一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置的制造方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置。本實(shí)用新型提供的細(xì)胞分層共培養(yǎng)裝置包括培養(yǎng)瓶(1)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(1)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(1)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。本實(shí)用新型提供的培養(yǎng)瓶不僅能夠?qū)崿F(xiàn)浮力不同的細(xì)胞的共培養(yǎng)，模擬動物細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，而且還能夠節(jié)省原料、有利于氣體的內(nèi)外交換、避免漏液，有效防止細(xì)胞污染等。
【專利說明】
一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本實(shí)用新型涉及一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]動物體內(nèi)的脂肪組織是決定動物產(chǎn)品生產(chǎn)性能及其肉的品質(zhì)的主要因素。按照脂肪在動物體內(nèi)分布位置的不同，脂肪組織可以分為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和肌內(nèi)脂肪，不同部位脂肪沉積主要來自于前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化。隨著對動物發(fā)育規(guī)律的不斷研究和認(rèn)識，人們發(fā)現(xiàn)動物體內(nèi)的前體脂肪細(xì)胞可以分化為成熟脂肪細(xì)胞，而成熟脂肪細(xì)胞還可以去分化為前體脂肪細(xì)胞，甚至可以向肌肉細(xì)胞，成骨細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0003]將同一動物的脂肪細(xì)胞和其它細(xì)胞在同一培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，可以更好的模擬動物體內(nèi)環(huán)境，便于更好地觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機(jī)制和可能作用的靶點(diǎn)，填補(bǔ)了單層細(xì)胞培養(yǎng)的整體動物實(shí)驗(yàn)的鴻溝。針對于此，現(xiàn)有技術(shù)中已公開利用兩種細(xì)胞浮力的差異在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行共培養(yǎng)的方法，稱為“天花板”法。但該培養(yǎng)方法存在明顯的缺點(diǎn)，一是耗費(fèi)較大，需要將整個(gè)培養(yǎng)瓶都充滿細(xì)胞培養(yǎng)液，容易造成浪費(fèi);二是培養(yǎng)過程瓶口蓋子必須擰緊，否則液體會漏出，不利于細(xì)胞培養(yǎng)過程中氣體內(nèi)外交換;三是操作過程中容易出現(xiàn)漏液，加大了細(xì)胞污染的危險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本實(shí)用新型的目的在于提供一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，實(shí)用新型提供的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，成本低、氣體交換好、細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)小，還能夠?qū)崿F(xiàn)動物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的模擬，使實(shí)驗(yàn)環(huán)境更接近于體內(nèi)狀態(tài)，從而提高細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機(jī)制和可能作用的靶點(diǎn)結(jié)果的精準(zhǔn)性與可信度。
[0005]本實(shí)用新型提供了一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，包括培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底⑷。
[0006]優(yōu)選的是，所述隔板與培養(yǎng)瓶除瓶口方向的三側(cè)側(cè)壁相接。
[0007]優(yōu)選的是，所述隔板將培養(yǎng)瓶內(nèi)空間隔為上部的氣體交換空間和下部的細(xì)胞培養(yǎng)空間，所述細(xì)胞培養(yǎng)空間的體積與所述氣體交換空間的體積之比為4:1?1:1，更優(yōu)選為2:1o
[0008]優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)瓶側(cè)壁設(shè)置有瓶口，所述瓶口與相接隔板的側(cè)壁相對設(shè)置，與瓶口臨近的隔板側(cè)邊緣低于所述瓶口的底邊緣(3)且，垂直距離為O?lcm。
[0009]優(yōu)選的是，所述隔板的水平長度為培養(yǎng)瓶水平長度的2/3?5/6，更優(yōu)選為3/4，所述隔板的厚度為0.3?Icm，更優(yōu)選為0.5cm。
[0010]本實(shí)用新型提供了一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，包括培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶
(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底
(4)。本實(shí)用新型在傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶的中間部位加入一層隔板，用隔板代替了“天花板”，有效的減少了利用“天花板”法共培養(yǎng)不同浮力細(xì)胞時(shí)所用培養(yǎng)液量，既達(dá)到了兩種細(xì)胞在同一體系中共培養(yǎng)的效果又避免了不必要的浪費(fèi)。同時(shí)，由于培養(yǎng)過程中瓶內(nèi)培養(yǎng)液不會充盈瓶口，使得瓶內(nèi)外氣體交換良好，操作過程中也不會出現(xiàn)漏液等現(xiàn)象，有效的防止了細(xì)胞污染。
【附圖說明】
[0011]圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的細(xì)胞分層共培養(yǎng)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0012]圖2為圖1所示裝置的俯視圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]本實(shí)用新型提供了一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，包括培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶
(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底⑷。
[0014]本實(shí)用新型的細(xì)胞分層共培養(yǎng)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖具體參見圖1和圖2，其中，圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的細(xì)胞分層共培養(yǎng)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖:(I)表示培養(yǎng)瓶，(2)為隔板，
