到2%至3%(Clark et al. ,Transgenic Res. ,9:263-275,2000)，并且不能調(diào)節(jié)外源基因要被插入的位置或去 除其中特定的內(nèi)源基因。
[0005] 病毒感染法也廣泛用于操作動物基因（5〇1'1曰]10 6131.,66]163〇6￥.,1(4):366- 375，1987;Hirata et al.，Cloning stem Cells,6(1):31-36,2004)。在病毒感染法中，通 過病毒載體引入要被插入的基因作為動物基因，因此運種方法比顯微注射法更有效，但是 運種方法仍然不能將外源基因插入到特定位置或去除其中的特定內(nèi)源基因。此外，要插入 的基因的最大尺寸被限制為7kb，因此病毒所表達的蛋白成為一個問題（Wei et al.， Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,37:119-141,1997；Yanez et al.,Gene Ther.,5(2):149- 159,1998)。
[0006] 為了克服上述問題，可使用能去除或插入特定基因的基因打祀技術?；虼蜢爰?術首先用在使用小鼠胚胎干細胞進行基因功能的研究中。通過同源重組將小鼠胚胎干細胞 (其中打祀了特定基因）插入到處于胚泡期的胚胎中，能產(chǎn)生對特定基因進行了基因操作的 存活的卵母細胞。通過對小鼠胚胎干細胞采用基因打祀方法，產(chǎn)生了其中大量特定基因中 革己的小鼠胚胎干細胞（Brandon et al.,Cu;r;r.Biol.,5(6):625-6：34,1995;Capecchi et al..Science,244(4910):1288-1292,1989；Thompson et al.,Cell,56(2):313-321,1989； 化manaka et al.,Hum.Mol.Genet.,9(3):353-361,2000;Thomas et al.,Cell,51(3): 503-512，1987;te Riele et al.'Proc.化tl.Acad.Sci.USA,89(11):5182-5132,1992; Mansour et al.,化ture,336(6197):348-352,1988;Luo et al.,Oncogene,20(3):320- 328.2001) 。當基因打祀方法應用于家畜時，可使用動物生物反應器，或通過去除參與免疫 排斥應答的特定基因或過表達特定位置上的基因，產(chǎn)生能用于異種移植的疾病模型動物， 并且預期運些疾病模型動物將在工業(yè)方面帶來巨大的經(jīng)濟效益。
[0007] 在產(chǎn)生基因中祀的動物中，認為使用胚胎干細胞的必需的。然而，盡管在包括豬和 牛的家畜中已經(jīng)報道了與胚胎干細胞類似的細胞系(Doetschman et al.,Dev.Biol.,127 (1):224-227,1988;Stice et al.,Biol.Reprod.,54(1):100-110,1996;S址oyan et al., Mol.Reprod.Dev.,36(2):148-158,1993；lannaccone et al.,Dev.Biol.,163(1):288- 292,1994；Pain et al.,Development,122(8):2339-2348,1996；Thomson et al., Proc. Natl.Acad .Sci. USA,92 ( 17 ):7844-7848,1995；Wheeler et al., R邱rod.Fertil.Dev.，6巧）：563-568,1994)，在家畜中使用它們的干細胞仍然受到限制。實 際上，按照作為核供體細胞的一般體細胞可用于基因打祀的建議，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家畜已成為 可能（Bro地y et al.,化t.Biotechnol.,21(2):157-162,2003;Cibelli et al.,Science, 280(5367):1256-1258，1998;Campbell et al.，化ture,380(6569):64-66,1996;Akira Onishi et al., Science ,289；1188-1190,2000Denning et al.,Cloning Stem Cells,3 (4):221-231，2001;McCreath et al.，NaUire，405(6790):1066-1069，2000)。
[0008] 同時，小型豬被認為是異種移植的最佳供應源，因為小型豬在器官大小和生理特 征上與人的器官類似并且考慮到其繁殖力，從而能供應大量器官。
[0009] 豬器官移植的成功在于，是否能克服一系列免疫排斥應答(超急性免疫排斥應答、 急性血管性免疫排斥應答、細胞介導的免疫排斥應答和慢性免疫排斥應答）。據(jù)報道，可通 過去除參與a-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶抗原決定簇合成的基因并且過表達人補體調(diào)芐基因，來 克服在移植之后幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)的超急性免疫排斥應答。
[0010] 具體地，英國PI^L有限公司于2002年首先產(chǎn)生了其中異種去除了 a-1,3-半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶(下文稱為％r)的體細胞克隆豬(Yifan Dai et al.，rfet.Biotechnology，20:251- 255.2002) dGT基因是引起急性免疫排斥應答的基因，當去除該基因時，可開發(fā)出其中消除 了體內(nèi)排斥應答的用于異種移植的疾病模型動物。
