專(zhuān)利名稱(chēng)：：顯性失活的跨膜受體在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于能在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁中表達(dá)所需跨膜受體構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的改進(jìn)的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種方法以改進(jìn)用于表達(dá)可用作治療分子的跨膜受體蛋白質(zhì)和/或顯性失活的跨膜受體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明大體涉及核移植和所需的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的領(lǐng)域。更具體地，其涉及用于在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生跨膜受體蛋白質(zhì)的方法。能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)的發(fā)展提供了特別精確地用于動(dòng)物產(chǎn)生的方法，該動(dòng)物經(jīng)改造以攜帶特定的性狀或設(shè)計(jì)成能表達(dá)某些蛋白質(zhì)或者其他的分子化合物。也就是說(shuō)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為攜帶在發(fā)育早期已經(jīng)人為引入體細(xì)胞和/或胚系細(xì)胞的基因的動(dòng)物。隨著動(dòng)物的發(fā)育和生長(zhǎng)，改造成動(dòng)物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或特定的發(fā)育轉(zhuǎn)變變得明顯。發(fā)現(xiàn)用于新的治療靶位的重要化學(xué)物質(zhì)的能力是大多數(shù)制藥公司藥物發(fā)現(xiàn)方案中首要的關(guān)鍵一步。細(xì)胞生物學(xué)、基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)基因?qū)W的最新進(jìn)展已經(jīng)允許解析信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及新的生化調(diào)控位點(diǎn)，以工業(yè)上空前的速度促進(jìn)小分子藥物介入的潛在的新機(jī)遇的確定。如上所述G蛋白-偶聯(lián)受體(GPCR)是用于制藥工業(yè)靶向的主要類(lèi)型。GPCR是7-跨膜受體蛋白質(zhì)的超家族，其在許多自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌信號(hào)系統(tǒng)中有極重要的功能。這些蛋白質(zhì)通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合調(diào)控蛋白質(zhì)(G-蛋白質(zhì))的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外配體和激素的結(jié)合成為胞內(nèi)的信號(hào)事件。以GPCR為目標(biāo)的傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)方案依賴(lài)于天然來(lái)源的整個(gè)動(dòng)物或組織制備物的使用，其作為起點(diǎn)用生物學(xué)或藥理學(xué)測(cè)定法進(jìn)行合成的/醫(yī)藥的或天然產(chǎn)物文庫(kù)的篩選。由于和跨膜蛋白質(zhì)的真正性質(zhì)相關(guān)的表達(dá)問(wèn)題，跨膜受體蛋白質(zhì)特別難以有效量表達(dá)或純化。(Loisel等，1997)。本領(lǐng)域的那些工作在產(chǎn)生任何有效量作為獨(dú)立治療分子的可溶性跨膜受體或其顯性失活類(lèi)型上是不成功的。例如，大量工作耗在發(fā)現(xiàn)166-殘基的造血生長(zhǎng)激素促紅細(xì)胞生成素(EPO)和其細(xì)胞因子受體的替代小分子配體上。已經(jīng)鑒定和廣泛研究了一種與天然EPO配體序列上無(wú)關(guān)的20-殘基環(huán)肽(Livnah等，1996)，但是該降低大小的多肽未能轉(zhuǎn)化為藥物本身，也沒(méi)有幫助制備對(duì)治療分子開(kāi)發(fā)有效的受體蛋白。本發(fā)明之前，可用于能產(chǎn)生跨膜受體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因家畜生成的技術(shù)是低效的和/或不能以近于商業(yè)可用的等級(jí)產(chǎn)生所需的重組蛋白質(zhì)。在攜帶目的受體跨膜DNA序列的轉(zhuǎn)基因建立者系的開(kāi)發(fā)過(guò)程中存在各種問(wèn)題。一般，轉(zhuǎn)基因根本不可能摻入或摻入但不能表達(dá)。進(jìn)一步的問(wèn)題是由于位置效應(yīng)的錯(cuò)誤調(diào)控的可能性。此指在用相同的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體產(chǎn)生的不同建立者動(dòng)物之間基因表達(dá)水平和基因調(diào)控精度的可變性。因此，一般是生成大量的建立者動(dòng)物并且常常證實(shí)小于5％的以確保轉(zhuǎn)基因系維持的方式表達(dá)該轉(zhuǎn)基因。另外，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家畜的效率低，常見(jiàn)生成的100個(gè)子代中1個(gè)為轉(zhuǎn)基因的(Wall等，1997)。因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生成的相關(guān)成本可多至每只表達(dá)的動(dòng)物250,000-500,000美元(Wall等，1997)?，F(xiàn)有技術(shù)的方法在克隆過(guò)程中一般使用胚胎細(xì)胞類(lèi)型。此包括Campbell等(NATURE1996)和Stice等(BIOL.REPROD.1996)的工作。在那些研究中，胚胎細(xì)胞系源自妊娠少于10天的胚胎。該研究中，細(xì)胞在滋養(yǎng)層上培養(yǎng)以防止在克隆過(guò)程中將使用的供體細(xì)胞的明顯分化。本發(fā)明使用已分化的細(xì)胞?？梢岳斫夂鸵苑只墓w細(xì)胞核起始克隆的胚胎一起，胚胎細(xì)胞類(lèi)型也可用于本發(fā)明的方法中。因此雖然已經(jīng)通過(guò)各種方法產(chǎn)生了一些不同種類(lèi)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但還是缺乏以合理的成本方便地和可再現(xiàn)地產(chǎn)生能大量表達(dá)所需跨膜蛋白質(zhì)或證實(shí)遺傳變化是由轉(zhuǎn)基因的插入所引起的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法。上述表達(dá)的嘗試包括改造跨膜結(jié)構(gòu)域缺失的膜相關(guān)蛋白質(zhì)，由此留下可結(jié)合配體的胞外部分(St.Croix等，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20030017157)。所述跨膜受體蛋白質(zhì)的這種可溶形式可用于與天然形式競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合配體。有可能所述可溶片段能用作抑制劑，但是其是否能真正提供與保留跨膜序列的天然跨膜受體確切競(jìng)爭(zhēng)的能力是不清楚的。有關(guān)哮喘和相關(guān)呼吸疾病流行病學(xué)的研究明確證實(shí)變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率已經(jīng)提高，且較高的診斷率不僅僅是因?yàn)樵\斷方式的改變或者檢測(cè)的改進(jìn)。此外，對(duì)過(guò)敏性鼻炎和變應(yīng)性哮喘常常共同存在的提高的認(rèn)識(shí)已促成這樣的共識(shí)，即這些貌似獨(dú)立的病癥是在上或下呼吸道表現(xiàn)出的相同疾病的體現(xiàn)?，F(xiàn)今對(duì)哮喘的許多治療并沒(méi)有針對(duì)疾病本身發(fā)展基礎(chǔ)下的機(jī)制，并且有時(shí)候，在延長(zhǎng)使用后帶來(lái)明顯的副作用和降低的功效。盡管在過(guò)去的25年內(nèi)治療有進(jìn)展，哮喘的發(fā)病率和嚴(yán)重程度基本上還在增長(zhǎng)因而有開(kāi)發(fā)針對(duì)新治療靶位新藥的明確需求。以現(xiàn)有哮喘藥物的市場(chǎng)規(guī)模，新的和有效的哮喘藥物的商業(yè)潛力估計(jì)將超過(guò)50億美元。雖然以哮喘病狀各個(gè)方面為目標(biāo)的一系列新療法目前處于臨床發(fā)展階段，資料的重要部分顯示作為關(guān)鍵作用的IL-13和其受體的相互作用，其出現(xiàn)在其他細(xì)胞因子和非-細(xì)胞因子基礎(chǔ)靶目標(biāo)的上游。然而，作為哮喘治療潛在治療途徑的IL-13功能異?？缒な荏w的產(chǎn)生還沒(méi)有探究或提出。因此，對(duì)用于跨膜受體蛋白質(zhì)重組表達(dá)的改進(jìn)方法存在的需求將允許轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開(kāi)發(fā)中生產(chǎn)效率的提高，尤其涉及可提供哮喘或相關(guān)變態(tài)反應(yīng)病癥治療的另外治療選擇的分子的產(chǎn)生。
發(fā)明內(nèi)容簡(jiǎn)言之，本發(fā)明提供用于在轉(zhuǎn)基因重組系統(tǒng)中表達(dá)跨膜蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的方法包括通過(guò)核移植方法克隆用跨膜受體蛋白所需受體轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，包括獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得至少一個(gè)卵細(xì)胞；將該至少一個(gè)卵細(xì)胞去核；將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)融合和活化細(xì)胞偶聯(lián)體以形成轉(zhuǎn)基因胚胎；培養(yǎng)該活化的轉(zhuǎn)基因胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；以及最后將該轉(zhuǎn)基因胚胎移植入合適的宿主哺乳動(dòng)物中使得胚胎發(fā)育成胎兒。一般，上述方法通過(guò)使用供體細(xì)胞核而完成，其中在所述分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核插入所述去核的卵細(xì)胞之前，已經(jīng)插入、除去或修飾編碼目的跨膜受體蛋白的所需基因。還需注意的事實(shí)是所用的卵細(xì)胞優(yōu)選去核前是體外成熟的。此外，本發(fā)明提供跨膜受體的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，包括IL-13受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1至4、CFTR受體、阿立新(Orexin)受體、黑色素濃集激素受體、CD-4受體，以及上述所有的顯性失活的類(lèi)型。本發(fā)明證實(shí)許多不同的跨膜蛋白質(zhì)可在轉(zhuǎn)基因乳汁中產(chǎn)生。該能力是重組哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)獨(dú)有的。本發(fā)明還提供能抑制受體功能的顯性失活跨膜蛋白質(zhì)的表達(dá)和制造。該表達(dá)允許利用表達(dá)的分子通過(guò)干預(yù)依賴(lài)跨膜受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而形成疾病病狀的新治療方法靶向的基礎(chǔ)。按照一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，該顯性失活的跨膜受體蛋白通過(guò)目的蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)酪氨酸激酶位點(diǎn)功能的消除而制備。其他可改變以消除生理功能的位點(diǎn)包括對(duì)目的跨膜受體蛋白的功能很重要的活性絲氨酸激酶位點(diǎn)。此外，本發(fā)明的方法還提供通過(guò)在中期-II時(shí)期獲得的山羊卵細(xì)胞的使用而優(yōu)化轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生成，其是去核的并且與供體體細(xì)胞融合而同時(shí)活化。一種轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的乳汁的分析顯示了人的所需目的轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的高水平的產(chǎn)生。另外要重點(diǎn)指出的是也可從克隆的子代分離細(xì)胞、組織和器官。該方法可以提供用于許多醫(yī)療和獸醫(yī)治療包括細(xì)胞和基因治療的″材料″來(lái)源。如果將細(xì)胞移植回細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物中，則免疫排斥得到避免。并且，由于可從這些克隆分離許多細(xì)胞類(lèi)型，其他的方法如造血嵌合狀態(tài)(chimericism)可用于避免同種類(lèi)動(dòng)物中以及種之間的免疫排斥。圖1顯示了通過(guò)核移植產(chǎn)生克隆動(dòng)物的過(guò)程的概括圖。圖2顯示了IL-13受體轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建。圖3顯示了IL13受體在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)。泳道1-8，分別來(lái)自八只建立者小鼠BC894-4、BC894-79、BC894-81、BC894-96、BC894-104、BC894-114A、BC894-114B和BC894-116的全部乳汁。泳道9和10，分別為小鼠1和2的脂類(lèi)組分。M，分子量標(biāo)記。N，陰性乳汁。具體實(shí)施例方式以下縮寫(xiě)已在說(shuō)明書(shū)中指明含義主要的縮寫(xiě)體細(xì)胞核移植(SCNT)培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(CICM)核移植(NT)合成的輸卵管液體(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)牛血清白蛋白(BSA)術(shù)語(yǔ)的注解山羊-各種種類(lèi)的或相關(guān)的山羊。重建的胚胎-重建的胚胎為其遺傳物質(zhì)通過(guò)去核過(guò)程而除去的卵細(xì)胞。其已經(jīng)通過(guò)在融合事件之后將成體或胎兒體細(xì)胞遺傳物質(zhì)置于卵細(xì)胞而″重建″。融合載玻片-用于并聯(lián)以固定間隔距離放置的電極的載玻片。細(xì)胞偶聯(lián)體放置于電極之間以接受電流而融合和活化。細(xì)胞偶聯(lián)體-融合和/或活化前的去核卵細(xì)胞和體或胎兒核體。細(xì)胞分裂抑素-B-有選擇地和可逆地阻斷胞質(zhì)分裂而不影響核分裂的某些真菌的代謝產(chǎn)物。胞質(zhì)體-真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。顯性失活效應(yīng)-突變體受體或改變的氨基酸序列可與野生型受體/配體形成二聚物，但是胞內(nèi)信號(hào)由于其中關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域區(qū)的缺少或改變(例如來(lái)自突變體受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域缺失)而不能被活化。因此，具有該突變的細(xì)胞將不能響應(yīng)配體的存在。核體-通過(guò)去核而獲自細(xì)胞的細(xì)胞核，由胞質(zhì)和質(zhì)膜的窄環(huán)環(huán)繞。體細(xì)胞-生物體機(jī)體除生殖細(xì)胞外的任何細(xì)胞。單性生殖(Parthenogenic)-來(lái)自無(wú)精子透入卵細(xì)胞的胚胎的發(fā)育。轉(zhuǎn)基因生物-實(shí)驗(yàn)性地移植來(lái)自另一個(gè)生物體的遺傳物質(zhì)進(jìn)入生物體以使宿主在其染色體組成中獲得所移植基因的遺傳特性。體細(xì)胞核移植-也稱(chēng)作治療性克隆，是體細(xì)胞與去核的卵細(xì)胞融合的過(guò)程。體細(xì)胞的細(xì)胞核提供遺傳信息，而卵細(xì)胞提供養(yǎng)分及其他產(chǎn)生能量的物質(zhì)，其對(duì)于胚胎的發(fā)育是必需的。