(3)為瓶口的底邊緣，(4)為培養(yǎng)瓶瓶底，(5)為培養(yǎng)瓶瓶蓋。
[0015]本實(shí)用新型的培養(yǎng)瓶與隔板一體化制成，所用材料沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備動物細(xì)胞培養(yǎng)瓶的材料即可。
[0016]本實(shí)用新型對培養(yǎng)瓶的體積沒有特殊的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需求進(jìn)行設(shè)置。本實(shí)用新型所述的細(xì)胞培養(yǎng)瓶的體積是指培養(yǎng)瓶的總體積，包括上部的氣體交換空間和下部的細(xì)胞培養(yǎng)空間。
[0017]在本實(shí)用新型中，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)，所述隔板與培養(yǎng)瓶除瓶口方向的三側(cè)側(cè)壁相接;所述隔板將培養(yǎng)瓶內(nèi)空間隔為上部的氣體交換空間和下部的細(xì)胞培養(yǎng)空間，減少了培養(yǎng)液的使用，且提升了瓶內(nèi)外氣體交換的效率，還解決了培養(yǎng)過程中漏液以及細(xì)胞污染的問題。在本實(shí)用新型中，所述細(xì)胞培養(yǎng)空間的體積與所述氣體交換空間的體積之比為4:1?1:1，更優(yōu)選為2:1。
[0018]在本實(shí)用新型的實(shí)施例中，所述隔板的水平長度為培養(yǎng)瓶水平長度的2/3?5/6，更優(yōu)選為3/4，所述隔板的厚度為0.3?I cm，更優(yōu)選為0.5cm。
[0019]培養(yǎng)瓶側(cè)壁設(shè)置有瓶口，所述瓶口與相接隔板的側(cè)壁相對設(shè)置，與瓶口臨近的隔板側(cè)邊緣低于所述瓶口的底邊緣(3)且，垂直距離為O?lcm;上述設(shè)置使得細(xì)胞培養(yǎng)液的液面始終低于瓶口的底邊緣，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不會出現(xiàn)漏液的問題，避免了細(xì)胞污染。
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例，對本實(shí)用新型提供的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是不能將它們理解為對本申請保護(hù)范圍的限定。
[0021]實(shí)施例1
[0022]如圖1、2所示，設(shè)置培養(yǎng)裝置，包含培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。
[0023]在細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)過程中
[0024]1、取動物肌肉樣組織，除去可見的結(jié)締組織和血管，PBS緩沖液沖洗。
[0025]2、超凈臺內(nèi)將組織剪成小塊，加入濃度為0.25 %的胰蛋白酶消化液消化2min，并用含1 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)等體積終止消化。
[0026]3、隨后選取體積為25cm3的培養(yǎng)瓶，預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基，加入后，培養(yǎng)基液面垂直距離隔板下表面0.8cm，在37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育5h，使培養(yǎng)瓶內(nèi)保持均衡。培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)時(shí)要水平回旋兩圈。然后用孔徑為250μπι的尼龍網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液，1200r/min離心1min，取頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入25cm3培養(yǎng)瓶中，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
[0027]4、取上述步驟3中離心的下層細(xì)胞，向其中加入紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打5min裂解紅細(xì)胞，1200r/min離心3min，棄上清。PBS稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為80μπι的尼龍網(wǎng)篩過濾，收集濾液，1000r/min離心5min，棄上清;加入完全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液后接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。接種后2h，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到3中的25cm3培養(yǎng)瓶中，置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0028]5、成熟的脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到中間隔板的底面，而骨骼肌細(xì)胞會下沉到瓶底生長，24h后實(shí)現(xiàn)了在同一培養(yǎng)瓶中獲得來自同一動物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
[0029]實(shí)施例2
[0030]如圖1、2所示，設(shè)置培養(yǎng)培養(yǎng)裝置，包含培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板
(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I) 一側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。
[0031 ]在細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中
[0032]實(shí)施例1中原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)2天后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代。
[0033]1、擰緊25cm3培養(yǎng)瓶瓶蓋，從培養(yǎng)箱中取出需要傳代的細(xì)胞，置于超凈臺內(nèi)，小心吸棄培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)瓶體積8 %的PBS緩沖液沖洗2次。
[0034]2、向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)瓶體積4%的濃度為0.25 %的胰酶消化液，靜置消化3min左右，待細(xì)胞呈花斑狀時(shí)，向其中加入與胰酶消化液等體積的完全培養(yǎng)液中止消化，并輕輕吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于EP管中，1200r/min離心3min，棄上清。
[0035]3、向步驟2中離心管內(nèi)加入培養(yǎng)瓶體積4 %的完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成均勻的細(xì)胞懸液，分別接種于兩個(gè)預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置孵育6h0