[0011] 在2003年，上述公司成功實現(xiàn)了其中去除了 GT基因的體細胞的復制化R專利申請 公開號10-2009-0056922)，從而在生產(chǎn)用于器官移植的疾病模型動物，W解決目前缺乏移 植器官的供應問題中實現(xiàn)了標志性進展(Carol J. Phelps, Science ,299:411-414,2003)。 在2005年，將來源于其中去除了GT基因的克隆豬的器官移植到猴子中，作為結(jié)果報道了在 移植之后，存活下來的猴子維持了2至6個月，而且沒有出現(xiàn)急性免疫排斥應答（Ken ji Kuwaki et al.，化Uire Medicine ,11(1) :29-31,2005)。但是，也有報道指出，即使去除了 GT基因，在器官移植過程中，由于異種抗原通過不同途徑激活人補體基因，也可能出現(xiàn)嚴重 的排斥應答（Tanemura,M.et al. ,Biochem.Biophys.Res.Commun. ,235:359-364,1997; Komoda,H. et al. ,Xenotransplan1:ation, 11: 237-246,2004)。為了解決不利影響，使用了 如下一種方法，該方法生產(chǎn)了在去除了 GT基因的同時能過表達人補體抑制基因（如CD59、衰 變加速因子（下文稱為"DAF")和膜輔助蛋白（下文稱為"MCP"))的克隆豬（Yoichi Takahagi.Molecular Reproduction and Development 71:331-338,2005Cozzi,Eb et al . .Transplant Proc. ,26: 1402-1403, 1994；Fodor,W.L.et a 1 ., Proc.Na11. Acad . Sci. USA 91:1 1 153-1 1 157,1994；Adams,D.H.et al., Xenotransplantation,8:36-40,2001)〇
[0012] 同時，報道了存在于除人之外的大多數(shù)哺乳動物中的N-徑乙酷神經(jīng)氨酸（下文稱 為"Neu5Gc")抗原決定簇，在異種移植過程中也能引起免疫排斥應答(W020061133356A; Pam Tangvoranuntaku1,Proc.化tl.Acad.Soc.USA100:12045-12050,2003;Barbara Bighi即oli，BMC genetics，8:27,2007)。Neu5Gc通過CMAH從N-乙酷神經(jīng)氨酸（下文稱為 "Neu5Ac")轉(zhuǎn)化而來。
[0013] 補體是由參與免疫應答的蛋白組成的蛋白復合物(C1-C9)，并且它們具有:補體結(jié) 合活性，其中補體在形成抗原-抗體復合物時與細菌的細胞膜結(jié)合，從而產(chǎn)生孔桐;和，調(diào)理 素作用，其中補體與抗原-抗體復合物結(jié)合并且促進吞隧作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種調(diào)節(jié)補體活 性的蛋白，運些調(diào)節(jié)蛋白通過防止補體激活或促進被激活的補體的裂解來調(diào)節(jié)補體。存在 于宿主細胞的細胞膜上的DAF可防止C2和C4b之間的結(jié)合，MCP促進C4b的裂解并且防止宿主 細胞中的補體的激活，從而防止補體的激活并且防止宿主細胞被補體破壞。存在于宿主細 胞表面上的CD59可防止C7、C8和巧b6之間的結(jié)合，從而防止膜攻擊復合物的形成。
[0014] 除了調(diào)節(jié)補體活性的基因之外，還報道了通過過表達在異種移植過程中出現(xiàn)的人 CD39基因，可抑制血栓形成（115200800032124，1(日''611，]\1.0.，化6 Journal of Clinical Investigation,113:1440-1446,2004)〇
[0015] 根據(jù)之前的報道，外源基因在它正常表達的位置之外的其它位置上表達，可能引 起胚胎發(fā)育障礙，并且對神經(jīng)系統(tǒng)是致命的，其中神經(jīng)系統(tǒng)主要在胚胎發(fā)育后期和出生之 后早期進行發(fā)育（Gao et al.，Neurochem.Res. ,24(9):1181-1188,1999)。
[0016] KR專利申請公開號10-2009-0104328作為相關文件，設及表達CD70的神經(jīng)干細胞 及其在防止移植中的免疫應答中的應用，并且記載了一種對移植的器官、組織或細胞的免 疫應答有抑制作用的組合物，該組合物包括表達CD70的神經(jīng)干細胞的細胞，W及一種使用 該組合物抑制個體的免疫應答的方法。
[0017] KR專利申請公開號10-2001-0034847作為另一相關文件，設及結(jié)合分子，所述結(jié)合 分子來源于不觸發(fā)補體介導的裂解的免疫球蛋白，其中所述結(jié)合分子作為重組多膚的結(jié)合 分子包含（i)可與祀分子結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和（ii)效應結(jié)構(gòu)域，該效應結(jié)構(gòu)域包括與整個 或部分人免疫球蛋白的重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域具有基本同質(zhì)的氨基酸序列，特征在于，所述結(jié) 合分子可與祀分子結(jié)合，并且沒有嚴重的補體依賴性裂解或祀點的細胞介導的破壞，并且 更優(yōu)選其中的所述效應結(jié)構(gòu)域可與FcRn和/或Fc 丫 Rnb特異性結(jié)合。通常，上述結(jié)合分子是 基于來源于人免疫球蛋白重鏈CH2結(jié)構(gòu)域的兩個或多個結(jié)構(gòu)域的嵌合結(jié)構(gòu)域。在示例性實 施方式中，對結(jié)構(gòu)域233-236和結(jié)構(gòu)域327-331進行改正，超出的殘基使得分子是零異型的 (null allotypic)。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可從適于上述應用的任意供應源誘導成上述分子，例如抗 體、酶、激素、受體、細胞因子或抗原、配體和粘附分子。此外，還公開了核酸、宿主細胞、生產(chǎn) 方法和材料，例如公開了防止B細胞活化、乳腺細胞脫粒和吞隧作用，或防止第二結(jié)合分子 與祀分子結(jié)合的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] [技術問題]