一旦融合發(fā)生，細(xì)胞為全能性的，且最終發(fā)育成胚囊，此時(shí)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)是分離的。自從最初報(bào)道在綿羊中利用體細(xì)胞的成功后(Wilmut等，1997)，核移植取得了顯著的進(jìn)步。此后許多其他物種從體細(xì)胞克隆，獲得不同程度的成功(Baguisi等，1999和Cibelli等，1998)。許多其他的胎兒和成體體細(xì)胞組織類(lèi)型(Zou等，2001和Wells等，1999)，以及胚胎(Yang等，1992；Bondioli等，1990；和Meng等，1997)也有報(bào)道。重建時(shí)核體所處的細(xì)胞周期時(shí)期也用不同的實(shí)驗(yàn)室方法(Kasinathan等，Biol.Reprod.2001；Lai等，2001；Yong等，1998；和Kasinathan等，NatureBiotech.2001)證實(shí)是關(guān)鍵性的。然而，用于融合和活化次序、時(shí)機(jī)和方法存在相當(dāng)大程度的可變性。現(xiàn)有技術(shù)依賴(lài)用于核移植方法的早期胚胎分裂球的使用。該方法受可用的胚胎分裂球的很少數(shù)量以及不能將外源遺傳物質(zhì)引入上述細(xì)胞的限制。相反，分化的胚胎、胎兒或成體體細(xì)胞可用作核移植核體供體的發(fā)現(xiàn)提供了胚系改變的各種可能性。根據(jù)本發(fā)明，用于核移植的重組體細(xì)胞系的使用以及通過(guò)利用″重建″胚胎增加可用細(xì)胞數(shù)目而提高該方法的效率，不僅允許通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法將轉(zhuǎn)基因引入更多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而且基本上提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的效率同時(shí)克服了建立者鑲嵌現(xiàn)象的問(wèn)題。之前已經(jīng)顯示同時(shí)的電融合和活化可以成功地產(chǎn)生山羊物種及其他動(dòng)物的活的子代。供體核體獲自最初的胎兒體細(xì)胞系，其源自通過(guò)負(fù)性成體雌性用來(lái)自轉(zhuǎn)基因雄性的精子人工受精而產(chǎn)生的40-天的轉(zhuǎn)基因雌性胎兒。用兩種核移植方法產(chǎn)生活的子代。在一種方案中，將處于停滯于分裂中期-II期的山羊卵細(xì)胞去核，與供體體細(xì)胞電融合并且同時(shí)活化。在第二種方案中，將體內(nèi)活化的山羊卵細(xì)胞在分裂末期-II期去核，與供體核體電融合并且同時(shí)再次活化以誘導(dǎo)基因組的再活化。產(chǎn)生了三個(gè)健康的、同一的雌性子代?；蛐头治鲎C實(shí)所有克隆的子代都源自供體細(xì)胞系。一種轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的乳汁的分析顯示了人跨膜受體蛋白質(zhì)的高水平的產(chǎn)生。因此，通過(guò)本發(fā)明中所用的方法和系統(tǒng)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物山羊通過(guò)體細(xì)胞核移植產(chǎn)生并且證實(shí)能在所克隆動(dòng)物的乳汁中產(chǎn)生目的治療受體蛋白。雖然上述發(fā)明已經(jīng)通過(guò)用于理解目的的例證和實(shí)例較詳細(xì)地描述，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很顯然可進(jìn)行某些變化和改變。因此，描述和實(shí)例不應(yīng)認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍通過(guò)附加的權(quán)利要求描述。GPCR一般，GPCR已被分類(lèi)并且受體亞類(lèi)已通過(guò)在放射性同位素示蹤結(jié)合測(cè)定法中對(duì)激動(dòng)劑和拮抗劑親合力的藥理學(xué)差異的觀察而鑒定。隨著現(xiàn)代基因組的到來(lái)，在特定的細(xì)胞系中表達(dá)的已知亞類(lèi)的重組人受體的篩選已成為用于重要發(fā)現(xiàn)方案的準(zhǔn)則。本領(lǐng)域典型的發(fā)現(xiàn)方案可包括放射性配體膜置換測(cè)定法，隨之細(xì)胞報(bào)道分子二級(jí)測(cè)定法的使用。不管應(yīng)用怎樣的測(cè)定法，表達(dá)高水平目的受體的一系列單細(xì)胞克隆必須經(jīng)過(guò)鑒定并且進(jìn)行有效的分子篩選，而其常常利用報(bào)道基因的讀數(shù)很容易地完成(Stables等，1999)。替代的方法包括通過(guò)整個(gè)細(xì)胞的放射-配體結(jié)合測(cè)定法挑選克隆。后者的方法不受專(zhuān)利限制，但為更多勞動(dòng)強(qiáng)度的。該方法通常以目的受體的cDNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入在通過(guò)受體-依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的調(diào)控下共表達(dá)報(bào)道基因的穩(wěn)定細(xì)胞系而起始。通過(guò)其配體或激動(dòng)劑的目的受體的活化最終導(dǎo)致很容易測(cè)定活性的報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。該活性用于鑒定受體表達(dá)的、穩(wěn)定的、無(wú)性細(xì)胞系，因?yàn)橥ǔ?bào)道分子信號(hào)的變幅與受體表達(dá)水平相關(guān)。一旦鑒定了陽(yáng)性克隆，將其擴(kuò)大并且選擇測(cè)定法形式。置換測(cè)定法有兩種常見(jiàn)類(lèi)型基于過(guò)濾的放射-配體結(jié)合和SPA。通過(guò)置換的活性化合物的檢測(cè)呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的、明確的體系，因此允許進(jìn)行詳細(xì)的親合力和構(gòu)效關(guān)系(SAR)的研究(Rosati等，1998)。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，還沒(méi)能制備和表達(dá)跨膜受體本身，或者其顯性失活的類(lèi)型用作潛在的治療分子。由于過(guò)去較低的成功率，靶蛋白-受體相互作用是生物技術(shù)工業(yè)主要避免的一個(gè)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用的一個(gè)實(shí)例為細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子接合其靶受體。生物學(xué)上，這些在控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞交流和粘著中的關(guān)鍵事件方面起著重要作用，且因此很可能作為自身免疫疾病、癌癥、哮喘、過(guò)敏癥等等中介入的點(diǎn)而引起注意?？缒な荏w蛋白質(zhì)的表達(dá)泌乳乳腺上皮細(xì)胞的一種特有的生理學(xué)特征為其分泌脂類(lèi)進(jìn)入乳汁。該脂類(lèi)以磷脂膜和蛋白質(zhì)包裹的乳脂小球、脂肪滴大量分泌。許多細(xì)胞膜蛋白質(zhì)在乳脂小球的膜組分中被發(fā)現(xiàn)。在本發(fā)明中我們提供了一種利用該分泌途徑作為一種手段而從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁產(chǎn)生重組跨膜蛋白質(zhì)的方法。當(dāng)具有一個(gè)或多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)由乳腺中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞可能能以乳脂小球″分泌″之，因此可從乳汁收獲該重組蛋白質(zhì)。此將使得該轉(zhuǎn)基因乳汁生產(chǎn)成為能分泌跨膜蛋白質(zhì)的唯一體系并且提供給本發(fā)明的實(shí)施者機(jī)會(huì)以可能產(chǎn)生其他蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)不能提供的許多種類(lèi)的跨膜蛋白質(zhì)如通道蛋白、細(xì)胞表面受體、抗藥性調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明提供在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中跨膜蛋白質(zhì)如IL-13受體和其顯性失活類(lèi)型的表達(dá)。用于哮喘和過(guò)敏癥治療的轉(zhuǎn)基因的顯性失活I(lǐng)L-13受體目前哮喘的處理方針強(qiáng)調(diào)作為首要抗炎療法的吸入的皮質(zhì)甾類(lèi)早期干預(yù)的重要性。一些研究證實(shí)某些抗組胺劑的二級(jí)制品具有抗炎活性。還進(jìn)行了研究，研究在過(guò)敏性鼻炎和哮喘中與鼻內(nèi)的和/或吸入的皮質(zhì)甾類(lèi)相比，其與白細(xì)胞三烯受體拮抗體聯(lián)合的效果。在新的抗-細(xì)胞因子療法中，目前正在哮喘中研究用抗-IL-5、抗-IL-13、抗-TNF-α以及可溶的IL-4受體拮抗體的治療。小鼠中最新公開(kāi)的研究已突出了IL-13在變應(yīng)性哮喘發(fā)展過(guò)程中的作用。當(dāng)用截短形式的IL-13治療時(shí)，最初發(fā)展為哮喘-樣癥狀的小鼠呈現(xiàn)上述癥狀的減輕和消除。重組IL-13向原初小鼠的氣道的重復(fù)給藥誘導(dǎo)類(lèi)似的癥狀而證實(shí)這些病狀中IL-13的作用。這些報(bào)道和各種其他研究確定IL-13在小鼠過(guò)敏性氣道疾病并且推廣到人哮喘發(fā)展過(guò)程中的重要作用。人中最新的合作研究證實(shí)IL-13受體在多種細(xì)胞中的表達(dá)在人哮喘肺的活體檢查中發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)表明IL-13在氣道疾病關(guān)鍵特征的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用?；诖耍@性失活的IL-13受體可與天然IL-13受體配體競(jìng)爭(zhēng)或另外干擾IL-13信號(hào)途徑的組分的有效性代表了用于哮喘或過(guò)敏性鼻炎治療的一種新的治療途徑。IL-13受體轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建IL-13為最近被發(fā)現(xiàn)是介導(dǎo)動(dòng)物模型中過(guò)敏性哮喘必需的和充分的2型細(xì)胞因子。顯示了IL-13配體用IL-13受體的中和完全阻斷哮喘的表型，包括氣道過(guò)敏現(xiàn)象、IgE的產(chǎn)生和粘液分泌過(guò)多(SCIENCE，Dec1998)。本發(fā)明提供能通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)制備并且其后能遞送至氣道細(xì)胞的IL-13受體的顯性失活突變體。遞送后IL-13的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被阻斷，導(dǎo)致受體的抑制。治療結(jié)果為哮喘表型得到治療。因此選擇表達(dá)IL-13受體作為在乳汁中產(chǎn)生膜蛋白質(zhì)以及以使其能有效用于作為治療分子而產(chǎn)生的方式表達(dá)顯性失活的膜受體的一個(gè)實(shí)例。為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，IL-13受體的cDNA(獲自Invitrogen)被亞克隆進(jìn)入克隆載體puc19-2X以引入兩個(gè)XhoI位點(diǎn)，一個(gè)為起始密碼子的5′而另一個(gè)為終止密碼子的3′。IL-13受體cDNA的XhoI片段隨后被克隆進(jìn)入BC350生成BC948。該BC948轉(zhuǎn)基因包含在其C末端跟隨V5標(biāo)記和HisC標(biāo)記的完整IL-13受體編碼區(qū)。純化BC948的SalI/NotI片段用于顯微注射。轉(zhuǎn)基因建立者小鼠利用IL-13受體轉(zhuǎn)基因特異性寡核苷酸對(duì)通過(guò)PCR鑒定。IL-13受體在乳汁中的表達(dá)利用HRP綴合的抗-V5標(biāo)記抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定。對(duì)7只雌性轉(zhuǎn)基因建立者小鼠分析，5只在其乳汁中表達(dá)IL-3。IL-13受體表達(dá)的水平在0.1至0.25mg/ml范圍內(nèi)(圖3)。人IL-13受體的序列是已知的并且由本領(lǐng)域一些不同的作者呈現(xiàn)。以下為人IL-13受體的氨基序列SEQ.ID.No.1.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)NP_000631，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-人IL-13受體(380個(gè)氨基酸殘基)；(Wu等，(2003)；和David等，(2002))1mafvclaigclytflisttfgctsssdteikvnppqdfeivdpgylgylylqwqpplsld61hfkectveyelkyrnigsetwktiitknlhykdgfdlnkgieakihtllpwqctngsevq121sswaettywispqgipetkvqdmdcvyynwqyllcswkpgigvlldtnynlfywyegldh181alqcvdyikadgqnigcrfpyleasdykdfyicvngssenkpirssyftfqlqnivkplp241pvyltftressceiklkwsiplgpiparcfdyeieireddttlvtatvenetytlkttne301trqlcfvvrskvniycsddgiwsewsdkqcwegedlskktllrfwlpfgfililvifvtg361lllrkpntypkmipeffcdt鈣粘蛋白鈣粘蛋白組成細(xì)胞表面跨膜受體蛋白質(zhì)的家族，其由八組組成。最為人所知的鈣粘蛋白組稱(chēng)為“標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白”，在建立和維持細(xì)胞-細(xì)胞粘附復(fù)合物如粘著連接中起作用。標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白以二聚物簇起作用，而粘附強(qiáng)度通過(guò)改變細(xì)胞表面表達(dá)的二聚物數(shù)目和成簇的程度來(lái)調(diào)節(jié)。標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白結(jié)合胞質(zhì)連接蛋白質(zhì)，稱(chēng)為連環(huán)蛋白，其連接鈣粘蛋白至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。鈣粘蛋白簇通過(guò)形成細(xì)胞骨架構(gòu)架，其組織信號(hào)蛋白質(zhì)及其基質(zhì)形成三維復(fù)合物而調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞粘附的特異性以及細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)的變化而是組織形態(tài)發(fā)生必不可少的。鈣粘蛋白超家族由超過(guò)70種結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)組成，所有的蛋白質(zhì)都具有兩種性質(zhì)這些蛋白質(zhì)的胞外區(qū)結(jié)合鈣離子而正確折疊(由此鈣為Ca)并且這些蛋白質(zhì)粘附其他蛋白質(zhì)(由此，″粘附″)。鈣粘蛋白參與細(xì)胞-細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。所發(fā)現(xiàn)的鈣粘蛋白的第一個(gè)組包括在上皮細(xì)胞之間形成的粘著帶連接中發(fā)現(xiàn)的那些。這些目前稱(chēng)為″標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白″以與其更多較遠(yuǎn)相關(guān)的家族成員區(qū)分開(kāi)。所有標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白為具有單個(gè)膜-跨越結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)的氨基端的五個(gè)胞外域以及保守的胞質(zhì)C末端尾部的跨膜受體。脊椎動(dòng)物中，根據(jù)其首次發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)上皮、胎盤(pán)、神經(jīng)、視網(wǎng)膜和血管內(nèi)皮，五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白分別稱(chēng)為E-、P-、N-、R-和VE-鈣粘蛋白。