[0036]4、將步驟3中的培養(yǎng)瓶倒置，按步驟I和2繼續(xù)消化隔板層的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，同樣分別接種于新的預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6h即可見細(xì)胞貼壁，隨后每3d換液一次即可。培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)時(shí)要水平回旋兩圈。
[0037]實(shí)施例3
[0038]如圖1、2所示，設(shè)置培養(yǎng)裝置，包含培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。
[0039]在細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)過程中
[0040]1、取動物肌肉樣組織，除去可見的結(jié)締組織和血管，PBS緩沖液沖洗。
[0041 ] 2、超凈臺內(nèi)將組織剪成小塊，加入濃度為0.2 %的胰蛋白酶消化液消化5min，并用含12 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)等體積終止消化。
[0042]3、隨后選取體積為75cm3的培養(yǎng)瓶，預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基，加入后，培養(yǎng)基液面垂直距離隔板下表面0.5cm，在37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置孵育4h，使培養(yǎng)瓶內(nèi)保持均衡。培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)時(shí)要水平回旋兩圈。然后用孔徑為200μπι的尼龍網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液，1500r/min離心8min，取頂層懸浮成熟脂肪細(xì)胞液加入75cm3培養(yǎng)瓶中，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；
[0043]4、取上述步驟3中離心的下層細(xì)胞，向其中加入紅細(xì)胞裂解液洗滌，輕輕吹打Smin裂解紅細(xì)胞，1500r/min離心5min，棄上清。PBS稀釋洗滌下層細(xì)胞，再用孔徑為10ym的尼龍網(wǎng)篩過濾，收集濾液，1500r/min離心5min，棄上清;加入完全培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液后接種于培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。接種后3h，取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，吸出含肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到3中的75cm3培養(yǎng)瓶中，置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
[0044]5、成熟的脂肪細(xì)胞由于浮力小將漂浮貼壁到中間隔板的底面，而骨骼肌細(xì)胞會下沉到瓶底生長，24h后實(shí)現(xiàn)了在同一培養(yǎng)瓶中獲得來自同一動物同一組織的分層共培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞和肌內(nèi)脂肪細(xì)胞。
[0045]實(shí)施例4
[0046]如圖1、2所示，設(shè)置培養(yǎng)培養(yǎng)裝置，包含培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板
(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I) 一側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。
[0047]在細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中
[0048]實(shí)施例3中原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)3天后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行傳代。
[0049]1、擰緊75cm3培養(yǎng)瓶瓶蓋，從培養(yǎng)箱中取出需要傳代的細(xì)胞，置于超凈臺內(nèi)，小心吸棄培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)瓶體積4%的PBS緩沖液沖洗2次。
[0050]2、向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)瓶體積4%的胰酶消化液，靜置消化5min左右，待細(xì)胞呈花斑狀時(shí)，向其中加入與胰酶消化液等體積的完全培養(yǎng)液中止消化，并輕輕吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于EP管中，1000r/min離心5min，棄上清。
[0051 ] 3、向步驟2中離心管內(nèi)加入培養(yǎng)瓶體積4%的完全培養(yǎng)液，輕輕吹打成均勻的細(xì)胞懸液，分別接種于兩個(gè)預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置孵育6h0
[0052]4、將步驟3中的培養(yǎng)瓶倒置，按步驟I和2繼續(xù)消化隔板層的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞，同樣分別接種于新的預(yù)先灌入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6h即可見細(xì)胞貼壁，隨后每2d換液一次即可。培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱內(nèi)時(shí)要水平回旋兩圈。
[0053]以上所述僅是本實(shí)用新型的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實(shí)用新型原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，其特征在于，包括培養(yǎng)瓶(I)和設(shè)置在培養(yǎng)瓶(I)內(nèi)的隔板(2)，所述隔板(2)與所述培養(yǎng)瓶(I)側(cè)壁相接，所述隔板(2)平行于培養(yǎng)瓶瓶底(4)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，其特征在于，所述隔板與培養(yǎng)瓶除瓶口方向的三側(cè)側(cè)壁相接。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，其特征在于，所述隔板將培養(yǎng)瓶內(nèi)空間隔為上部的氣體交換空間和下部的細(xì)胞培養(yǎng)空間，所述細(xì)胞培養(yǎng)空間的體積與所述氣體交換空間的體積之比為4:1?1:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，其特征在于，所述培養(yǎng)瓶側(cè)壁設(shè)置有瓶口，所述瓶口與相接隔板的側(cè)壁相對設(shè)置，與瓶口臨近的隔板側(cè)邊緣低于所述瓶口的底邊緣(3)且，垂直距離為O?Icm05.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞分層共培養(yǎng)的裝置，其特征在于，所述隔板的水平長度為培養(yǎng)瓶水平長度的2/3?5/6，所述隔板的厚度為0.3?lcm。
【文檔編號】C12M1/24GK205528844SQ201620189898
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年3月11日
【發(fā)明人】屈長青, 姬云濤, 曹美霞, 劉佳, 童旭
【申請人】阜陽師范學(xué)院