[0019] 由于上述必要性而設計了本發(fā)明，本發(fā)明的目標是提供一種用于異種抗原決定簇 (CMH)合成基因的敲除載體。
[0020] 本發(fā)明的另一目標是使用與常規(guī)打祀載體相比，具有較高效率和準確性的載體， 提供一種轉(zhuǎn)基因的體細胞系。
[0021] 本發(fā)明的又一目標是提供一種由轉(zhuǎn)基因的體細胞系進行核移植而制造的非人的 克隆動物。
[0022] 本發(fā)明的再一目標是提供一種生產(chǎn)移植用異種器官的方法，該方法消除了免疫排 斥，并且包括飼養(yǎng)非人的克隆動物，然后收獲器官。
[002；3][技術方案]
[0024] 為了實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明提供了一種CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的打祀載體，該 打祀載體W相繼順序包括CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的5'臂、PGKneopolyA和CMP-乙酷神經(jīng) 氨酸徑化酶的3'臂。
[0025] 在本發(fā)明的示例性實施方式中，CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的5'臂優(yōu)選包括SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列，但并不限于此。
[00%] 在本發(fā)明的另一示例性實施方式中，口61(]16〇口〇174優(yōu)選包括560 10^:2所示的核 巧酸序列，但并不限于此。
[0027] 在本發(fā)明的又一示例性實施方式中，CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的3'臂優(yōu)選包括 SEQ ID N0:3所示的核巧酸序列，但并不限于此。
[0028] 在本發(fā)明的又一示例性實施方式中，CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的打祀載體優(yōu)選包 括圖4所示的限制酶切圖譜，但并不限于此。
[0029] 此外，本發(fā)明提供了一種制造 CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的敲除細胞的方法，該方 法包括將本發(fā)明的CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的打祀載體和鋒指核酸酶的載體轉(zhuǎn)染到細胞 中。
[0030] 在本發(fā)明的示例性實施方式中，鋒指核酸酶的載體優(yōu)選包括圖1所示的限制酶切 圖譜，但并不限于此。
[0031] 此外，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的方法制造的CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的敲除細 胞。
[0032] 本發(fā)明的上述敲除細胞于2013年7月2日被保藏在位于韓國大田廣域市34141，儒 城區(qū)魚隱桐的韓國生物科學和生物技術研究院基礎設施部，保藏編號為KCTC 12439BP。
[0033] 此外，本發(fā)明提供了一種通過CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶的敲除細胞進行核移植， 制造除人之外的動物的方法。
[0034] 此外，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)移植用異種器官的方法，該方法消除了免疫排斥，并 且包括飼養(yǎng)非人的克隆動物，然后摘除器官。
[0035] 如本文所使用的，術語"基因打祀載體"指能去除祀基因或?qū)㈧牖虿迦氲教囟ɑ?因位置中的載體，并且該載體包含與打祀的特定基因同源的核巧酸序列，W進行同源重組。
[0036] 如本文所使用的，術語"同源"指在對應于第一結(jié)構(gòu)域或第二結(jié)構(gòu)域的基因的核酸 序列的同一性程度，并且具有至少90 %的同一性，優(yōu)選具有95 %或更高的同一性。
[0037] 如本文所使用的，術語"抗原決定簇"指在異種移植時，被受體的免疫系統(tǒng)識別為 抗原的區(qū)域，并且是N-徑乙酷神經(jīng)氨酸（下文稱為"Neu5Gc")，其中N-徑乙酷神經(jīng)氨酸是細 胞表面聚糖。另外"抗原決定簇合成基因"指編碼生物合成抗原決定簇的酶的基因，并且該 酶是參與化u5Gc生物合成的CMP-乙酷神經(jīng)氨酸徑化酶(下文稱為"CMAH")。