標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白以在細(xì)胞表面上的二聚物簇起作用。這些二聚物結(jié)合相鄰細(xì)胞上相同的二聚物。N-和R-鈣粘蛋白對(duì)還彼此相互結(jié)合(異嗜性結(jié)合)。細(xì)胞可以通過(guò)活動(dòng)性調(diào)節(jié)而調(diào)控其粘附強(qiáng)度，其包括改變細(xì)胞表面上受體的總數(shù)和質(zhì)膜內(nèi)受體的橫向擴(kuò)散。不成簇的鈣粘蛋白不會(huì)與相鄰細(xì)胞形成強(qiáng)的粘附。這是鈣粘蛋白簇在細(xì)胞-細(xì)胞粘附中重要性的直接證據(jù)。提供該證據(jù)的實(shí)驗(yàn)是基于鈣粘蛋白胞質(zhì)尾區(qū)對(duì)二聚體形成很重要的事實(shí)(Yap等，1997)。標(biāo)準(zhǔn)鈣粘蛋白在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞粘附的強(qiáng)度和通過(guò)提供特異性細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別機(jī)制而起主導(dǎo)作用。例如，在發(fā)育過(guò)程中，E-鈣粘蛋白在胚囊形成時(shí)表達(dá)，且被認(rèn)為在緊密連接形成時(shí)提高細(xì)胞-細(xì)胞粘附而隨后上皮細(xì)胞在發(fā)育的胚胎中極化。不出意外，在發(fā)育過(guò)程早期E-鈣粘蛋白基因的遺傳敲除是致死的(Larue等，1994)。其他鈣粘蛋白家屬的功能性突變或敲除影響各式各樣器官的發(fā)育包括腦、脊索、肺和腎。所有這些發(fā)育事件共有的一個(gè)重要主題是稱(chēng)為內(nèi)陷的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的過(guò)程。例如，脊椎動(dòng)物中當(dāng)包括外胚層的細(xì)胞沿著胚胎外表面形成脊，其變深而成裂隙且隨后壓緊而形成神經(jīng)管時(shí)產(chǎn)生第一個(gè)神經(jīng)組織。為了形成該管，上皮細(xì)胞必須收縮其頂端結(jié)構(gòu)域和向內(nèi)彎曲，形成溝，隨后分離并且移至新的部位以閉合該管。類(lèi)似的運(yùn)動(dòng)在許多外胚層來(lái)源的組織的形成中發(fā)生，并且所有的都需要細(xì)胞-細(xì)胞接觸類(lèi)型的變化。鈣粘蛋白基因的缺失導(dǎo)致各式各樣的發(fā)育異常，如由于錯(cuò)誤靶向神經(jīng)元導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)技能缺乏，其還因上皮內(nèi)陷的錯(cuò)誤引起(Fesenko，2001)。其他目的分子阿立新受體SEQ.ID.No.2.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)NP_001516，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-人阿立新受體1(Sakurai，T.，等，(1998))(425個(gè)氨基酸)。1mepsatpgaqmgvppgsrepspvppdyedeflrylwrdylypkqyewvliaayvavfvva61lvgntlvclavwrnhhmrtvtnyfivnlsladvlvtaiclpasllvditeswlfghalck121vipylqavsvsvavltlsfialdrwyaichpllfkstarrargsilgiwavslaimvpqa181avmecssvlpelanrtrlfsvcderwaddlypkiyhscffivtylaplqlmamayfqifr241klwgrqipgttsalvrnwkrpsdqlgdleqglsgepqprgraflaevkqmrarrktakml301mvvllvfalcylpisvlnvlkrvfgmfrqasdreavyacftfshwlvyansaanpiiynf361lsgkfreqfkaafscclpglgpcgslkapsprssashkslslqsrcsiskisehvvltsv421ttvlpSEQ.ID.No.3.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)NP_001517，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-人阿立新受體2(deLecea，L.等，(1998))(444個(gè)氨基酸)。1msgtkledsppcrnwssaselnetqepflnptdyddeeflrylwreylhpkeyewvliag61yiivfvvalignvlvcvavwknhhmrtvtnyfivnlsladvlvtltclpatlvvditetw121ffgqslckvipylqtvsvsvsvltlscialdrwyaichplmfkstakrarnsiviiwivs181ciimipqaivmecstvfpglankttlftvcderwggeiypkmyhicfflvtymaplclmv241laylqifrklwcrqipgtssvvqrkwkplqpvsqprgpgqptksrmsavaaeikqirarr301ktarmlmvvllvfaicylpisilnvlkrvfgmfahtedretvyawftfshwlvyansaan361piiynflsgkfreefkaafsccclgvhhrqedrltrgrtstesrkslttqisnfdniskl421seqvvltsistlpaangagplqnw黑色素濃集激素受體SEQ.ID.No.4.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)NP_005288，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-黑色素濃集激素受體1(Pissios，P.，等，(2003))(422個(gè)氨基酸)。1msvgamkkgvgravglgggsgcqateedplpdcgacapgqggrrwrlpqpawvegssarl61weqatgtgwmdleasllptgpnasntsdgpdnltsagspprtgsisyiniimpsvfgtic121llgiignstvifavvkksklhwcnnvpdifiinlsvvdllfllgmpfmihqlmgngvwhf181getmctlitamdansqftstyiltamaidrylatvhpisstkfrkpsvatlvicllwals241fisitpvwlyarlipfpggavgcgirlpnpdtdlywftlyqfflafalpfvvitaayvri301lqrmtssvapasqrsirlrtkrvtrtaiaiclvffvcwapyyvlqltqlsisrptltfvy361lynaaislgyansclnpfvyivlcetfrkrlvlsvkpaaqgqlravsnaqtadeertesk421gtSEQ.ID.No.5.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)NP115892，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-黑色素濃集激素受體2(HillJ.，等，(2001))(340個(gè)氨基酸)。1mnpfhascwntsaellnkswnkefayqtasvvdtvilpsmigiicstglvgnilivftii61rsrkktvpdiyicnlavadlvhivgmpflihqwarggewvfggplctiitsldtcnqfac121saimtvmsvdryfalvqpfrltrwrtryktirinlglwaasfilalpvwvyskvikfkdg181vescafdltspddvlwytlyltittfffplplilvcyililcytwemyqqnkdarccnps241vpkqxvmkltkmvlvlvvvfilsaapyhviqlvnlqmeqptlafyvgyylsiclsyasss301inpflyillsgnfqkrlpqiqrratekeinnmgntlkshf成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-家族SEQ.ID.No.6.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P22455，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-4(PartanenJ.，等，(1991))(802個(gè)氨基酸)。1mrlllallgvllsvpgppvlsleaseevelepclapsleqqeqeltvalgqpvrlccgra61ergghwykegsrlapagrvrgwrgrleiasflpedagrylclargsmivlqnltlitgds121ltssnddedpkshrdpsnrhsypqqapywthpqrmekklhavpagntvkfrcpaagnptp181tirwlkdgqafhgenriggirlrhqhwslvmesvvpsdrgtytclvenavgsirynylld241vlersphrpilqaglpanttavvgsdvellckvysdaqphiqwlkhivingssfgadgfp301yvqvlktadinssevevlylrnvsaedageytclagnsiglsyqsawltvlpeedptwta361aapearytdiilyasgslalavllllaglyrgqalhgrhprppatvqklsrfplarqfsl421esgssgksssslvrgvrlsssgpallaglvsldlpldplwefprdrlvlgkplgegcfgg481vvraeafgmdparpdqastvavkmlkdnasdkdladlvsemevmkligrhkniinllgvc541tqegplyvivecaakgnlreflrarrppgpdlspdgprssegplsfpvlvscayqvargm601qylesrkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglargvhhidyykktsngrlpvkwmapea661ltdrvythqsdvwsfgillweiftlggspypgipveelfsllreghrmdrpphcppelyg721lmrecwhaapsqrptfkqlvealdkvllavseeyldlrltfgpyspsggdasstcsssds781vfshdplplgsssfpfgsgvqtSEQ.ID.No.7.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P22607，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3(Murgue，B.，等，(1991))(806個(gè)氨基酸)。1mgapacalalcvavaivagasseslgteqrvvgraaevpgpepgqqeqlvfgsgdavels61cpppgggpmgptvwvkdgtglvpservlvgpqrlqvlnashedsgayscrqrltqrvlch121fsvrvtdapssgddedgedeaedtgvdtgapywtrpermdkkllavpaantvrfrcpaag181nptpsiswlkngrefrgehriggiklrhqqwslvmesvvpsdrgnytcvvenkfgsirqt241ytldv1ersphrpilqaglpanqtavlgsdvefhckvysdaqphiqwlkhvevngskvgp301dgtpyvtvlktaganttdkelevlslhnvtfedageytclagnsigfshhsawlvvlpae361eelveadeagsvyagilsygvgfflfilvvaavtlcrlrsppkkglgsptvhkisrfplk421rqvslesnasmssntplvriarlssgegptlanvselelpadpkwelsrarltlgkplge481gcfgqvvmaeaigidkdraakpvtvavkmlkddatdkdlsdlvsememmkmigkhkniin541llgactqggplyvlveyaakgnlreflrarrppgldysfdtckppeeqltfkdlvscayq601vargmeylasqkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglardvhnldyykkttngrlpvkw661mapealfdrvythqsdvwsfgvllweiftlggspypgipveelfkllkeghrmdkpanct721hdlymimrecwhaapsqrptfkqlvedldrvltvtstdeyldlsapfeqyspggqdtpss781sssgddsvfahdllppappssggsrtSEQ.ID.No.8.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P21802，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(DionneC.A.，等，(1990))(821個(gè)氨基酸)。1mvswgrficlvvvtmatlslarpsfslvedttlepeepptkyqisqpevyvaapgeslev61rcllkdaaviswtkdgvhlgpnnrtvligeylqikgatprdsglyactasrtvdsetwyf121mvnvtdaissgddeddtdgaedfvsensnnkrapywtntekmekrlhavpaantvkfrcp181aggnpmptmrwlkngkefkqehriggykvrnqhwslimesvvpsdkgnytcvveneygsi241nhtyhldvversphrpilqaglpanastvvggdvefvckvysdaqphiqwikhvekngsk301ygpdglpylkvlkaagvnttdkeievlyirnvtfedageytclagnsigisfhsawltvl361papgrekeitaspdyleiaiycigvfliacmvvtvilcrmknttkkpdfssqpavhkltk421riplrrqvtvsaessssmnsntplvrittrlsstadtpmlagvseyelpedpkwefprdk481ltlgkplgegcfgqvvmaeavgidkdkpkeavtvavkmlkddatekdlsdlvsememmkm541igkhkniinllgactqdgplyviveyaskgnlreylrarrppgmeysydinrvpeeqmtf601kdlvsctyqlargmeylasqkcihrdlaarnvlvtennvmkiadfglardinnidyykkt661tngrlpvkwmapealfdrvythqsdvwsfgvlmweiftlggspypgipveelfkllkegh721rmdkpanctnelymmmrdcwhavpsqrptfkqlvedldriltlttneeyldlsqpleqys781psypdtrsscssgddsvfspdpmpyepclpqyphingsvktSEQ.ID.No.9.Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P11362，來(lái)自生物技術(shù)信息國(guó)家中心-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-1(IssacchiA.，等，(1990))(822個(gè)氨基酸)。1mswkcllfwavlvtatlctarpsptlpeqaqpwgapvevesflvhpgdllqlrcrlrdd61vqsinwlrdgvqlaesnrtritgeevevqdsvpadsglyacvtsspsgsdttyfsvnvsd121alpssedddddddssseeketdntkpnrmpvapywtspekmekklhavpaaktvkfkcps181sgtpnptlrwlkngkefkpdhriggykvryatwsiimdsvvpsdkgnytclveneygsln241htyqldvversphrpilqaglpanktvalgsnvefmckvysdpqphiqwlkhievngski301gpdnlpyvqilktagvnttdkemevlhlrnvsfedageytclagnsiglshhsawltvle361aleerpavmtsplyleiiiyctgafliscmvgsvivykmksgtkksdfhsgmavhklaks421iplrrqvtvsadssasmnsgvllvrpsrlsssgtpmlagvseyelpedprwelprdrlvl481gkplgegcfgqvvlaeaigldkdkpnrvtkvavkmlksdatekdlsdlisememmkmigk541hkniinllgactqdgplyviveyaskgnlreylqarrppgleycynpshnpeeqlsskdl601vscayqvargmeylaskkcihrdlaarnvlvtednvmkiadfglardihhidyykkttng661rlpvkwmapealfdriythqsdvwsfgvllweiftlggspypgvpveelfkllkeghrmd721kpsnctnelymmmrdcwhavpsqrptfkqlvedldrival材料和方法如GavinW.G.1996中所述，此處特別引入作為參考，進(jìn)行用作卵細(xì)胞供體的供體的同步發(fā)情和超數(shù)排卵，以及顯微操作。如之前上文所述，還進(jìn)行初級(jí)體細(xì)胞的分離和建立以及用作核體供體的體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和制備。