[0038] 如本文所使用的，術語"選擇性標記物"用于選擇經(jīng)基因打祀載體轉(zhuǎn)染的細胞，指 呈現(xiàn)可選擇性表型(諸如藥物抗性、營養(yǎng)需要、對細胞毒性劑的抗性和表面蛋白的表達）的 標記物，并且指能通過在經(jīng)選擇性試劑處理的環(huán)境下，僅使表達特定標記物的那些細胞存 活下來，W進行陽性選擇的標記物。另外，"選擇性標記物基因"指編碼陽性選擇性標記物的 基因，例如新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(下文稱為"neo")用于通過呈現(xiàn)抗生素抗性，W便真核細胞能 在添加有抗生素(新霉素)的培養(yǎng)基中存活下來，W選擇在真核細胞中有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞。
[0039] 術語"轉(zhuǎn)化"指將DNA引入到宿主細胞中，并且使得DNA能作為染色體外因子或染色 體整合子進行復制。轉(zhuǎn)化包括能將任意給定的核酸分子引入到有機體、細胞、組織或器官中 的任意方法，并且可使用本領域已知的適用于宿主細胞的任意標準方法來進行轉(zhuǎn)化。為了 將使用質(zhì)粒或非質(zhì)粒裸DNA轉(zhuǎn)化真核細胞與細胞性腫瘤發(fā)生的轉(zhuǎn)化區(qū)分開，常常將上述轉(zhuǎn) 化稱為"轉(zhuǎn)染"，在本發(fā)明中，他們具有相同的含義。
[0040] 如本文所使用的，術語"鋒指核酸酶(ZFN)"指由鋒指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA-剪切結(jié) 構(gòu)域融合，所產(chǎn)生的人工限制酶。可對鋒指結(jié)構(gòu)域進行操作W祀向DNA序列，運樣使鋒指核 酸酶祀向復雜基因組內(nèi)的期望DNA序列。可用于準確改變高級物種的基因組。
[0041 ]在本發(fā)明中使用了可NA剪切結(jié)構(gòu)域"，例如源自II型限制酶化kl的非特異性剪切 結(jié)構(gòu)域通常用作ZFN剪切結(jié)構(gòu)域。運一剪切結(jié)構(gòu)域應進行二聚化W剪切DNA，因此需要一對 ZFN來祀向非回文DNA結(jié)構(gòu)域。標準的ZFN能使剪切結(jié)構(gòu)域與每一鋒指結(jié)構(gòu)域的C末端融合。 為了使兩個剪切結(jié)構(gòu)域與剪切DNA發(fā)生二聚化，兩個單獨的ZFN應與它們的C末端相距有限 的距離，并且在相對端與DNA結(jié)合。必要的是，鋒指結(jié)構(gòu)域和剪切結(jié)構(gòu)域之間最常使用接頭 序列，W使與每一結(jié)合結(jié)構(gòu)域的5'邊緣W化P至化P的距離分離開。
[0042] 采用一些其它的蛋白工程技術，W改進在ZFN中使用的核酸酶結(jié)構(gòu)域的活性和特 異性。為了產(chǎn)生具有改進的剪切活性的化kl變體，采用了定向進化。為僅使預期的異種二聚 體種類活化，W通過改變二聚化的接觸表面來改進化kl的剪切特異性，而采用了基于結(jié)構(gòu) 的設計。
[0043] 各ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域都具有3至6個鋒指重復，并且能識別9bp至18bp的距離。如 果鋒指結(jié)構(gòu)域?qū)λ鼈冾A期的祀?yún)^(qū)域具有完全的特異性，則理論上，即使能識別18bp完整長 度的一對3-鋒指ZNF也能祀定哺乳動物基因組中的單一座位。
[0044] 為了能與期望序列結(jié)合，開發(fā)了對切s2化s2鋒指進行操作的多種策略。運些策略 包括模塊化組裝，W及采用隧菌體展示或細胞選擇系統(tǒng)的選擇策略。
[0045] 產(chǎn)生新的鋒指陣列的最簡單方法是，將具有已知特異性的小的鋒指"模塊"連接起 來。最常用的模塊組裝方法包括:為了制備能識別9bp的祀?yún)^(qū)域的3-指陣列，將能分別識別 3bp DNA序列的S個分離的鋒指連接起來。或者，使用1-指或2-指模塊來制備具有6個或更 多個單獨鋒指的鋒指陣列的方法。
[0046] 可使用多種選擇方法，來產(chǎn)生能祀向期望序列的鋒指陣列。在選擇嘗試的早期，使 用了隧菌體展示技術，從來自很多庫的部分隨機鋒指陣列中，選擇與給定DNA祀點結(jié)合的蛋 白。在最近的嘗試中，使用了酵母單雜交系統(tǒng)、細菌單雜交系統(tǒng)和雙雜交系統(tǒng)，W及哺乳動 物細胞。選擇新鋒指陣列的更有希望的方法是使用細菌雙雜交系統(tǒng)，并將運一方法稱為 "OPEN"。該系統(tǒng)在將預先選擇的要進行選擇W結(jié)合的庫中的各個鋒指分別與給定的S聯(lián)體 結(jié)合之后，使用第二輪選擇W獲得能與期望的9-bp序列結(jié)合的3-指陣列。該系統(tǒng)由Zinc- Finger Consortium(鋒指財團）開發(fā)出來，作為經(jīng)操作的鋒指陣列的商業(yè)來源的替代物。
[0047]將對本發(fā)明進行詳細描述。
[004引本發(fā)明人成功制備了插入有G418(Neo)基因的體細胞系，W便能有效選擇敲除了 CMAH基因的體細胞，同時去除了參與化u5Gc抗原決定簇合成的CMAH基因。
[0049] 在本發(fā)明中制備的打祀載體和用于轉(zhuǎn)化的細胞系，經(jīng)由對參與免疫排斥應答的基 因的表達進行復雜調(diào)節(jié)，而有效生產(chǎn)用于進行異種移植的克隆豬。
[0050] 在本發(fā)明中使用的載體是新穎的技術，運一技術能產(chǎn)生具有去除鋒指蛋白的核酸 酶功能的Foxl蛋白，其中所述鋒指蛋白可識別在體細胞的決定簇基因和在決定簇內(nèi)的基因 的序列。
[0051] 與傳統(tǒng)的打祀載體相比，在本發(fā)明中使用的載體具有改進的效率和準確性。
[0052] 此外，由載體打祀的CMAH基因優(yōu)選是源自包括牛、綿羊、山羊、豬、馬、兔、狗、猴等 的哺乳動物的CMAH基因，更優(yōu)選是源自豬的CMAH基因，并且最優(yōu)選是源自小型豬的CMAH基 因，但并不限于此。
[0053] 此外，本發(fā)明的載體包括陽性選擇性標記物基因。
[0054] 對于陽性選擇性標記物基因，可使用新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)、潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶 化yg)、組氨醇脫氨酶化isD)、嚷嶺霉素(Puro)、鳥嚷嶺憐酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Gpt)等，優(yōu)選使用 化0,但并不限于此。
[0055] 當本發(fā)明的基因打祀載體被祀向進入宿主細胞中時，在宿主細胞基因組上的合成 內(nèi)源性抗原決定簇的基因與打祀載體之間發(fā)生同源重組，使核巧酸序列進行置換。
[0056] 另一方面，本發(fā)明設及一種引入了上述打祀載體的轉(zhuǎn)化體。
[0057] 轉(zhuǎn)化方法可包括能將任意給定的核酸分子引入到有機體、細胞、組織或器官中的 任意方法，并且可使用本領域已知的適用于宿主細胞的任意標準方法來進行轉(zhuǎn)化。上述方 法可包括電穿孔、憐酸巧(CaKk)沉淀法、氯化巧(CaCb)沉淀法、顯微注射、聚乙二醇(PEG) 法、DEAE-葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、乙酸裡-DMS0法等，但該方法并不限于此。
[0058] 此外，本發(fā)明提供了一種非人的克隆動物，該非人的克隆動物經(jīng)由用于轉(zhuǎn)化的體 細胞系進行核移植來制備。
[0059] 上述非人的克隆動物可W是具有與人的大小類似的哺乳動物，諸如綿羊、山羊、 豬、狗等，優(yōu)選豬，其中最優(yōu)選小型豬。
[0060] 可使用本領域已知的方法進行用于制備克隆動物的核移植，優(yōu)選是在US 6,781， 030B、US 6,603,059B、US 6,235,969B、US 7,355,094B、US 7,071，372B、KR 862298B、KR 500412B、KR 807644B、JP 4153878B、US 6,700,037B、US 7,291，764B、US 6,258,998B、US 6,548,741B、W0 03/089632A、US 7,371，922B等中描述的方法，并且對于豬，優(yōu)選使用在 KR500412B、KR807644、JP4153878B、US6,700,037B、KR 專利申請公開號 10-2009-0056922、 US7，291，764B、US6，258，998B、US6，548，741B、W003/089632A和US 7，371，922B中描述的方 法。運些專利文件通過引用并入本文中。
[0061] 此外，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生移植用異種器官的方法，該方法包括在飼養(yǎng)了非人 的克隆動物之后，摘除移植所需的器官。在考慮了接受主體的性別、年齡、體重、身高等情況 下，調(diào)節(jié)飼養(yǎng)期，并且在飼養(yǎng)了供體克隆動物之后，可通過常規(guī)外科手術摘除器官，并且可 將摘除的器官立即移植到接受主體內(nèi)，或快速儲存在冰箱中。
[0062] 作為異種移植的最佳供應源，小型豬因為在器官大小和生理特征上與人的相似并 且由于它們的繁殖力，而認為可使用小型豬來供應大量器官。對此，應首先生產(chǎn)可控制免疫 排斥應答的小型豬。豬移植的成功依賴于，是否能克服一系列免疫排斥應答(超急性免疫排 斥應答、急性血管性免疫排斥應答、細胞介導的免疫排斥應答和慢性免疫排斥應答)。
[0063] 根據(jù)之前的報道，GT基因是在異種移植過程中引起急性免疫排斥應答的源基因， 當去除該基因時，可開發(fā)出其中去除了生物排斥應答的異種移植用疾病模型動物。在2005 年，將來源于其中去除了GT基因的克隆豬的器官移植到猴子中，作為結(jié)果報道了在移植之 后，存活下來的猴子維持了2至6個月，而且沒有出現(xiàn)急性免疫排斥應答化enji Kuwaki et al.，化Uire Medicine，11 (1): 29-31，2005)。但是，也有報道指出，即使去除了GT基因，在器 官移植過程中，由于異種抗原通過不同途徑激活人補體基因，也可能出現(xiàn)嚴重的排斥應答 (Tanemura,M.et al.,Biochem.Biophys.Res .Commun.,235:359-364,1997;Komoda,H.et al. ,Xenotransplantation, 11:237-246,2004)。同時，報道了存在于除人之外的大多數(shù)哺 乳動物中的N-徑乙酷神經(jīng)氨酸(下文稱為"Neu5Gc")抗原決定簇，在異種移植過程中也可能 引起免疫排斥應答（W020061133356A; Pam I'angvoranuntakul,Proc.化tl. Acad. Soc. USA 100:12045-12050，2003;Barbara Bighi即oli，BMC genetics，8:27，2007) oN-乙酷神經(jīng)氨 酸（下文稱為"Neu5Ac")通過CMAH被轉(zhuǎn)化成化u5Gc。因此，可W調(diào)節(jié)其中去除了CMAH基因的 豬W及其中去除了 Ga 口的豬的急性免疫排斥應答，可開發(fā)并且在異種移植過程中利用器官 移植用疾病模型動物。根據(jù)之前的報道（Basnet NB et al.,Xeno1:ransplantation,l7: 440-448,2010; Lutz AJ et al,Xenotransplan1:ation, 20:27-35,2013)，當檢驗雙敲除小 鼠（Ga口和CMAH)和雙敲除豬(Ga口和CMAH)的外周血單核細胞(PBMC)或胸腺細胞與人血清 內(nèi)的天然異種反應性抗體的結(jié)合能力時，證明了與對照豬和GalT敲除的相比，雙敲除小鼠 和雙敲除豬示出結(jié)合能力降低。運些結(jié)果表明，可控制由異種抗原引起的急性免疫排斥應 答。根據(jù)之前的報道化avaler et al.，F(xiàn)ASEB 1，25:1887-1893,2011)，證明了在肥胖的 cMH敲除小鼠中，膜腺e細胞功能損傷降低了膜腺的大小和分泌膜島素的細胞的數(shù)量。