初級(jí)體細(xì)胞為分化的非生殖細(xì)胞，其獲自利用標(biāo)準(zhǔn)的基于脂類(lèi)的轉(zhuǎn)染方案目的基因轉(zhuǎn)染的動(dòng)物組織。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)檢驗(yàn)并且是如Baguisi等，1999中所述培養(yǎng)和制備的轉(zhuǎn)基因-陽(yáng)性細(xì)胞，它們用作核移植的供體細(xì)胞。還應(yīng)當(dāng)記住的是去核和重建過(guò)程可以在有或沒(méi)有用DNA染料Hoechst33342或其他用于顯現(xiàn)核酸的熒光光敏性組合物將細(xì)胞染色下進(jìn)行。然而優(yōu)選，以大約0.1-5.0μg/ml使用Hoechst33342用于遺傳物質(zhì)在赤道板處發(fā)光。山羊用于該研究的無(wú)羊搔癢癥的阿爾卑斯式、薩能和多根堡奶山羊的純的和混合配種的畜群按照優(yōu)質(zhì)農(nóng)業(yè)規(guī)范(GoodAgroculturePractice)(GAP)指南飼養(yǎng)。山羊胎兒體細(xì)胞系的分離用作核體供體的原始山羊胎兒成纖維細(xì)胞系源自通過(guò)用從轉(zhuǎn)基因的雄性動(dòng)物新收集的精子向2只非轉(zhuǎn)基因母畜人工受精而產(chǎn)生的35-和40-天的胎兒。胎兒經(jīng)外科手術(shù)取出并且置于平衡磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，無(wú)Ca++/Mg++)中。通過(guò)剪碎在38℃暴露于0.025％胰蛋白酶、0.5mMEDTA10分鐘的胎兒組織而制備單細(xì)胞懸液。用胎兒細(xì)胞培養(yǎng)基[用核苷、0.1mM2-巰基乙醇、2mML-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/ml)補(bǔ)充的含有10％胎牛血清(FBS)的平衡的199培養(yǎng)基(M199，Gibco)]洗滌細(xì)胞，并且在25cm2細(xì)頸瓶中培養(yǎng)。原始胎兒細(xì)胞匯合的單層在孵育4天后通過(guò)胰蛋白酶消化而采集并且隨后在培養(yǎng)物中維持或冷藏。供體細(xì)胞系的性別鑒定和基因分型從胎兒組織分離基因組DNA，并且通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析靶信號(hào)序列以及用于性別鑒定的序列的存在。目標(biāo)轉(zhuǎn)基因序列通過(guò)367-bp序列的擴(kuò)增而檢測(cè)。利用zfX/zfY引物對(duì)和擴(kuò)增片段的SacI限制性?xún)?nèi)切酶消化進(jìn)行性別鑒定。用于胚胎重建的供體細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)基因母系(CFF6)用于所有的核移植過(guò)程。胎兒體細(xì)胞接種在有胎兒細(xì)胞培養(yǎng)基的4-孔平皿中并且在培養(yǎng)物中維持(5％CO2，39℃)。48小時(shí)后，培養(yǎng)基用新鮮的低血清(0.5％FBS)胎兒細(xì)胞培養(yǎng)基替換。在過(guò)了接下來(lái)的7天后每48至72小時(shí)用低血清的胎兒細(xì)胞培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在低血清培養(yǎng)基第一次添加后的第7天，體細(xì)胞(用作核體供體)通過(guò)胰蛋白酶消化采集。在融合至去核卵細(xì)胞之前細(xì)胞重懸于用2mML-谷氨酰胺，1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/ml)補(bǔ)充的含有10％FBS的平衡M199中1至3小時(shí)。卵細(xì)胞采集如之前所述(GavinW.G.，1996)進(jìn)行卵細(xì)胞供體同步化和超排卵，并且與切除輸精管的雄性以超過(guò)48-小時(shí)的間隔交配。采集后，卵細(xì)胞在用2mML-谷氨酰胺和1％青霉素/鏈霉素(10,000I.U.每種/ml)補(bǔ)充的含有10％FBS的平衡M199中培養(yǎng)。胞質(zhì)體制備和去核棄去附著卵丘細(xì)胞的卵細(xì)胞。將無(wú)卵丘的卵細(xì)胞分成兩組停滯在分裂中期-II(一個(gè)極體)和分裂末期-II的方案(沒(méi)有清楚可見(jiàn)的極體或部分排出的第二極體的存在)。停滯在分裂中期-II方案的卵細(xì)胞首先去核。分配至活化的分裂末期-II方案的卵細(xì)胞通過(guò)在M199/10％FBS中培養(yǎng)2至4小時(shí)而制備。該時(shí)期后，所有活化的卵細(xì)胞(部分排出的第二極體存在)分為培養(yǎng)-誘導(dǎo)的、鈣-活化的分裂末期-II卵細(xì)胞(分裂末期-II-Ca)和去核組。在培養(yǎng)期未活化的卵細(xì)胞隨后在包含7％乙醇的M199，10％FBS中孵育5分鐘以誘導(dǎo)活化并且隨后在含有10％FBS的M199中培養(yǎng)另外的3小時(shí)以達(dá)到分裂末期-II(分裂末期-II-EtOH方案)。所有卵細(xì)胞用細(xì)胞分裂抑素-B(Sigma，含有10％FBS的M199中5μg/ml)在去核前處理15至30分鐘。分裂中期-II時(shí)期卵細(xì)胞用25至30μm的玻璃吸管通過(guò)吸出第一個(gè)極體和鄰近的胞質(zhì)環(huán)繞的極體(胞質(zhì)的約30％)以除去赤道板而去核。分裂末期-II-Ca和分裂末期-II-EtOH卵細(xì)胞通過(guò)除去第一個(gè)極體和包含部分排出的第二極體的環(huán)繞胞質(zhì)(胞質(zhì)的10至30％)而去核。去核后，所有卵細(xì)胞立即重建。核移植和重建在用于卵細(xì)胞去核的相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行供體細(xì)胞注射。利用玻璃吸管將一個(gè)供體細(xì)胞置于透明帶和卵質(zhì)膜之間。電融合和活化過(guò)程之前該細(xì)胞-卵細(xì)胞偶聯(lián)體在M199中孵育30至60分鐘。重建的卵細(xì)胞在融合緩沖液(300mM甘露糖醇、0.05mMCaCl2、0.1mMMgSO4、1mMK2HPO4、0.1mM谷胱甘肽、0.1mg/mlBSA)中平衡2分鐘。室溫下在裝滿(mǎn)融合培養(yǎng)基的、做成″融合載玻片″(500μm間隙；BTX-Genetronics，SanDiego，CA)的帶有2個(gè)不銹鋼電極的融合室中進(jìn)行電融合和活化。利用融合載玻片進(jìn)行融合。融合載玻片置于融合平皿內(nèi)部，并且該平皿充滿(mǎn)足夠量的融合緩沖液以覆蓋融合載玻片的電極。從培養(yǎng)溫箱移出偶聯(lián)體并且用融合緩沖液洗滌。利用解剖顯微鏡，偶聯(lián)體等距離地置于電極之間，核體/胞質(zhì)體結(jié)合處平行于電極。值得注意的是為了促進(jìn)活化和融合而施于該偶聯(lián)體的電壓范圍可在1.0kV/cm至10.0kV/cm。然而優(yōu)選，最初單獨(dú)的同時(shí)融合和活化的電脈沖電壓范圍為2.0至3.0kV/cm，最優(yōu)選2.5kV/cm，優(yōu)選至少20μs持續(xù)時(shí)間。此利用BTXECM2001ElectrocellManipulator施加至細(xì)胞偶聯(lián)體。微脈沖的持續(xù)時(shí)間可為10至80μs。該過(guò)程后處理的偶聯(lián)體一般轉(zhuǎn)至新鮮的融合緩沖液滴。融合處理的偶聯(lián)體用平衡的SOF/FBS洗滌，隨后轉(zhuǎn)入有或沒(méi)有細(xì)胞分裂抑素-B的平衡的SOF/FBS。如果使用細(xì)胞分裂抑素-B，其濃度可為1至15μg/ml，最優(yōu)選5μg/ml。偶聯(lián)體在空氣中包含大約5％CO2的濕潤(rùn)氣室中37-39℃孵育。應(yīng)當(dāng)注意的是本發(fā)明提供的任何方案中均可用甘露糖醇替代細(xì)胞分裂抑素-B(含有Ca+2和BSA的HEPES-緩沖的甘露糖醇(0.3mm)基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。融合后10至90分鐘之間開(kāi)始，最優(yōu)選在融合后30分鐘，測(cè)定真正核體/胞質(zhì)體融合的存在。根據(jù)本發(fā)明的目的融合的偶聯(lián)體可接受另外的活化處理(雙脈沖)。另外的脈沖電壓強(qiáng)度方面可為0.1至5.0kV/cm，時(shí)間為10至80μs。然而優(yōu)選，融合的偶聯(lián)體接受0.4或2.0kV/cm的另外的單個(gè)電脈沖(雙脈沖)20μs?？稍诘谝粋€(gè)脈沖至少15分鐘后開(kāi)始另一個(gè)脈沖的傳遞，然而最優(yōu)選，另一個(gè)脈沖開(kāi)始于最初的融合和活化處理后30分鐘至2小時(shí)的時(shí)候以促進(jìn)另外的活化。在其他的實(shí)驗(yàn)中，非融合的偶聯(lián)體用單個(gè)電脈沖重-融合。最初的融合脈沖后至少15分鐘時(shí)產(chǎn)生的另一個(gè)脈沖的電壓和時(shí)間范圍可為1.0kV/cm至5.0kV/cm，至少10μs。然而更優(yōu)選，在最初的融合和活化后30分鐘至1小時(shí)的時(shí)候開(kāi)始的該另一個(gè)電脈沖為2.2至3.2kV/cm，20μs以促進(jìn)融合。所有融合的和融合處理的偶聯(lián)體返回至添加5μg/ml細(xì)胞分裂抑素-B的SOF/FBS。偶聯(lián)體在空氣中包含大約5％CO2的濕潤(rùn)氣室中37-39℃孵育至少20分鐘，優(yōu)選30分鐘。本發(fā)明當(dāng)前方法的另外的方案提供在最初的融合和活化處理后至少15分鐘，優(yōu)選30分鐘至1小時(shí)開(kāi)始的、用于細(xì)胞偶聯(lián)體的另外的單個(gè)電脈沖(雙脈沖)，優(yōu)選2.0kV/cm，至少20μs以促進(jìn)另外的活化。用于該另外活化的脈沖的電壓范圍可為1.0至6.0kV/cm?；蛘?，在隨后的工作中剩余的融合的偶聯(lián)體接受在最初的融合和活化處理后至少30分鐘開(kāi)始的、最優(yōu)選2.0kV/cm，20μs，15至30分鐘間隔的至少三個(gè)另外的單個(gè)電脈沖(四脈沖)以促進(jìn)另外的活化。然而，應(yīng)當(dāng)注意的是在該另外的方案中該另外活化脈沖的電壓范圍可為1.0至6.0kV/cm，持續(xù)時(shí)間可為10μs至60μs，其起始可在短至最初的融合處理后15分鐘或長(zhǎng)至4小時(shí)后。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，非融合的偶聯(lián)體用起始于最初的融合和活化處理后1小時(shí)的2.6至3.2kV/cm的單個(gè)電脈沖20μs以促進(jìn)融合而重-融合。所有融合的和融合處理的偶聯(lián)體返回至有或沒(méi)有細(xì)胞分裂抑素-B的SOF/FBS。如果使用細(xì)胞分裂抑素-B，其濃度可為1至15μg/ml，最優(yōu)選5μg/ml。偶聯(lián)體在空氣中包含大約5％CO2的濕潤(rùn)氣室中37-39℃孵育至少30分鐘?？捎酶事短谴继娲?xì)胞分裂抑素-B。重-融合后30分鐘開(kāi)始，測(cè)定到核體/胞質(zhì)體重-融合的成功。融合處理的偶聯(lián)體用平衡的SOF/FBS洗滌，隨后轉(zhuǎn)入添加5μg/ml放線菌酮的平衡的SOF/FBS。偶聯(lián)體在空氣中包含大約5％CO2的濕潤(rùn)氣室中37-39℃孵育至多4小時(shí)。放線菌酮處理后，偶聯(lián)體用至少0.1％牛血清白蛋白，優(yōu)選至少0.7％，優(yōu)選0.8％，加上100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素補(bǔ)充的平衡的SOF培養(yǎng)基(SOF/BSA)多次洗滌。偶聯(lián)體轉(zhuǎn)入平衡的SOF/BSA，并且在包含大約6％O2，5％CO2，其余為氮?dú)獾臐駶?rùn)的模塊孵育室中37-39℃靜止培養(yǎng)24-48小時(shí)。具有適當(dāng)發(fā)育時(shí)期(24至48小時(shí)時(shí)1-細(xì)胞至8-細(xì)胞)的核移植胚胎轉(zhuǎn)入替代同步化受體。核移植胚胎的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)入受體所有核移植胚胎在用礦物油覆蓋的50μl含有10％FBS的M199的液滴中，在原始山羊輸卵管上皮細(xì)胞單細(xì)胞層上共-培養(yǎng)。胚胎移植至受體之前，胚胎培養(yǎng)物在具有5％CO2的濕潤(rùn)的39℃溫箱中維持48小時(shí)。受體胚胎移植如之前所述進(jìn)行22。妊娠和圍產(chǎn)期照管對(duì)于山羊，在發(fā)情期第一天后的第25天開(kāi)始通過(guò)超聲波檢查確定妊娠。每周評(píng)估直至妊娠的第75天，并且其后一月一次評(píng)估胎兒的存活力。對(duì)于持續(xù)超過(guò)152天的妊娠，用5mgPGF2α(Lutalyse，Upjohn)誘導(dǎo)分娩。處理后24小時(shí)內(nèi)發(fā)生分娩。出生后羊羔立即從母畜移出，并且產(chǎn)后1小時(shí)內(nèi)接受經(jīng)加熱處理的初乳。所克隆動(dòng)物的基因分型出生后不久，從所克隆的雌性動(dòng)物(例如，山羊)和替代母畜獲得血樣和耳朵皮膚的活體檢查用于基因組DNA的分離。每個(gè)樣品首先利用特異性轉(zhuǎn)基因靶蛋白的引物通過(guò)PCR分析，并且隨后利用特異靶蛋白的cDNA經(jīng)Southern印跡分析。對(duì)于每個(gè)樣品，用EcoRI(NewBnglandBiolabs，Beverly，MA)消化5μg基因組DNA，在0.7％瓊脂糖凝膠(SeaKem，ME)中電泳并且通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法后的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移固定至尼龍膜(MagnaGraph，MSI，Westboro，MA)上。利用Prime-It試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)經(jīng)α-32PdCTP標(biāo)記的1.5kbXhoI至SalIhATcDNA片段探測(cè)膜。雜交在65℃過(guò)夜進(jìn)行。斑點(diǎn)用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌并且暴露于X-OMATTMAR感光膠片48小時(shí)。乳汁的蛋白質(zhì)分析對(duì)幼年的雌性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行兩個(gè)月-時(shí)期泌乳的激素誘導(dǎo)。該動(dòng)物每天一次用手?jǐn)D奶以收集用于hAT表達(dá)分析的乳汁樣品。蛋白質(zhì)印跡和rhAT活性分析如上述進(jìn)行(Edmunds，T.等，1998)。在本發(fā)明開(kāi)發(fā)過(guò)程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，去核和重建后，核體/胞質(zhì)體偶聯(lián)體在用1％至15％胎牛血清，優(yōu)選10％FBS，加入100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素補(bǔ)充的平衡的合成輸卵管液體培養(yǎng)基(SOF/FBS)中孵育。融合前偶聯(lián)體在空氣中包含大約5％CO2的濕潤(rùn)氣室中37-39℃孵育至少30分鐘。本發(fā)明允許通過(guò)提供活化和融合的轉(zhuǎn)基因胚胎另外的生成而提高轉(zhuǎn)基因方法的效率。這些胚胎可移植入替代動(dòng)物中或可無(wú)性繁殖以及儲(chǔ)存或使用。此外通過(guò)核移植與體外修飾和選擇這些細(xì)胞的能力的結(jié)合，該方法比先前的轉(zhuǎn)基因胚胎技術(shù)更有效。根據(jù)本發(fā)明，這些轉(zhuǎn)基因克隆的胚胎可用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞系或其他的胚細(xì)胞系。因此，本發(fā)明消除了這種必要-獲得和體外維持有益于遺傳工程技術(shù)的未分化細(xì)胞系。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于克隆哺乳動(dòng)物的方法。通常，哺乳動(dòng)物可通過(guò)包括以下步驟的核移植方法產(chǎn)生(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得卵細(xì)胞；(iii)將所述的卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；(v)同時(shí)融合和活化細(xì)胞偶聯(lián)體以形成轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)基因胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；和(vii)將所述轉(zhuǎn)基因胚胎移植入宿主哺乳動(dòng)物中使得胚胎發(fā)育成胎兒；其中所述的轉(zhuǎn)基因胚胎包含目的跨膜受體蛋白的DNA序列。本發(fā)明還包括克隆遺傳改造的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物的方法，通過(guò)該方法，在該分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵細(xì)胞之前，在該分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去或修飾所需的基因。