[0064] 相應的，在本發(fā)明的豬的情況中，可用作肥胖和糖尿病的模型。此外，根據(jù)之前的 報道（Qian化aseWiaran et al.,Sci lYansl Med.,28:42-54)，CMAH敲除小鼠可用作人的 杜興氏肌肉營養(yǎng)不良癥的實驗模型。根據(jù)運些報道，本發(fā)明的豬可用作肌肉營養(yǎng)不良癥的 模型。
[0065] 【本發(fā)明的有益效果】
[0066] 如在本發(fā)明中可看到的，在本發(fā)明中，在體細胞系中插入了G418(Neo)基因，W便 可選擇具有CMAH基因敲除的體細胞，同時去除了參與化u5Gc抗原決定簇合成的CMAH基因， 本發(fā)明制備的打祀載體和移植用細胞系可用于通過對參與免疫排斥應答的基因表達進行 復雜調(diào)節(jié)，而有效產(chǎn)生異種移植用克隆豬。
[0067] 此外，為了去除豬的CMAH蛋白表達，制備本發(fā)明的載體，W便通過同源重組，并且 與使用鋒指核酸酶(ZFN)的CMAH打祀載體一起，制備了要插入到基因組中的包括肥0選擇因 子的供體DNA;證明了本發(fā)明的載體具有比傳統(tǒng)打祀載體顯著高的打祀效率;使用ZFN和供 體DM能選擇多個CMAH打祀體細胞;并且，通過受精卵移植產(chǎn)生CMAH基因中祀的小型豬。
【附圖說明】
[006引圖1是ZFN質(zhì)粒的圖譜。
[0069] 圖2是ZF腳舌性的柱狀圖。
[0070] 圖3是例示了通過ZFN打祀正向&反向質(zhì)粒對豬的CMAH外顯子8進行ZFN打祀的示意 圖。
[OOW 圖4是供體DNA(CMAH neo打祀載體)圖譜的示意圖。
[0072] 圖5是示出CMAH打祀載體序列的圖像，其中，黃色表示5 '，白色表示PGK-neo-多聚 腺巧酸(PolyA)，灰色表示3'臂，并且不包括pBSK序列（將DNA插入到地SK的Xbal-Kpnl位點 中）。
[0073] 圖6是示出豬中的CMAH敲除體細胞的篩選策略的示意圖。
[0074] 圖7是示出通過CMAH neo載體進行轉(zhuǎn)染的結(jié)果圖。
[0075] 圖8是示出用于證明CMAH敲除豬的轉(zhuǎn)染的引物組合的位置的示意圖。
[0076] 圖9是示出分析存在由核置換產(chǎn)生的CMAH敲除豬的轉(zhuǎn)染的PCR結(jié)果的圖。
[0077] 圖10示出由核置換產(chǎn)生的CMAH敲除豬的圖。
[0078] 圖11示出CMAH在由核置換產(chǎn)生的CMAH敲除豬中建立的體細胞系中表達的結(jié)果。
[0079] 圖12示出在CMAH敲除小鼠模型和人血清之間的免疫識別應答的圖。
[0080] 圖13示出隨著CMAH敲除小鼠模型的衰老而出現(xiàn)聽力損失的圖。
【具體實施方式】
[0081] 下面，將參照非限制性實施例詳細描述本發(fā)明。但是，在本文中公開的示例性實施 方式僅用于例示的目的，而不應構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
[00劇 實施例1:ZFN質(zhì)粒的構(gòu)建
[0083] 本發(fā)明的構(gòu)建體包括T7啟動子，W便本發(fā)明的構(gòu)建體可W是CMV驅(qū)動的，并且可用 于體外轉(zhuǎn)錄反應。所有的ZFN在N末端都有S個FLAG。使用限制酶趾0 I和Xba I在緊鄰終止 密碼子之后的位置進行剪切，從而使用于mRNA合成的模板線性化。
[0084] 實施例2: ZF腳舌性的測量
[00化]通過進行酵母報告基因分析（Doyon et al. ,N at Biotechnol, 2008,26 (6): 702)，來測量ZFN活性。在誘導之前（Oh,藍色條柱）和在ZFN表達誘導之后（6h，紅色條 柱），測量ZFN的剪切活性。MEkl水平與ZF腳舌性具有正相關，其中ZFN活性在期望的祀?yún)^(qū)域 產(chǎn)生雙鏈剪切。在誘導之后（6h)，與陽性對照的ZFN相比，示出巧0%信號的ZFN被認為對基 因組編輯實驗是有用的(那些在未誘導狀態(tài)(Oh)下就示出活性的ZFN甚至可能是優(yōu)異的）。 [00化]實施例3:供體DNA的制備
[0087] CMAH 5'臂-PGKneopolyA-3'臂載體的構(gòu)建
[0088] 1)5'的？0?克隆
[0089] 首先，使用芝加哥小型迷你豬的基因組DNA，W及包括Xbal限制酶切位點的正向引 物（TCTAGACTCTCTATTTGGTGGCTCTGTTT，SEQ ID N0:4)和包括EcoRI限制酶切位點的反向引 物(GAATTCAGGAGTTTCTTCCTTTCTGTTTT，SEQ ID N0:5)，通過PCR擴增獲得5'臂，然后連接到 T-載體中。通過DM測序，證明克隆的DM是CMAH基因結(jié)構(gòu)域。
[0090] 2)3'的？0?克隆
[0091] 使用芝加哥小型迷你豬的基因組DNA作為模板，W及包括趾〇1限制酶切位點的正 向引物（CTCGAGCCTACAACCCAGAATTTACTGCC,沈Q ID N0:6)和包括Kpnl限制酶切位點的反向 引物(GGTACCAACAGGGACCTGCCAAGAGGCCA，SEQ ID N0:3)，通過PCR擴增獲得3'臂，然后亞克 隆到T-載體中。通過DNA測序，證明克隆的DNA是CMAH基因結(jié)構(gòu)域。
[0092] 3)〔14哺勺5'臂斗61(116〇9〇174-3'臂載體的構(gòu)建
[0093] 首先使用EcoR巧日趾〇1剪切地J2neo質(zhì)粒W分離PGKneoPolyA片段（約化b)，并且將 分離出的片段連接到經(jīng)EcoRI和Xhol剪切的pBluscriptll(SK-)載體中，獲得pBSK- PGKneoPolyA質(zhì)粒，W進行CMAH 5 '臂-PGKneopolyA-3 '臂載體的構(gòu)建。對于5 '連接，使用 Xbal和EcoRI剪切上面獲得的5質(zhì)粒(T-方便載體(T-easy vector))^獲得789bp的片段，然 后將該片段連接到經(jīng)Xba巧此coRI剪切的pBSK-PGKneoPolyA質(zhì)粒中，從而構(gòu)建出pBSK-5' 臂-PGKneoPolyA質(zhì)粒。最后，對于3'連接，使用化〇1和Kpnl剪切上面獲得的3質(zhì)粒(T-方便載 體）W獲得763bp的片段，然后將該片段連接到經(jīng)Xhol和Kpnl剪切的pBSK-5'臂- PGKneoPolyA質(zhì)粒中，從而構(gòu)建出地SK-5'臂-PGKneo化lyA-3'臂質(zhì)粒。
[0094] 實施例4: ZFN載體和用于轉(zhuǎn)染和選擇供體DNA的方法
[00%]經(jīng)由如下所述的電穿孔，將基因打祀載體引入到小型豬的體細胞中。在電穿孔中， 通過膜蛋白酶處理，W回收培養(yǎng)的細胞，懸浮回收的細胞W獲得細胞數(shù)為5 X106個細胞/ 0.4mL的液體培養(yǎng)物F10，然后與4.5iig線性供體DNA載體和各2.6iig的pZFNlDNA和PZFN2DNA 混合，將細胞-載體混合物添加到4mm電轉(zhuǎn)杯（gap cuvette)中。將電轉(zhuǎn)杯安裝在BTX Electro-cell manipulator!；細胞電轉(zhuǎn)儀，ECM 2001)上，W480V、4脈沖和1ms的條件進行電 擊。電擊之后，將電轉(zhuǎn)杯放置在冰上10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到lOmL液體培養(yǎng)基中并且懸浮在其 中，并且W1250個細胞/孔的濃度接種到48孔板中。引入DNA之后24小時，使用30化g/mL的 G418進行11天的選擇程序。將由此形成的陽性克隆體細胞亞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中，W進行 分析。當在3至4天內(nèi)達到90%融合時，將上述亞培養(yǎng)的體細胞亞培養(yǎng)在12孔培養(yǎng)板中。此 夕hW3至4天的間隔，將細胞亞培養(yǎng)在6孔板、60mm培養(yǎng)皿和100mm培養(yǎng)皿中，然后凍干或在 實驗中使用。
[00%] 實施例5:中祀細胞的PCR選擇
[0097]如下所述，進行PCR分析，W選擇敲除細胞。W從細胞中分離出來的lOOng基因組 DNA作為PCR模板，使用化〇3-1 引物（GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT，沈Q ID NO: 8)和 CMAHScAS3引物（AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG，SEQIDN0:9)作為引物，并且使用 Takara Ex Taq擴增DNA。在W下條件下進行PCR:98°C2分鐘進行一個循環(huán);95°C30秒、68°C 30秒、72°C2分鐘進行40個循環(huán)；W及72°C15分鐘進行1個循環(huán)。PCR之后，將擴增的DM在 0.8 %瓊脂糖凝膠中進行電泳，并且最終證明約沈b DNA條帶的存在/不存在。
[009引通過在528個48孔板中培養(yǎng)，CMAH neo載體轉(zhuǎn)染的結(jié)果是5 X106個細胞轉(zhuǎn)染(CMAH neo載體，ZFN質(zhì)粒），其中有78個單一克隆的傳代，并且作為64個單一克隆的PCR分析結(jié)果， 28個克隆在第一 PCR中顯示出陽性，最終有19個克隆在第二PCR中顯示出陽性。
[0099]【表1】
[01nn1
[0101]本文中所使用的材料如下。
[?！?。實施例6:體細胞的核置換
[0103] 對于核置換，卵母細胞購自ART(麥迪遜，WI)，體外成熟，摘除卵母細胞的核并且使 用其中中祀的CMAH敲除化0) ([ pBSK-5 '臂-PGKneoPo 1 yA-3 '臂質(zhì)粒]和pZFNl和PZFN2DNA [CMAH敲除]載體)的供體細胞進行移植，通過兩次1.2kV/cm的DC脈沖電刺激進行融合。僅選 擇存活的融合的卵母細胞，并且移植到如表2所示的代孕母親的輸卵管中。
[0104] 【表2】 「01051
[0106]表2示出使用CMAH K0細胞進行核置換的結(jié)果，其中#1和#2表明ZFN轉(zhuǎn)染且沒有供 體DNA，而#3至#9表明ZFN轉(zhuǎn)染且具有供體DNA。
[0…7] 實施例7:其中打祀CMAH敲除載體的轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)
[0108] 在收集了由正常分娩產(chǎn)生的后代的耳組織之后，使用Ge址lute?哺乳動物基因組 DNA小量制備試劑盒（Ge址lute Mammalian Genomic DNA Miniprep kit,Sigma-Aldrich) 提取基因組DNA。為了進行基于提取的DNA的準確分析，使用左臂區(qū)域的引物、右臂區(qū)域的引 物和同時包括左臂和右臂區(qū)域的引物的組合，進行PCR分析，從而證明存在基因引入。
[0109] 右臂引物的組合
[0110] 正向化0 3-l:TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT，SEQ ID N0:10