本發(fā)明還提供根據(jù)上述方法獲得的哺乳動(dòng)物，以及那些哺乳動(dòng)物的子代。本發(fā)明優(yōu)選用于克隆山羊。本發(fā)明進(jìn)一步提供在細(xì)胞、組織和器官移植的領(lǐng)域中核移植胎兒和核移植以及嵌合子代的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞的方法。該方法包括(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得卵細(xì)胞；(iii)將所述的卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；(v)同時(shí)融合和活化細(xì)胞偶聯(lián)體以形成轉(zhuǎn)基因胚胎；(vii)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)基因胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；和(viii)培養(yǎng)獲自所述培養(yǎng)活化的胚胎的細(xì)胞以獲得CICM細(xì)胞；其中所述的轉(zhuǎn)基因胚胎包含目的跨膜受體蛋白的DNA序列。此外，源自此處所述方法的CICM細(xì)胞可方便地用于細(xì)胞、組織和器官移植的領(lǐng)域，或用于胎兒或子代，包括轉(zhuǎn)基因的胎兒或子代的產(chǎn)生中。分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為已經(jīng)過(guò)早期胚胎時(shí)期的那些細(xì)胞。已分化的細(xì)胞可源自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層組織或細(xì)胞層。還可使用一種替代方法，其中細(xì)胞偶聯(lián)體暴露于多次電擊以增強(qiáng)融合和活化。通常，哺乳動(dòng)物可通過(guò)包括以下步驟的核移植方法產(chǎn)生(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得卵細(xì)胞；(iii)將所述的卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；施加至少兩次電擊給細(xì)胞-偶聯(lián)體以引發(fā)所述細(xì)胞偶聯(lián)體的融合和活化而成為活化的和融合的胚胎，(vii)培養(yǎng)所述的活化和融合的胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；和(viii)將所述第一個(gè)和/或第二個(gè)轉(zhuǎn)基因胚胎移植入宿主哺乳動(dòng)物中使得胚胎發(fā)育成胎兒；其中所述的至少兩次電擊的第二次在最初電擊的至少15分鐘后給予。哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞，可通過(guò)眾所周知的方法獲得。對(duì)本發(fā)明有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，舉例來(lái)說(shuō)，上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞及其他肌細(xì)胞等等。此外，用于核移植的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可從不同器官獲得，例如，皮膚、肺、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎、尿道及其他泌尿器官等等。這些僅僅為合適的供體細(xì)胞的實(shí)例。合適的供體細(xì)胞，即對(duì)本發(fā)明有用的細(xì)胞可從身體的任何細(xì)胞或器官獲得。此包括所有的體或生殖細(xì)胞。成纖維細(xì)胞為一種理想的細(xì)胞類(lèi)型，因?yàn)槠淇纱罅康貜恼l(fā)育的胎兒和成年動(dòng)物獲得。成纖維細(xì)胞為有點(diǎn)分化的以及因此，先前被認(rèn)為是用于克隆方法的不良細(xì)胞類(lèi)型。重要的是，這些細(xì)胞可在體外以快速的倍增時(shí)間很容易地繁殖并且可經(jīng)無(wú)性繁殖用于基因?qū)ぐ蟹椒ㄖ?。此外由于使用已分化的?xì)胞類(lèi)型，本發(fā)明是新的。因?yàn)榧?xì)胞可在體外很容易地繁殖、遺傳修飾和選擇，所以本發(fā)明是方便的。卵細(xì)胞的合適的哺乳動(dòng)物來(lái)源包括山羊、綿羊、牛、豬、兔、豚鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類(lèi)等等。優(yōu)選，卵細(xì)胞獲自山羊和有蹄類(lèi)，并且最優(yōu)選山羊。用于卵細(xì)胞分離的方法在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?。主要地，此將包括從哺乳?dòng)物，例如山羊的卵巢或生殖道分離卵細(xì)胞。山羊卵細(xì)胞的易于獲得的來(lái)源來(lái)自激素誘導(dǎo)的母畜。為了如遺傳工程、核移植和克隆技術(shù)的成功應(yīng)用，在這些細(xì)胞可被用作核移植的受體細(xì)胞之前，以及在其可通過(guò)精子受精而發(fā)育成為胚胎之前，卵細(xì)胞可優(yōu)選在體內(nèi)成熟。分裂中期II時(shí)期的卵細(xì)胞，其已在體內(nèi)成熟，已經(jīng)成功地用于核移植技術(shù)中?；旧?，成熟的分裂中期II卵細(xì)胞從發(fā)情期開(kāi)始后或人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類(lèi)似的激素注射后的幾個(gè)小時(shí)非超排卵或超排卵動(dòng)物通過(guò)手術(shù)收集。此外，應(yīng)當(dāng)注意的是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾動(dòng)物基因組的能力提供了用于重組蛋白質(zhì)制造的新的替代方案。轉(zhuǎn)基因農(nóng)畜乳汁中人重組藥物的產(chǎn)生解決了涉及微生物生物反應(yīng)器(例如，缺乏翻譯后修飾、錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)折疊、高純化成本)或動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器(例如，高投資費(fèi)用、昂貴的培養(yǎng)基、低產(chǎn)量)的許多問(wèn)題。已報(bào)道在去核和核移植時(shí)卵細(xì)胞的成熟階段對(duì)于核移植方法的成功是很重要的。(First和Prather1991)。通常，成功的哺乳動(dòng)物胚胎克隆操作使用分裂中期II時(shí)期的卵細(xì)胞作為受體卵細(xì)胞，因?yàn)檎J(rèn)為在該時(shí)期，卵細(xì)胞可以被“活化”或被充分″活化″以象處理受精精子一樣處理引入的細(xì)胞核。家畜中，尤其是山羊，卵細(xì)胞的活化期通常發(fā)生在精子接觸和穿透進(jìn)入卵細(xì)胞質(zhì)膜的時(shí)候。定時(shí)的成熟期后，其約10至40小時(shí)，優(yōu)選約16-18小時(shí)，卵細(xì)胞被去核。去核之前，卵細(xì)胞在卵丘細(xì)胞除去之前優(yōu)選被移出且置于每毫升包含1毫克透明質(zhì)酸酶的EMCARE培養(yǎng)基中。此可通過(guò)用很細(xì)內(nèi)徑的吸管反復(fù)吹吸或通過(guò)簡(jiǎn)短地渦旋而完成。剝離的卵細(xì)胞隨后用于篩選極體，并且所選的通過(guò)極體的存在而測(cè)定的分裂中期II卵細(xì)胞隨后用于核移植。隨后去核。去核可通過(guò)如美國(guó)專(zhuān)利4,994,384中所述的已知方法完成，此處引入作為參考。例如，分裂中期II卵細(xì)胞可置于EMCARE培養(yǎng)基中，優(yōu)選包含每毫升7.5微克的細(xì)胞分裂抑素B，用于立即去核，或者可置于合適的培養(yǎng)基中，例如諸如添加10％FBS的CRlaa的胚胎培養(yǎng)基中，并且隨后去核，優(yōu)選不超過(guò)24小時(shí)之后，更優(yōu)選16-18小時(shí)后。去核可利用微量移液管顯微操作完成以除去極體和鄰近的胞質(zhì)。卵細(xì)胞可隨后經(jīng)篩選以鑒定其中已經(jīng)成功去核的那些。該篩選可通過(guò)用每毫升EMCARE或SOF中1微克33342Hoechst染料染色卵細(xì)胞，并且隨后在紫外線照射下觀察卵細(xì)胞少于10秒鐘而完成。已經(jīng)成功去核的卵細(xì)胞隨后可置于合適的培養(yǎng)基中。在本發(fā)明中，受體卵細(xì)胞優(yōu)選是在體外或體內(nèi)成熟起始后約10小時(shí)至約40小時(shí)范圍內(nèi)去核的，更優(yōu)選在體外或體內(nèi)成熟起始后從約16小時(shí)至約24小時(shí)的，而最優(yōu)選在體外或體內(nèi)成熟起始后約16-18小時(shí)的。與去核卵細(xì)胞相同種類(lèi)的單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞隨后將移植入所用去核卵細(xì)胞的卵黃膜周隙中以產(chǎn)生活化的胚胎。哺乳動(dòng)物細(xì)胞和去核的卵細(xì)胞將根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法用于產(chǎn)生活化的胚胎。例如，細(xì)胞可通過(guò)電融合而融合。電融合通過(guò)提供足以引起質(zhì)膜瞬間擊穿的電脈沖而完成。由于膜快速重組，這種質(zhì)膜的擊穿是很短暫的。因此，如果兩個(gè)鄰近的膜被誘導(dǎo)擊穿并且在重組時(shí)脂雙分子層混合，則兩個(gè)細(xì)胞之間將打開(kāi)小的通道。由于這種小孔隙的熱力學(xué)不穩(wěn)定性，其擴(kuò)大直至兩個(gè)細(xì)胞成為一體。對(duì)于該方法的進(jìn)一步討論，參見(jiàn)Prather等的美國(guó)專(zhuān)利4,997,384(此處整體引入作為參考)?？墒褂酶鞣N電融合培養(yǎng)基包括例如，蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇和磷酸鹽緩沖溶液。還可以利用仙臺(tái)病毒作為融合劑完成融合(Ponimaskin等，2000)。此外，有時(shí)候(例如使用小的供體細(xì)胞核)相比利用電穿孔融合，將細(xì)胞核直接注射入卵細(xì)胞可能是優(yōu)選的。這樣的技術(shù)在Collas和Barnes，MOL.REPROD.DEV.，38264-267(1994)中公開(kāi)，此處整體引入作為參考。活化的胚胎可通過(guò)已知的方法活化。這樣的方法包括，例如，在亞-生理學(xué)溫度培養(yǎng)活化的胚胎，基本上通過(guò)將冷的，或?qū)嶋H上涼的溫度沖擊應(yīng)用至該活化的胚胎。通過(guò)在室溫下培養(yǎng)該活化的胚胎可能是最方便完成的，其相對(duì)于胚胎通常暴露的生理學(xué)溫度條件是冷的?；蛘?，可通過(guò)已知的活化劑的應(yīng)用完成活化。例如，已表明核移植后在受精期間卵細(xì)胞經(jīng)精子的穿透可活化灌注的卵細(xì)胞而產(chǎn)生更多數(shù)量的活的妊娠胎以及多個(gè)遺傳相同的幼仔。此外，如電和化學(xué)沖擊的處理可用于在融合后活化NT胚胎。合適的卵細(xì)胞活化法為Susko-Parrish等的美國(guó)專(zhuān)利5,496,720的主題，此處整體引入作為參考。另外，活化最好同時(shí)完成，雖然確實(shí)存在按序活化的方案。通過(guò)活化發(fā)生以下細(xì)胞事件(i)提高卵細(xì)胞中二價(jià)陽(yáng)離子的水平，和(ii)降低卵細(xì)胞中細(xì)胞蛋白質(zhì)的磷酸化作用。上述事件可通過(guò)將二價(jià)陽(yáng)離子例如鎂、鍶、鋇或鈣，例如以離子載體的形式引入卵細(xì)胞胞質(zhì)中，經(jīng)外源刺激而發(fā)生。提高二階陽(yáng)離子水平的其他方法包括電擊的使用，乙醇的處理和籠狀(caged)螯合劑的處理。用已知方法可以降低磷酸化作用，例如，通過(guò)激酶抑制劑的加入，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑，例如6-二甲基氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。或者，胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化可以通過(guò)向卵細(xì)胞中導(dǎo)入磷酸酶，例如磷酸酶2A和磷酸酶2B而抑制。治療組合物本發(fā)明的蛋白質(zhì)可根據(jù)已知的方法配制以制備藥學(xué)有用的組合物，在此本發(fā)明的分子或其功能衍生物與藥學(xué)可接受載體賦形劑混合而組合。例如，為了形成適于有效給藥的藥學(xué)可接受組合物，描述了合適的賦形劑和包括其他的人蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白的制劑，所述組合物包含有效量的本發(fā)明的一種或多種蛋白質(zhì)以及合適量的載體賦形劑。用于本發(fā)明的藥物組合物可利用一種或多種生理可接受的載體或賦形劑以常規(guī)方法配制。因此，重組跨膜受體蛋白質(zhì)和其生理學(xué)可接受鹽和溶劑化物可經(jīng)配制而用于通過(guò)吸入法或吹入法(通過(guò)口或鼻子)或口服、口腔含化的、腸胃外的或直腸的給藥。對(duì)于口服給藥，藥物組合物可采取例如片劑或膠囊的形式，其通過(guò)常規(guī)方法與藥學(xué)可接受賦形劑如粘合劑(例如，預(yù)凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或潤(rùn)濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)而制備。片劑可用本領(lǐng)域熟知的方法包衣。用于口服的液體制劑可采取例如溶液、糖漿劑或懸浮液的形成，或者其在與水或其他合適的賦形劑組合使用前可以干燥的產(chǎn)品存在。上述液體制劑可通過(guò)常規(guī)方法與藥學(xué)可接受的添加劑如懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖錐素衍生物或氫化的食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性賦形劑(例如，杏仁油、油酯、乙醇或分餾的植物油)；以及防腐劑(例如，甲基或丙基-對(duì)-羥基苯甲酸酯或山梨酸)制備。視情況，該制劑還可包含緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑。用于口服的制劑可適當(dāng)配制以使活性化合物受控釋放。對(duì)于口腔含化給藥組合物可采取用常規(guī)方法配制的片劑或糖錠形式。對(duì)于通過(guò)吸入法的給藥，用于本發(fā)明的重組跨膜受體以用密閉包裝或噴霧器呈遞的氣霧噴劑的形式，借助合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體而方便地遞送。在密閉氣霧劑的情況下，劑量單位可通過(guò)提供一個(gè)用于遞送計(jì)量量的閥而確定。用于吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒可配制成包含化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。本發(fā)明的重組跨膜受體可配制用于通過(guò)注射，例如通過(guò)快速濃注或連續(xù)輸注的腸胃外給藥。用于注射的制劑可以和添加的防腐劑一起以單位劑型存在，例如，在安瓿中或在多-劑量容器中。該組合物可采取如油或水性賦形劑中的懸浮液、溶液或乳液形式并且可包含配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是粉劑形式而在使用前用于和合適的賦形劑，例如無(wú)菌的無(wú)熱原水組合。該化合物還可配制為直腸組合物如栓劑或滯留灌腸劑，例如包含常規(guī)的栓劑成分如可可脂或其他的甘油酯。除了之前描述的制劑，本發(fā)明的重組跨膜受體蛋白質(zhì)還可配制為長(zhǎng)效制劑。上述長(zhǎng)效制劑可通過(guò)植入(例如皮下或肌內(nèi))或通過(guò)肌肉注射而給藥。因此，例如，該化合物可與合適的聚合或疏水材料(例如可接受的油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂或如微溶的衍生物，例如微溶鹽一起配制。如果需要，該組合物可存在于包裝或分配器裝置中，其包含一種或多種包含活性成分的單位劑型。該包裝可例如包括金屬或塑料薄膜，如泡罩包裝。該包裝或分配器裝置可附有給藥的說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的一些重組跨膜受體蛋白質(zhì)在癌癥治療中是治療有效的(FGFR1至4)。因此其可以與常規(guī)化療劑或有用于目的化合物靶向遞送的其他試劑聯(lián)合配制。常規(guī)化療劑包括烷化劑、抗代謝物、各種天然產(chǎn)品(例如，長(zhǎng)春花堿、表鬼臼毒素、抗生素和氨基酸-減少的酶)、激素和激素拮抗藥。