[0111] 反向ScAS3:AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG，SEQ ID N0:11
[0112] 左臂引物的組合
[0113] 正向ScS5:CCCTTCCATCCCACCCGTCCTCATCCTTAC,沈Q ID N0:12
[0114] 反向CMAHR:ACTCTCTGTTTTCAGGCTGCTTGTT，SEQ ID N0:13
[0115] 右臂和左臂引物的組合
[0116] 正向ScS5:CCCTTCCATCCCACCCGTCCTCATCCTTAC,沈Q ID N0:14
[0117] 反向ScAS3:AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG，SEQ ID N0:15 [011引實施例8:對CMAH敲除豬中的CMAH表達的證明
[0119] 為了證明CMAH敲除豬中存在CMAH的表達，建立來自異種和同種CMAH敲除豬的體細 胞系。然后，使用RIPA蛋白提取(Thermo Scientific,USA)溶液，從細胞中提取蛋白并且進 行蛋白印跡分析，從而證明在同種CMAH敲除豬中不表達CMAH蛋白，而與野生型豬的CMAH蛋 白表達相比，CMAH蛋白表達在異種CMAH敲除豬中顯著降低。結(jié)果示于圖11中。
[0120] 實施例9:在CMAH敲除小鼠模型與人血清之間的免疫識別應答
[0121] 本發(fā)明人研究了 CMAH敲除小鼠模型的胸腺細胞與人血清的天然異種反應性抗體 的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)與WT-和雜合子來源的細胞相比，純合子來源的細胞與所有血型(A、B、0和 AB)中的IgG之間的結(jié)合能力都降低，而與IgM的結(jié)合能力在A、0和AB血型中沒有示出任何顯 著性(圖12)。
[01。] 實施例10:由于CMAH敲除小鼠模型的衰老而出現(xiàn)的聽力損失 [0123]本發(fā)明人從CMAH敲除小鼠模型中分離出耳蝸并且進行組織學分析，結(jié)果在 CMAH-/-衰老的耳蝸感覺上皮中發(fā)現(xiàn)異常（圖13)。相應地，該模型可用作1)伴隨衰老的聽力 損失模型和2)創(chuàng)傷愈合模型。
【主權(quán)項】
1. 一種CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體，以相繼順序包括CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化 酶的5 '臂、PGKneopolyA和CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的3 '臂。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體，其中，所述CMP-乙酰神 經(jīng)氨酸羥化酶的5'臂由SEQ ID N0:1中描述的核苷酸序列組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體，其中，所述 PGKneopolyA由SEQ ID NO:2中描述的核苷酸序列組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體，其中，所述CMP-乙酰神 經(jīng)氨酸羥化酶的3'臂由SEQ ID N0:3中描述的核苷酸序列組成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體，其中，所述CMP-乙酰神 經(jīng)氨酸羥化酶的打靶載體具有圖4中所示的限制酶切圖譜。6. -種制備CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的敲除細胞的方法，包括:將鋅指核酸酶的載體 和權(quán)利要求1至5中的所述載體轉(zhuǎn)染到細胞中。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述鋅指核酸酶的載體具有圖1中所示的限制酶 切圖譜。8. -種根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的方法制備的CMP-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶的敲 除細胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的敲除細胞，所述敲除細胞以保藏編號KCTC12439BP被保藏。10. -種制造除人之外的動物的方法，包括： 獲得卵母細胞，并且經(jīng)由體外成熟使所述卵母細胞成熟； 摘除所述卵母細胞的細胞核，將權(quán)利要求8或權(quán)利要求9所述的細胞移植到去核的所述 卵母細胞中，并且進行它們之間的融合； 僅選擇存活的融合的卵母細胞，并且將它們移植到代孕母親的輸卵管中。11. 一種生產(chǎn)異種器官的方法，所述異種器官用于進行消除了免疫排斥的移植，所述方 法包括： 飼養(yǎng)由權(quán)利要求1 〇的方法制造的除人之外的克隆動物，并且 從所述克隆動物中摘除器官。12. -種使用由權(quán)利要求10的制造方法制造的動物作為伴隨衰老的聽力損失模型或創(chuàng) 傷愈合模型的方法。
【文檔編號】C12N15/63GK106062196SQ201380077894
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2013年8月23日
【發(fā)明人】金珍會, 權(quán)得男, 樸鐘二, 李基豪, R·S·普萊特爾, 金宰煥, 姜萬鍾
【申請人】建國大學校產(chǎn)業(yè)學校協(xié)力團, 密蘇里大學管委會