試劑的特定種類(lèi)包括氮芥、烷基磺酸酯、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類(lèi)似物、嘧啶類(lèi)似物、嘌呤類(lèi)似物、鉑復(fù)合物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑、腎上腺類(lèi)固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素藥和雄激素。一些典型的化合物包括環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、氨甲喋呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、硫鳥(niǎo)嘌呤、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、紅比霉素、絲裂霉素、順氯氨鉑、羥基脲、脫氫可的松、己酸羥孕酮、甲羥基孕酮、甲地孕酮、乙芪酚、乙炔雌二醇、三苯氧胺、丙酸睪酮和氟羥甲睪酮。在治療乳腺癌中，例如優(yōu)選三苯氧胺。因此，可以理解的是此處提供的用于跨膜受體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的本發(fā)明的實(shí)施方案僅僅用于解釋本發(fā)明原理的應(yīng)用。根據(jù)上面的描述很顯然的是用于要求保護(hù)的轉(zhuǎn)基因生物藥物的治療用途所公開(kāi)方法的形式的變化、所用的方法和要素的應(yīng)用是新的，并且可以在不背離本發(fā)明的精神或所附的權(quán)利要求的范圍下進(jìn)行改進(jìn)和/或借用。引用的和引入作為參考的文獻(xiàn)1.AlberioR，等，MammalianOocyteActivationLessonsfromtheSpermandImplicationsforNuclearTransfer，INTJDEVBIOL2001；45797-809。2.AlberioR，等，RemodelingofDonorNuclei，DNASynthesis，andPloidyofBovineCumulusCellNuclearTransferEmbryosEffectofActivationProtocol，MOLREPRODDEV2001；59371-379。3.BaguisiA，等，ProductionofGoatsbySomaticCellNuclearTransfer，NATBIOTECH1999；17456-461。4.BertoglioD.M.，TNF-αPotentiatesIL-4/IL-13-inducedIL-13R-alpha2expression，ANN.N.Y.ACAD.Sci.973207-09(2002)。5.BondioliKR，WesthusinMEAndCRLoony，ProductionofIdenticalBovineOffspringbyNuclearTransfer，THERIOGENOLOGY1990；33165-174。6.Brennan，M.B.，DrugDiscovery.FilteringOutFailuresEarlyInThePipeline，CHEMICAL&ENGINEERINGNEWS，(2000)563-73。7.Bronstein，I.，等，ChemiluminescentAndBioluminescentReporterGeneAssays，ANALYTICALBIOCHEMISTRY，(1994)219，169-81。8.Campbell，KHS，McwhireJ，RitchieWAAndI.Wilmut.SheepClonedbyNuclearTransferFromaCulturedCellLine，NATURE1996；38064-66。9.CibelliJB，等，ClonedTransgenicCalvesProducedFromNonquiescentFetalFibroblasts.SCIENCE1998；2801256-1258。10.Civelli，O.，Nothacker，H.-P.，&Reinscheid，R.，ReversePhysiologyDiscoveryOfTheNoyelNeuropeptide，OyphaninFQ/Nociceptin.CRITICALREVIEWSINNEUROBIOLOGY，(1998)12，163-76。11.CollasP.，ElectricallyInducedCalciumElevation，Activation，andParthenogenicDevelopmentofBovineOocytes.MOLREPROD1993；34212-223。12.CorryD.，等，InductionandRegulationoftheIgEResponse，NATURE(1999)，Supplementto402(6760)，PagesB18-B23。13.deLecea，L.等，TheHypocretinsHypothalamus-SpecificPeptidesWithNeuroexcitatoryActivity，PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.95(1)，322-327(1998)。14.Dionne，C.A.，等.，CloningAndExpressionOfTwoDistinctHigh-AffinityReceptorsCross-ReactingWithAcidicAndBasicFibroblastGrowthFactors，EMBOJ.9(9)，2685-2692(1990)。15.Drews，J.，DrugDiscoveryAHistoricalPerspective，SCIENCE(2000)，287，1960-64。16.Gavin，W.G.，GeneTransferIntoGoatEmbryos，TRANSGENICANIMALS-GENERATIONANDUSE，L.M.Houdebineed.，(HarwoodAcademicPublishersGmbh.，1996)。17.GrunigG，等RequirementforIL-13independentlyofIL-4inexperimentalasthmaSCIENCE19982822261-2263。18.Hill，J.，等，MolecularCloningAndFunctionalCharacterizationOfMCH2，ANovelHumanMCHReceptor，J.BIOL.CHEM.276(23)，20125-29(2001)。19.Hinuma，S.，Onda，H.，&Fujino，M.，TheQuestForNovelBioactivepeptidesUtilizingOrphanSeven-Transmembrane-DomainReceptors，JOURNALOFMOLECULARMEDICINE(1999)，77495-504。20.Holgate，S.，TheEpidemicofAllergyandAsthma，NATURE(1999)，SupplementtoVolume402(6760)PagesB2-B4。21.HoltP.等，TheRoleofAllergyintheDevelopmentofAsthma，NATURE(1999)，SupplementtoVolume402(6760)，PagesB12-B17。22.Isacchi，A.，等，CompleteSequenceOfAHumanReceptorForAcidicAndBasicFibroblastGrowthFactors，NUCLEICACIDSRES.18(7)，1906(1990)。23.KasinathanP，等，EffectofFibroblastDonorCellAgeandCellCycleonDevelopmentofBovineNuclearTransferEmbryosInVitro，BIOLREPROD2001；64(5)1487-1493。24.KatoY.等，CloningofCalvesfromVariousSomaticCellTypesofMaleandFemaleAdult，NewbornandFetalCows，JREPRODFERT2000；120231-237。25.Makishima，M.，Okamoto，A.Y.，Repa，J.J.，Tu，H.，Learned，R.M.，Luk，A.，Hull，M.V.，Lustig，K.D.，Mangelsdorf，D.J.，&Shan，B.，IdentificationOfANuclear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6<211>802<212>PRT<213>人<220><221>misc_特征<223>成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-4<300><308>Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P22455<309>2001-03-22<313>(1)..(802)<400>6MetArgLeuLeuLeuAlaLeuLeuGlyValLeuLeuSerValProGly151015ProProValLeuSerLeuGluAlaSerGluGluValGluLeuGluPro202530CysLeuAlaProSerLeuGluGlnGlnGluGlnGluLeuThrValAla354045LeuGlyGlnProValArgLeuCysCysGlyArgAlaGluArgGlyGly505560HisTrpTyrLysGluGlySerArgLeuAlaProAlaGlyArgValArg65707580GlyTrpArgGlyArgLeuGluIleAlaSerPheLeuProGluAspAla859095GlyArgTyrLeuCysLeuAlaArgGlySerMetIleValLeuGlnAsn100105110LeuThrLeuIleThrGlyAspSerLeuThrSerSerAsnAspAspGlu115120125AspProLysSerHisArgAspProSerAsnArgHisSerTyrProGln130135140GlnAlaProTyrTrpThrHisProGlnArgMetGluLysLysLeuHis145150155160AlaValProAlaGlyAsnThrValLysPheArgCysProAlaAlaGly165170175AsnProThrProThrIleArgTrpLeuLysAspGlyGlnAlaPheHis180185190GlyGluAsnArgIleGlyGlyIleArgLeuArgHisGlnHisTrpSer195200205LeuValMetGluSerValValProSerAspArgGlyThrTyrThrCys210215220LeuValGluAsnAlaValGlySerIleArgTyrAsnTyrLeuLeuAsp225230235240ValLeuGluArgSerProHisArgProIleLeuGlnAlaGlyLeuPro245250255AlaAsnThrThrAlaValValGlySerAspValGluLeuLeuCysLys260265270ValTyrSerAspAlaGlnProHisIleGlnTrpLeuLysHisIleVal275280285IleAsnGlySerSerPheGlyAlaAspGlyPheProTyrValGlnVal290295300LeuLysThrAlaAspIleAsnSerSerGluValGluValLeuTyrLeu305310315320ArgAsnValSerAlaGluAspAlaGlyGluTyrThrCysLeuAlaGly325330335AsnSerIleGlyLeuSerTyrGlnSerAlaTrpLeuThrValLeuPro340345350GluGluAspProThrTrpThrAlaAlaAlaProGluAlaArgTyrThr355360365AspIleIleLeuTyrAlaSerGlySerLeuAlaLeuAlaValLeuLeu370375380LeuLeuAlaGlyLeuTyrArgGlyGlnAlaLeuHisGlyArgHisPro385390395400ArgProProAlaThrValGlnLysLeuSerArgPheProLeuAlaArg405410415GlnPheSerLeuGluSerGlySerSerGlyLysSerSerSerSerLeu420425430ValArgGlyValArgLeuSerSerSerGlyProAlaLeuLeuAlaGly435440445LeuValSerLeuAspLeuProLeuAspProLeuTrpGluPheProArg450455460AspArgLeuValLeuGlyLysProLeuGlyGluGlyCysPheGlyGln465470475480ValValArgAlaGluAlaPheGlyMetAspProAlaArgProAspGln485490495AlaSerThrValAlaValLysMetLeuLysAspAsnAlaSerAspLys500505510AspLeuAlaAspLeuValSerGluMetGluValMetLysLeuIleGly515520525ArgHisLysAsnIleIleAsnLeuLeuGlyValCysThrGlnGluGly530535540ProLeuTyrValIleValGluCysAlaAlaLysGlyAsnLeuArgGlu545550555560PheLeuArgAlaArgArgProProGlyProAspLeuSerProAspGly565570575ProArgSerSerGluGlyProLeuSerPheProValLeuValSerCys580585590AlaTyrGlnValAlaArgGlyMetGlnTyrLeuGluSerArgLysCys595600605IleHisArgAspLeuAlaAlaArgAsnValLeuValThrGluAspAsn610615620ValMetLysIleAlaAspPheGlyLeuAlaArgGlyValHisHisIle625630635640AspTyrTyrLysLysThrSerAsnGlyArgLeuProValLysTrpMet645650655AlaProGluAlaLeuPheAspArgValTyrThrHisGlnSerAspVal660665670TrpSerPheGlyIleLeuLeuTrpGluIlePheThrLeuGlyGlySer675680685ProTyrProGlyIleProValGluGluLeuPheSerLeuLeuArgGlu690695700GlyHisArgMetAspArgProProHisCysProProGluLeuTyrGly705710715720LeuMetArgGluCysTrpHisAlaAlaProSerGlnArgProThrPhe725730735LysGlnLeuValGluAlaLeuAspLysValLeuLeuAlaValSerGlu740745750GluTyrLeuAspLeuArgLeuThrPheGlyProTyrSerProSerGly755760765GlyAspAlaSerSerThrCysSerSerSerAspSerValPheSerHis770775780AspProLeuProLeuGlySerSerSerPheProPheGlySerGlyVal785790795800GlnThr<210>7<211>806<212>PRT<213>人<220><22l>misc_特征<223>成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3<300><308>Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P22607<309>1991-08-01<313>(1)..(806)<400>7MetGlyAlaProAlaCysAlaLeuAlaLeuCysValAlaValAlaIle151015ValAlaGlyAlaSerSerGluSerLeuGlyThrGluGlnArgValVal202530GlyArgAlaAlaGluValProGlyProGluProGlyGlnGlnGluGln354045LeuValPheGlySerGlyAspAlaValGluLeuSerCysProProPro505560GlyGlyGlyProMetGlyProThrValTrpValLysAspGlyThrGly65707580LeuValProSerGluArgValLeuValGlyProGlnArgLeuGlnVal859095LeuAsnAlaSerHisGluAspSerGlyAlaTyrSerCysArgGlnArg100105110LeuThrGlnArgValLeuCysHisPheSerValArgValThrAspAla115120125ProSerSerGlyAspAspGluAspGlyGluAspGluAlaGluAspThr130135140GlyValAspThrGlyAlaProTyrTrpThrArgProGluArgMetAsp145150155160LysLysLeuLeuAlaValProAlaAlaAsnThrValArgPheArgCys165170175ProAlaAlaGlyAsnProThrProSerIleSerTrpLeuLysAsnGly180185190ArgGluPheArgGlyGluHisArgIleGlyGlyIleLysLeuArgHis195200205GlnGlnTrpSerLeuValMetGluSerValValProSerAspArgGly210215220AsnTyrThrCysValValGluAsnLysPheGlySerIleArgGlnThr225230235240TyrThrLeuAspValLeuGluArgSerProHisArgProIleLeuGln245250255AlaGlyLeuProAlaAsnGlnThrAlaValLeuGlySerAspValGlu260265270PheHisCysLysValTyrSerAspAlaGlnProHisIleGlnTrpLeu275280285LysHisValGluValAsnGlySerLysValGlyProAspGlyThrPro290295300TyrValThrValLeuLysThrAlaGlyAlaAsnThrThrAspLysGlu305310315320LeuGluValLeuSerLeuHisAsnValThrPheGluAspAlaGlyGlu325330335TyrThrCysLeuAlaGlyAsnSerIleGlyPheSerHisHisSerAla340345350TrpLeuValValLeuProAlaGluGluGluLeuValGluAlaAspGlu355360365AlaGlySerValTyrAlaGlyIleLeuSerTyrGlyValGlyPhePhe370375380LeuPheIleLeuValValAlaAlaValThrLeuCysArgLeuArgSer385390395400ProProLysLysGlyLeuGlySerProThrValHisLysIleSerArg405410415PheProLeuLysArgGlnValSerLeuGluSerAsnAlaSerMetSer420425430SerAsnThrProLeuValArgIleAlaArgLeuSerSerGlyGluGly435440445ProThrLeuAlaAsnValSerGluLeuGluLeuProAlaAspProLys450455460TrpGluLeuSerArgAlaArgLeuThrLeuGlyLysProLeuGlyGlu465470475480GlyCysPheGlyGlnValValMetAlaGluAlaIleGlyIleAspLys485490495AspArgAlaAlaLysProValThrValAlaValLysMetLeuLysAsp500505510AspAlaThrAspLysAspLeuSerAspLeuValSerGluMetGluMet515520525MetLysMetIleGlyLysHisLysAsnIleIleAsnLeuLeuGlyAla530535540CysThrGlnGlyGlyProLeuTyrValLeuValGluTyrAlaAlaLys545550555560GlyAsnLeuArgGluPheLeuArgAlaArgArgProProGlyLeuAsp565570575TyrSerPheAspThrCysLysProProGluGluGlnLeuThrPheLys580585590AspLeuValSerCysAlaTyrGlnValAlaArgGlyMetGluTyrLeu595600605AlaSerGlnLysCysIleHisArgAspLeuAlaAlaArgAsnValLeu610615620ValThrGluAspAsnValMetLysIleAlaAspPheGlyLeuAlaArg625630635640AspValHisAsnLeuAspTyrTyrLysLysThrThrAsnGlyArgLeu645650655ProValLysTrpMetAlaProGluAlaLeuPheAspArgValTyrThr660665670HisGlnSerAspValTrpSerPheGlyValLeuLeuTrpGluIlePhe675680685ThrLeuGlyGlySerProTyrProGlyIleProValGluGluLeuPhe690695700LysLeuLeuLysGluGlyHisArgMetAspLysProAlaAsnCysThr705710715720HisAspLeuTyrMetIleMetArgGluCysTrpHisAlaAlaProSer725730735GlnArgProThrPheLysGlnLeuValGluAspLeuAspArgValLeu740745750ThrValThrSerThrAspGluTyrLeuAspLeuSerAlaProPheGlu755760765GlnTyrSerProGlyGlyGlnAspThrProSerSerSerSerSerGly770775780AspAspSerValPheAlaHisAspLeuLeuProProAlaProProSer785790795800SerGlyGlySerArgThr805<210>8<211>821<212>PRT<213>人<220><221>misc_特征<223>成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2<300><308>Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P21802<309>2003-11-11<313>(1)..(821)<400>8MetValSerTrpGlyArgPheIleCysLeuValValValThrMetAla151015ThrLeuSerLeuAlaArgProSerPheSerLeuValGluAspThrThr202530LeuGluProGluGluProProThrLysTyrGlnIleSerGlnProGlu354045ValTyrValAlaAlaProGlyGluSerLeuGluValArgCysLeuLeu505560LysAspAlaAlaValIleSerTrpThrLysAspGlyValHisLeuGly65707580ProAsnAsnArgThrValLeuIleGlyGluTyrLeuGlnIleLysGly859095AlaThrProArgAspSerGlyLeuTyrAlaCysThrAlaSerArgThr100105110ValAspSerGluThrTrpTyrPheMetValAsnValThrAspAlaIle115120125SerSerGlyAspAspGluAspAspThrAspGlyAlaGluAspPheVal130135140SerGluAsnSerAsnAsnLysArgAlaProTyrTrpThrAsnThrGlu145150155160LysMetGluLysArgLeuHisAlaValProAlaAlaAsnThrValLys165170175PheArgCysProAlaGlyGlyAsnProMetProThrMetArgTrpLeu180185190LysAsnGlyLysGluPheLysGlnGluHisArgIleGlyGlyTyrLys195200205ValArgAsnGlnHisTrpSerLeuIleMetGluSerValValProSer210215220AspLysGlyAsnTyrThrCysValValGluAsnGluTyrGlySerIle225230235240AsnHisThrTyrHisLeuAspValValGluArgSerProHisArgPro245250255IleLeuGlnAlaGlyLeuProAlaAsnAlaSerThrValValGlyGly260265270AspValGluPheValCysLysValTyrSerAspAlaGlnProHisIle275280285GlnTrpIleLysHisValGluLysAsnGlySerLysTyrGlyProAsp290295300GlyLeuProTyrLeuLysValLeuLysAlaAlaGlyValAsnThrThr305310315320AspLysGluIleGluValLeuTyrIleArgAsnValThrPheGluAsp325330335AlaGlyGluTyrThrCysLeuAlaGlyAsnSerIleGlyIleSerPhe340345350HisSerAlaTrpLeuThrValLeuProAlaProGlyArgGluLysGlu355360365IleThrAlaSerProAspTyrLeuGluIleAlaIleTyrCysIleGly370375380ValPheLeuIleAlaCysMetValValThrValIleLeuCysArgMet385390395400LysAsnThrThrLysLysProAspPheSerSerGlnProAlaValHis405410415LysLeuThrLysArgIleProLeuArgArgGlnValThrValSerAla420425430GluSerSerSerSerMetAsnSerAsnThrProLeuValArgIleThr435440445ThrArgLeuSerSerThrAlaAspThrProMetLeuAlaGlyValSer450455460GluTyrGluLeuProGluAspProLysTrpGluPheProArgAspLys465470475480LeuThrLeuGlyLysProLeuGlyGluGlyCysPheGlyGlnValVal485490495MetAlaGluAlaValGlyIleAspLysAspLysProLysGluAlaVal500505510ThrValAlaValLysMetLeuLysAspAspAlaThrGluLysAspLeu515520525SerAspLeuValSerGluMetGluMetMetLysMetIleGlyLysHis530535540LysAsnIleIleAsnLeuLeuGlyAlaCysThrGlnAspGlyProLeu545550555560TyrValIleValGluTyrAlaSerLysGlyAsnLeuArgGluTyrLeu565570575ArgAlaArgArgProProGlyMetGluTyrSerTyrAspIleAsnArg580585590ValProGluGluGlnMetThrPheLysAspLeuValSerCysThrTyr595600605GlnLeuAlaArgGlyMetGluTyrLeuAlaSerGlnLysCysIleHis610615620ArgAspLeuAlaAlaArgAsnValLeuValThrGluAsnAsnValMet625630635640LysIleAlaAspPheGlyLeuAlaArgAspIleAsnAsnIleAspTyr645650655TyrLysLysThrThrAsnGlyArgLeuProValLysTrpMetAlaPro660665670GluAlaLeuPheAspArgValTyrThrHisGlnSerAspValTrpSer675680685PheGlyValLeuMetTrpGluIlePheThrLeuGlyGlySerProTyr690695700ProGlyIleProValGluGluLeuPheLysLeuLeuLysGluGlyHis705710715720ArgMetAspLysProAlaAsnCysThrAsnGluLeuTyrMetMetMet725730735ArgAspCysTrpHisAlaValProSerGlnArgProThrPheLysGln740745750LeuValGluAspLeuAspArgIleLeuThrLeuThrThrAsnGluGlu755760765TyrLeuAspLeuSerGlnProLeuGluGlnTyrSerProSerTyrPro770775780AspThrArgSerSerCysSerSerGlyAspAspSerValPheSerPro785790795800AspProMetProTyrGluProCysLeuProGlnTyrProHisIleAsn805810815GlySerValLysThr820<210>9<211>759<212>PRT<213>人<220><221>misc_特征<223>成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-l<300><308>Genbank/EMBL/DDBJ登記號(hào)P11362<309>1991-05-01<313>(1)..(759)<400>9MetSerTrpLysCysLeuLeuPheTrpAlaValLeuValThrAlaThr151015LeuCysThrAlaArgProSerProThrLeuProGluGlnAlaGlnPro202530TrpGlyAlaProValGluValGluSerPheLeuValHisProGlyAsp354045LeuLeuGlnLeuArgCysArgLeuArgAspAspValGlnSerIleAsn505560TrpLeuArgAspGlyValGlnLeuAlaGluSerAsnArgThrArgIle65707580ThrGlyGluGluValGluValGlnAspSerValProAlaAspSerGly859095LeuTyrAlaCysValThrSerSerProSerGlySerAspThrThrTyr100105110PheSerValAsnValSerAspAlaLeuProSerSerGluAspAspAsp115120125AspAspAspAspSerSerSerGluGluLysGluThrAspAsnThrLys130135140ProAsnArgMetProValAlaProTyrTrpThrSerProGluLysMet145150155160GluLysLysLeuHisAlaValProAlaAlaLysThrValLysPheLys165170175CysProSerSerGlyThrProAsnProThrLeuArgTrpLeuLysAsn180185190GlyLysGluPheLysProAspHisArgIleGlyGlyTyrLysValArg195200205TyrAlaThrTrpSerIleIleMetAspSerValValProSerAspLys210215220GlyAsnTyrThrCysIleValGluAsnGluTyrGlySerIleAsnHis225230235240ThrTyrGlnLeuAspValValGluArgSerProHisArgProIleLeu245250255GlnAlaGlyLeuProAlaAsnLysThrValAlaLeuGlySerAsnVal260265270GluPheMetCysLysValTyrSerAspProGlnProHisIleGlnTrp275280285LeuLysHisIleGluValAsnGlySerLysIleGlyProAspAsnLeu290295300ProTyrValGlnIleLeuLysThrAlaGlyValAsnThrThrAspLys305310315320GluMetGluValLeuHisLeuArgAsnValSerPheGluAspAlaGly325330335GluTyrThrCysLeuAlaGlyAsnSerIleGlyLeuSerHisHisSer340345350AlaTrpLeuThrValLeuGluAlaLeuGluGluArgProAlaValMet355360365ThrSerProLeuTyrLeuGluIleIleIleTyrCysThrGlyAlaPhe370375380LeuIleSerCysMetValGlySerValIleValTyrLysMetLysSer385390395400GlyThrLysLysSerAspPheHisSerGlnMetAlaValHisLysLeu405410415AlaLysSerIleProLeuArgArgGlnValThrValSerAlaAspSer420425430SerAlaSerMetAsnSerGlyValLeuLeuValArgProSerArgLeu435440445SerSerSerGlyThrProMetLeuAlaGlyValSerGluTyrGluLeu450455460ProGluAspProArgTrpGluLeuProArgAspArgLeuValLeuGly465470475480LysProLeuGlyGluGlyCysPheGlyGlnValValLeuAlaGluAla485490495IleGlyLeuAspLysAspLysProAsnArgValThrLysValAlaVal500505510LysMetLeuLysSerAspAlaThrGluLysAspLeuSerAspLeuIle515520525SerGluMetGluMetMetLysMetIleGlyLysHisLysAsnIleIle530535540AsnLeuLeuGlyAlaCysThrGlnAspGlyProLeuTyrValIleVal545550555560GluTyrAlaSerLysGlyAsnLeuArgGluTyrLeuGlnAlaArgArg565570575ProProGlyLeuGluTyrCysTyrAsnProSerHisAsnProGluGlu580585590GlnLeuSerSerLysAspLeuValSerCysAlaTyrGlnValAlaArg595600605GlyMetGluTyrLeuAlaSerLysLysCysIleHisArgAspLeuAla610615620AlaArgAsnValLeuValThrGluAspAsnValMetLysIleAlaAsp625630635640PheGlyLeuAlaArgAspIleHisHisIleAspTyrTyrLysLysThr645650655ThrAsnGlyArgLeuProValLysTrpMetAlaProGluAlaLeuPhe660665670AspArgIleTyrThrHisGlnSerAspValTrpSerPheGlyValLeu675680685LeuTrpGluIlePheThrLeuGlyGlySerProTyrProGlyValPro690695700ValGluGluLeuPheLysLeuLeuLysGluGlyHisArgMetAspLys705710715720ProSerAsnCysThrAsnGluLeuTyrMetMetMetArgAspCysTrp725730735HisAlaValProSerGlnArgProThrPheLysGlnLeuValGluAsp740745750LeuAspArgIleValAlaLeu75權(quán)利要求1.通過(guò)核移植方法克隆非-人哺乳動(dòng)物的方法，包括(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得至少一個(gè)卵細(xì)胞；(iii)將所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；(v)同時(shí)融合和活化細(xì)胞偶聯(lián)體以形成轉(zhuǎn)基因胚胎；(vii)培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)基因胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；和(viii)(viii)將所述轉(zhuǎn)基因胚胎移植入宿主哺乳動(dòng)物中使得胚胎發(fā)育成胎兒；其中所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核包含重組轉(zhuǎn)基因；并且，其中所述的重組轉(zhuǎn)基因編碼目的重組跨膜受體蛋白。2.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自中胚層。3.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自?xún)?nèi)胚層。4.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自外胚層。5.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自胎兒體細(xì)胞組織。6.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自胎兒體細(xì)胞。7.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自成纖維細(xì)胞。8.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自有蹄類(lèi)。9.權(quán)利要求1或8的方法，其中所述供體細(xì)胞或者供體細(xì)胞核來(lái)自選自牛、羊、豬、馬、山羊和水牛的有蹄類(lèi)。10.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自成體非人哺乳動(dòng)物體細(xì)胞。11.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞。12.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自選自皮膚、肺、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎和尿道的器官。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在去核前是體內(nèi)成熟的。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在去核前是體外成熟的。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述的非人哺乳動(dòng)物為嚙齒類(lèi)。16.權(quán)利要求1的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非-休眠體細(xì)胞或分離自所述非-休眠體細(xì)胞的核。17.權(quán)利要求1或8的方法，其中胎兒發(fā)育為子代。18.權(quán)利要求1的方法，其中將所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在體外成熟起始后約10至60小時(shí)去核。19.權(quán)利要求1的方法，其中在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核插入所述去核的卵細(xì)胞之前，在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去或修飾所需的基因。20.權(quán)利要求1或19的方法生成的子代。21.權(quán)利要求19的生成的子代，進(jìn)一步包括其中所述核移植方法產(chǎn)生的子代為嵌合的。22.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞分裂抑素-B用于該克隆方案。23.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞分裂抑素-B不用于該克隆方案。24.用于產(chǎn)生培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的方法，包括(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得至少一個(gè)卵細(xì)胞；(iii)將所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入該去核的卵細(xì)胞；(v)同時(shí)融合和活化細(xì)胞偶聯(lián)體以形成最初的轉(zhuǎn)基因胚胎；(vi)活化細(xì)胞偶聯(lián)體，其不融合以產(chǎn)生最初的轉(zhuǎn)基因胚胎，而是在首次電擊后通過(guò)提供包括另一電擊的至少一個(gè)另外的活化方案被活化，以形成第二個(gè)轉(zhuǎn)基因胚胎；和(vi)培養(yǎng)獲自所述培養(yǎng)的活化胚胎的細(xì)胞以獲得培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞；其中所述的轉(zhuǎn)基因胚胎編碼目的重組跨膜受體蛋白。25.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自中胚層。26.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自?xún)?nèi)胚層。27.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自外胚層。28.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自胎兒體細(xì)胞組織。29.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自胎兒體細(xì)胞。30.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自成纖維細(xì)胞。31.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自有蹄類(lèi)。32.權(quán)利要求24或31的方法，其中所述供體細(xì)胞或者供體細(xì)胞核來(lái)自選自牛、羊、豬、馬、山羊和水牛的有蹄類(lèi)。33.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自成體哺乳動(dòng)物體細(xì)胞。34.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞。35.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核來(lái)源的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)自選自皮膚、肺、胰腺、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎和尿道的器官。36.權(quán)利要求24的方法，其中所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在去核前是體內(nèi)成熟的。37.權(quán)利要求24的方法，其中所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在去核前是體外成熟的。38.權(quán)利要求24的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞源自嚙齒類(lèi)。39.權(quán)利要求24的方法，其中用作供體核或供體細(xì)胞核的所述供體的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為非-休眠體細(xì)胞或分離自所述非-休眠體細(xì)胞的核。40.權(quán)利要求24或31的方法，其中任何所述培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞胎兒發(fā)育成非人子代。41.權(quán)利要求24的方法，其中將所述的至少一個(gè)卵細(xì)胞在體外成熟起始后約10至60小時(shí)去核。42.權(quán)利要求24的方法，其中在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核插入所述去核的卵細(xì)胞之前，在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去或修飾所需的基因。43.權(quán)利要求24或42的方法生成的子代。44.權(quán)利要求42的生成的子代，進(jìn)一步包括其中所述核移植方法產(chǎn)生的任何非人子代為嵌合的。45.權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞分裂抑素-B用于該方案。46.權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞分裂抑素-B不用于該方案。47.權(quán)利要求24的方法，其中細(xì)胞分裂抑素-B用于該方案。48.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)為連續(xù)的DNA編碼序列的產(chǎn)物。49.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)在宿主轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁中以至少每升1克的水平表達(dá)。50.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)在乳腺上皮細(xì)胞中泌乳誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)。51.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)保留其生物學(xué)活性。52.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)改造成作為天然跨膜蛋白質(zhì)的顯性失活類(lèi)型起作用。53.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)缺乏任何生物學(xué)功能。54.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)選自以下物質(zhì)，包括IL-13受體、阿立新受體、黑色素濃集激素受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、CFTR受體、CD4受體和鈣粘蛋白。55.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述重組跨膜受體蛋白為選自以下物質(zhì)，包括IL-13受體、阿立新受體、黑色素濃集激素受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、CFTR受體、CD4受體和鈣粘蛋白的生物蛋白質(zhì)的顯性失活類(lèi)型。56.權(quán)利要求1的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)選自以下物質(zhì)，包括通道蛋白、抗藥性調(diào)節(jié)劑蛋白和離子孔蛋白。57權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)為連續(xù)的DNA編碼序列的產(chǎn)物。58.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)在宿主轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁中以至少每升1克的水平表達(dá)。59.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)在乳腺上皮細(xì)胞中泌乳誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)。60.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)保留其生物學(xué)活性。61.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)被改造成作為天然跨膜蛋白質(zhì)的顯性失活類(lèi)型起作用。62.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)缺乏任何生物學(xué)功能。63.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)選自以下物質(zhì)，包括IL-13受體、阿立新受體、黑色素濃集激素受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、CFTR受體、CD4受體和鈣粘蛋白。64.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述重組跨膜受體蛋白為選自以下物質(zhì)，包括IL-13受體、阿立新受體、黑色素濃集激素受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、CFTR受體、CD4受體和鈣粘蛋白的生物蛋白質(zhì)的顯性失活類(lèi)型。65.權(quán)利要求24的重組跨膜受體蛋白，其中所述跨膜蛋白質(zhì)選自以下物質(zhì)，包括通道蛋白、抗藥性調(diào)節(jié)劑蛋白和離子孔蛋白。66.通過(guò)核移植方法克隆非人哺乳動(dòng)物的方法，包括(i)獲得所需的已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作供體細(xì)胞核的來(lái)源；(ii)從與供體細(xì)胞核來(lái)源的細(xì)胞相同種類(lèi)的哺乳動(dòng)物獲得至少一個(gè)卵細(xì)胞；(iii)將所述的卵細(xì)胞去核；(iv)將所需的已分化的細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核卵細(xì)胞內(nèi)；施加至少兩次電擊給細(xì)胞偶聯(lián)體以引發(fā)所述細(xì)胞偶聯(lián)體的融合和活化而成為活化的和融合的胚胎；(vii)培養(yǎng)所述活化的和融合的胚胎直至大于2-細(xì)胞發(fā)育階段；(viii)將所述融合的胚胎移植入宿主哺乳動(dòng)物中使得胚胎發(fā)育成胎兒；其中所述的至少兩次電擊的第二次在最初電擊的至少15分鐘后給予；其中在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核插入所述去核的卵細(xì)胞之前，在所述已分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去或修飾所需的基因；和其中所述所需的基因編碼能在乳腺上皮細(xì)胞中泌乳誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)的目的重組跨膜受體蛋白。67.治療疾病的方法，包括將有效量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的跨膜受體蛋白或其顯性失活類(lèi)型給藥使得所述化合物與已經(jīng)或?qū)⒁┞队诩膊∏樾蔚募?xì)胞或細(xì)胞組接觸，其中所述化合物用于干擾該疾病的繼續(xù)發(fā)展。68.權(quán)利要求67的方法，其中所述疾病為哮喘。69.權(quán)利要求67的方法，其中所述疾病為過(guò)敏癥。70.權(quán)利要求67的方法，其中所述疾病為牛皮癬。71.權(quán)利要求67的方法，其中所述疾病為FGRF過(guò)量產(chǎn)生引起的癌癥。72.權(quán)利要求67的方法，其中所述疾病為炎癥。73.治療肥胖的方法，包括將有效量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的跨膜受體蛋白或其顯性失活類(lèi)型給藥。74.權(quán)利要求67的方法，其中所述跨膜受體蛋白選自阿立新受體、黑色素濃集激素受體和ghrelin受體。75.權(quán)利要求67的方法，其中所述化合物的給藥通過(guò)藥物制劑如片劑的口服完成。全文摘要本發(fā)明提供數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中跨膜受體蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的產(chǎn)生，提供用作治療分子的這些蛋白和其顯性失活類(lèi)型的產(chǎn)生方法。文檔編號(hào)C07K14/715GK1852977SQ200480026566公開(kāi)日2006年10月25日申請(qǐng)日期2004年9月15日優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日發(fā)明者陳理浩申請(qǐng)人:Gtc生物治療學(xué)公司